9. Denaturacja DNA

- efekt hiperchromowy - dwupasmowa struktura DNA w roztworze może być stopiona przez podwyższenie temperatury lub zmniejszenie stężenia soli. W tym procesie nie tylko dwa pasma odrywają się od siebie, lecz także same zasady zmieniają płaszczyznę wzajemnego położenia, podczas gdy są one stale jeszcze związane jako polimer, szkieletem wiązań fosfodiestowych. Takiej denaturacji towarzyszy zwiększenie optycznej wartości absorpcji zasad purynowych i pirymidynowych. Dwupasmowa cząsteczka DNA, dzięki efektowi typu „stacking” - oddziaływani między sąsiednimi parami zasad - i dzięki wiązaniom wodorowym miedzy zasadami, tworzy sztywne twory pałeczkowate; w roztworze ma duża lepkość , która zmniejsza się po denaturacji.

- temperatura topnienia - podczas denaturacji DNA pasma danej cząsteczki oddzielają się od siebie w pewnym przedziale temperatury. Punkt środkowy przejścia temperatury nazywa się temperaturą topnienia, czyli T_m. wartość Tm zależy od składu zasad DNA i od stężenia soli w roztworze. DNA o dużej liczbie par G-C, które mają trzy wiązania wodorowe, topią się w wyższej temperaturze niż DNA o dużej liczbie par A-T., które maj dwa wiązania wodorowe. Dziesięciokrotne zwiększenie stężenia jednowartościowych kationów powoduje zwiększenia wartości T_m o 16,6^oC. Formamid destabilizuje wiązania wodorowe między zasadami i przez to zmniejsza wartość T_m. Pozwala to na oddzielanie pasm DNA albo hybrydów DNA-RNA w znacznie niższej temp. i minimalizuje pęknięci pasm, które zachodzą w wysokich temp.

10. Enzymy nukleolityczne

- endonukleazy restrykcyjne - Endonukleazy restrykcyjne są rodziną bakteryjnych białek enzymatycznych, które potrafią ciąć DNA tylko w miejscach o ściśle ustalonej sekwencji nukleotydowej. To ograniczenie liczby miejsc, w których DNA ulega rozcięciu, ma swój głęboki sens biologiczny. Enzymy restrykcyjne powstały w drodze ewolucji jako forma obrony bakterii przed obcym DNA. Genom bakterii albo nie zawiera miejsc rozpoznawanych przez produkowane przez nie enzymy restrykcyjne, albo chroni je przed cięciem, na przykład dzięki metylacji nukleotydów. W technikach molekularnych z miejsc restrykcyjnych korzysta się w celu precyzyjnego odcięcia interesującego fragmentu DNA, by na przykład można go było połączyć z inną cząsteczką poprzez enzymatyczną reakcję ligacji. Miejsca restrykcyjne noszą nazwy identyczne jak enzymy, które je rozpoznają. Nazwy enzymów pochodzą od gatunków bakterii je produkujących.

Enzymy restrykcyjne rozcinają DNA na krótkie kawałki w miejscach swoistych sekwencji, w odróżnieniu od do większości metod enzymatycznych, chemicznych lub fizycznych. Te enzymy obronne chronią DNA bakterii gospodarza przed DNA obcych organizmów. Enzymy te występują jednak w tych komórkach, które maja towarzyszący enzym zdolny do metylowania DNA gospodarza w substrat nieodpowiednio trawienia enzymem restrykcyjnym. Swoiste dla określonych miejsc DNA metylazy i enzymy restrykcyjne występują zawsze w bakteriach jako pary. Każdy enzym restrykcyjny rozpoznaje i przecina sekwencję o dł. 4-7 par zasad w dwupasmowym DNA. Takie przecięcia dają w wyniku tępe końce lub końce nakładające się czyli lepkie, zależne od mechanizmu jakim posługuje się enzym. Końce lepkie są szczególnie użyteczne do konstrukcji hybrydowych, czyli chimerycznych cząsteczek DNA. Jeśli w obrębie danej cząsteczki DNA nukleotydy są rozmieszczone przypadkowo, można wyliczyć jak często dany enzym będzie przecinał cząsteczkę DNA. Dla każdego miejsca w cząsteczce DNA SA 4 możliwości (A,C,G,T) zatem enzym restrykcyjny, który rozpoznaje sekwencję o dł. 4 par zasad, będzie przecinał DNA średnio co każde 256 pz (4⁴), inny który rozpoznaje sekwencję o 6 pz będzie przecinał raz co 4096 pz (4⁶). Dany fragment DNA będzie miał charakterystyczne linijne ułożenie miejsc cięcia dla różnych enzymów, co pozwala na konstrukcje map restrykcyjnych.

