Biochemia - kolokwium - część II

- Pytania, które na 100% trafią się w którejś z grup - tak stwierdził mgr A. Szczepanek

1. Czynniki wpływające na aktywność enzymów

2. Inhibicja

3. Dopasowanie substratowe (model klucza-zamka i indukowanego dopasowania)

- Do tego należy znać:

• Budowa hemoglobiny i mioglobiny

• Transport tlenu i dwutlenku węgla (warunki)

• Rola 2,3-bifosfoglicerynianu

• Efekt Bohra

• Układ enzymów i ich budowa

• Co to jest centrum aktywne?

• Czynniki wpływające na aktywność enzymów

• Dopasowanie substratowe

• Inhibicja (wszystkie)

• Kinetyka reakcji enzymatycznej

• Test Elisa

• Tłuszcze

• Klasyfikacja enzymów

- Poza tym opracowaniem polecałbym poczytać notatki z wykładów z dni: 15.01 i 21.01.

Mioglobina to pierwsze białko, którego strukturę przestrzenna, poznano dzięki wykorzystaniu rentgenografii. Jest to białko globularne, utworzone przez pojedynczy łańcuch polipeptydowy złożony ze 153 aminokwasów i fałdujący się w osiem a helis. Grupa prostetyczna w postaci hemu jest umiejscowiona w hydrofobowym zagłębieniu pofałdowanego łańcucha.

Hemoglobina ma strukturę czwartorzędową, ponieważ jest zbudowana z czterech łańcuchów polipeptydowych; dwóch łańcuchów α i dwóch łańcuchów ß (α₂ß₂), z których każdy zawiera grupę prostetyczną. Mimo niewielkiego podobieństwa struktury pierwszorzędowej, poszczególne łańcuchy polipeptydowe hemoglobiny wykazują strukturę przestrzenną niemal identyczną z łańcuchem polipeptydowym mioglobiny. Wyróżniamy też hemoglobinę płodową.

Warunki transportu tlenu i dwutlenku węgla

Tlen i dwutlenek węgla to gazy oddechowe, które muszą być wydajnie transportowane po całym organizmie. Oba gazy przenoszone są wraz z krwią, jednak w różny sposób.

Transport tlenu (O₂) przebiega na dwa sposoby. Około 3% tlenu, który dostaje się do krwi ulega fizycznemu rozpuszczeniu w osoczu. Pozostałe 97% tlenu przenoszone jest w erytrocytach. Obecna w nich hemoglobina łączy się z tlenem i powstaje tzw. oksyhemoglobina. Cząsteczka hemoglobiny jest tzw. tetramerem, czyli składa się z czterech połączonych ze sobą łańcuchów białkowych (dwa łańcuchy typu alfa i dwa typu beta). Każda z podjednostek posiada wbudowany związek organiczny - hem. Wewnątrz cząsteczki hemu znajduje się atom żelaza dwu wartościowego Fe²⁺, który ma możliwość przyłączania jednej cząsteczki tlenu. Połączenie to jest nietrwałe, dzięki czemu tlen może być uwalniany w tkankach organizmu.

Transport dwutlenku węgla (CO₂) przebiega na trzy sposoby. Około 10% dwutlenku węgla rozpuszcza się fizycznie w osoczu. Kolejne 20% dwutlenku węgla transportowane jest w połączeniu z białkami osocza i z białkową częścią hemoglobiny. Pozostała część dwutlenku węgla (ok. 70%) przenoszone jest w osoczu w formie jonów wodorowęglanowych HCO₃^-. Jony te tworzone są z CO₂ i H₂O m.in. w erytrocytach.

Rola 2,3-bifosfoglicerynianu - Ułatwia on uwalnianie się tlenu, obniża tym samym powinowactwo hemoglobiny do tego gazu i spełnia szczególnie ważną rolę w pierwszych momentach po przyjściu na świat noworodka.

Efekt Bohra - zjawisko występujące w fizjologii, polegające na zmniejszaniu powinowactwa hemoglobiny do tlenu w warunkach obniżonego pH (wzrost stężenia jonów wodorowych, H⁺). Powoduje to, że tlen jest łatwiej oddawany przez hemoglobinę (dysocjacja tlenu). Ułatwia to oddawanie tlenu w tkankach. Przeciwnie podwyższenie pH zwiększa powinowactwo wiązania tlenu przez hemoglobinę i utrudnia oddawanie go w tkankach.

Enzymy - są katalizatorami, które zwiększają szybkość reakcji chemicznej, same nie ulegając zmianie. W nieobecności enzymu reakcja może zachodzić niezwykle wolno, natomiast w jego obecności szybkość reakcji znacznie wzrasta, nawet do 10⁷ razy. Reakcje katalizowane przez enzymy zazwyczaj przebiegają we względnie łagodnych warunkach (temperatura poniżej 100^oC, ciśnienie atmosferyczne i obojętne pH) - w porównaniu z warunkami odpowiednich niekatalizowanych reakcji chemicznych. Enzymy są wysoce specyficzne względem substratów, na które działają, i produktów, które tworzą. Poza tym aktywność enzymatyczna może być regulowana, zmieniając się w zależności od stężenia substratów lub innych cząsteczek. Prawie wszystkie enzymy są białkami, chociaż zidentyfikowano też kilka rodzajów cząsteczek RNA aktywnych katalitycznie.

Podział enzymów

- katalizatory biologiczne

- enzymy jako białko proste (enzymy proteolityczne, amylaza, ureaza, aldolaza)

- enzymy jako białko złożone

- enzymy należące do białek złożonych zawierające ni aminokwasowe grupy luźno związane z cząsteczką białkową (koenzymy)

Centrum aktywne enzymu jest regionem, który wiąże substrat i przemienia go w produkt. Zazwyczaj jest to względnie niewielka część całej cząsteczki enzymu i stanowi określoną trójwymiarową przestrzeń, utworzoną przez reszty aminokwasów, które w liniowym łańcuchu polipeptydowym mogą leżeć daleko od siebie. Centrum aktywne jest często szczeliną lub zagłębieniem w cząsteczce enzymu, które tworzy środowisko w znacznym stopniu niepolarne, co ułatwia wiązanie substratu. Substrat jest wiązany w miejscu aktywnym przez liczne słabe siły, a w pewnych przypadkach przez odwracalne wiązania kowalencyjne. Po związaniu cząsteczki substratu i utworzeniu kompleksu enzym-substrat, katalitycznie czynne reszty w obrębie aktywnego miejsca enzymu działają na cząsteczkę substratu tak, aby przekształcić go początkowo w stan przejściowy, a następnie w produkt, który zostaje uwolniony do roztworu. Potem enzym, już wolny, może związać kolejną cząsteczkę substratu i rozpocząć nowy cykl katalityczny.

Czynniki wpływające na aktywność enzymów - zmiana stężenia substratów; temperatura; wpływ pH; sprzężenie zwrotne; potencjał oksydoredukcyjny; kofaktory działające z białkiem enzymatycznym; zmogeny; aktywacja i inhibicja allosteryczna.

Dopasowanie substratowe - Model klucza-zamka - kształt substratu i aktywnego miejsca enzymu miałyby pasować do siebie jak klucz do zamka. Oba kształty są uważane za sztywne i utrwalone oraz pasujące do siebie idealnie po odpowiednim zestawieniu.

Dopasowanie substratowe - Model indukowanego dopasowania - wiązanie substratu indukuje zmianę konformacyjną w aktywnym miejscu enzymu. Poza tym enzym może zniekształcić substrat wymuszając w nim konformację podobną do stanu przejściowego. Na przykład, związanie glukozy z heksokinazą indukuje taką konformacyjną zmianę w strukturze enzymu, że jego centrum aktywne przyjmuje kształt komplementarny do substratu (glukozy) tylko po jego związaniu z enzymem.

Inhibicja enzymów

Katalityczna szybkość enzymu może być zmniejszona przez cząsteczki inhibitora. Istnieje wiele inhibitorów, w tym metabolitów obecnych normalnie w organizmie, oraz leków i toksyn, obcych dla
organizmu. Rozróżnia się dwa typy inhibicji (hamowania) enzymów: nieodwracalną i odwracalną. Inhibicję odwracalną można dalej podzielić na kompetycyjną i niekompetycyjną.

Inhibicja nieodwracalna

Inhibitor nieodwracalny wiąże się ściśle, często kowalencyjnie, z resztami aminokwasów w miejscu aktywnym enzymu, trwale inaktywując enzym. Przykładami nieodwracalnych inhibitorów są diizopropylofluorofosforan (DIPF), amid kwasu jodooctowego oraz penicylina.

Inhibicja odwracalna

Inhibitor niekompetycyjny wiąże się w enzymie z miejscami innymi niż centrum aktywne i zmniejsza szybkość katalityczną enzymu, powodując konformacyjną zmianę w jego kształcie przestrzennym.
Wpływu inhibitora niekompetycyjnego nic można przezwyciężyć przez duże stężenia substratu. Wykres Lineweavera-Burka ukazuje, że inhibitor niekompetycyjny zmniejsza V_max, ale nie zmienia
wartości K_m.

Test Elisa - pewna ilość antygenu unieruchomiona jest na powierzchni fazy stałej. Wykonanie testu polega na wprowadzeniu materiału biologicznego zawierającego przeciwciała specyficzne dla unieruchomionego antygenu. Przeciwciała te powinny być uprzednio połączone wiązaniem kowalencyjnym z enzymem. Unieruchomiony antygen i specyficzne przeciwciało tworzą kompleks immunologiczny, dzięki któremu przeciwciało zostaje trwale związane z podłożem. Po przepłukaniu środowiska reakcji i dodaniu odpowiedniego substratu, enzym związany ze specyficznym przeciwciałem katalizuje reakcję, której produkt (najczęściej barwny) można oznaczyć spektrofotometrycznie.

Kwasy tłuszczowe - kwasy monokarboksylowe o wzorze ogólnym R-COOH (R oznacza łańcuch węglowodorowy, a COOH jest grupą karboksylową znajdującą się na końcu tego łańcucha). Kwasy tłuszczowe występujące naturalnie wchodzą w skład tłuszczów lub występują w postaci "wolnej". Połączenie 3 cząsteczek kwasów tłuszczowych z cząsteczką glicerolu tworzy triglicerydy.

Łańcuch węglowodorowy naturalnych kwasów tłuszczowych jest zazwyczaj prosty (nierozgałęziony) i może zawierać kilka wiązań podwójnych (o konfiguracji Z). Naturalne kwasy tłuszczowe zbudowane są z parzystej liczby atomów węgla, a ich liczba wynosi najczęściej 12-20.

Nasycone kwasy tłuszczowe to kwasy tłuszczowe nie zawierające podwójnych wiązań w cząsteczce. W warunkach normalnych są zwykle białymi ciałami stałymi. Kwasy zawierające w łańcuchu więcej niż 10 atomów węgla są nierozpuszczalne w wodzie i są nielotne.

Nienasycone kwasy tłuszczowe są to kwasy tłuszczowe zawierające wiązania podwójne. Są one z reguły bezbarwnymi cieczami. Wśród nienasyconych kwasów tłuszczowych wyróżnia się grupę wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, które, jak sama nazwa wskazuje, zawierają więcej niż jedno wiązanie podwójne. Są one niezbędnym elementem diety człowieka, gdyż są nam potrzebne do tworzenia ważnych związków, a nie są syntezowane przez nasze organizmy.

Szybkość działania enzymów

Aktywność enzymu wyraża się zwykle jako początkową szybkość (V₀) katalizowanej reakcji. Jednostką V₀ jest jednostka enzymatyczna (U) lub katal (Kat). Określenie aktywność (lub aktywność całkowita) odnosi się do całkowitej ilości jednostek enzymu w próbce, natomiast określenie aktywność specyficzna jest liczbą jednostek przypadającą na miligram białka. Przy małych stężeniach substratu ([S]) podwojenie [S] prowadzi do podwojenia wartości V₀, natomiast przy większych [S] enzym ulega wysyceniu, a jego V₀ już dalej nie wzrasta. Wykres V₀ jako funkcji |S| daje krzywą hiperboliczną. Natomiast ddy [S] ma wartość wysycającą, podwojenie stężenia enzymu powoduje podwojenie wartości V₀.

Klasyfikacja Enzymów

• Klasa I - oksydoreduktazy

• Klasa 2 - transferazy

• Klasa 3 - hydrolazy

• Klasa 4 - liazy

• Klasa 5 - izomerazy

• Klasa 6 - ligazy

---