11. Techniki stosowane we współczesnej genetyce molekularnej i inżynierii genetycznej

1. metody rozdziału i charakterystyki DNA

- wirowanie w gradiencie stężeń

- metody chromatograficzne

- techniki elektroforetyczne - metodą elektroforezy żelowej można z łatwościa wykryć nawet niewielkie róznice miedzy dwiema spokrewnionymi cząsteczkami DNA.ruchliwośc elektroforetyczna Fragetów DNA w róznych typach żelu jest do pewnych granic odwrotnie proporcjonalna do logarytmu wielkości tych fragmentów zawierających ok. 1000 pz używa się żelów poliakryloamidowych, natomiast bardziej porowatych żelów używa się do rozdzielania większych fragmentów. Bardzo ważna cecha metody jest jej duża zdolność rozdzielcza. W odpowiednich żelach można rozdzielać fragmenty różniące się jednym nukleotydem na kilkaset wchodzących w ich skład.

2. amplifikacja DNA - proces olbrzymiego zwiększenia ilości DNA. DNA jest amplifikowane in vitro przez PCR albo in vivo przeniesione przez wektory do organizmów gospodarzy.

Polimerazowa reakcja łańcuchowa (PCR) jest metodą służącą do amplifikacji określonych sekwencji DNA. Swoistość tej reakcji jest oparta na użyciu dwóch primerów oligonukleotydowych, które hybrydyzują do komplementarnych sekwencji położonych na przeciwległych pasmach DNA i flankujących interesującą nas sekwencję docelową. Próbka DNA jest najpierw podgrzewana, aby rozdzielić dwa pasma, następnie sekwencje primerów łączą się z DNA i każde z pasm jest kopiowane przez polimerazę DNA, począwszy od miejsca primera. Każde z dwóch pasm DNA służy jako matryca do syntezy nowego DNA, począwszy od dwóch primerów. Powtarzane cykle denaturacji cieplnej do ich sekwencji komplementarnych i wydłużenie sekwencji primerów przez polimerazę DNA dają ostatecznie eksponencjalną amplifikację sekwencję DNA o określonej długości.

3. sekwencjonowanie DNA

Do oznaczania sekwencji DNA są dostępne techniki ręczne i automatyczne.

Enzymatyczna metoda (metoda Sangera) sekwencjonowania DNA wykorzystuje swoiste dideoksynukleotydy, które kończą syntezę pasma DNA w miejscu swoistego nukleotydu w trakcie syntezy pasma na oczyszczonej matrycy kwasu nukleinowego. Reakcje te SA tak dobrane, że uzyskuje się populacje fragmentów DNA prezentujących zatrzymanie syntezy na każdym nukleotydzie. Wprowadzając radioaktywny znacznik w miejsce naprzeciw miejsca terminacji można uzyskać oddzielne fragmenty, które są segregowane pod względem wielkości z pomocą elektroforezy na żelu poliakryloamidowym. Po sporządzeniu autoradiogramu każdy z fragmentów da pasmo na kliszy rentgenowskiej. Pasma te czytane po kolei, dają sekwencję DNA.

Metoda Maxama i Gilberta wykorzystuje metody chemicznego przecinania DNA w miejscu swoistych nukleotydów. Zwykle stosuje się metody, w których są używane cztery różne znaczniki fluorescencyjne, reprezentujące kolejne nukleotydy. Emitują one specyficzne promieniowanie po pobudzeniu promieni lasera, można je analizować za pomocą komputera.

4. klonowanie

Klon jest to duża populacja cząsteczek, bakterii i komórek, które pochodzą od wspólnego przodka. Klonowanie pozwala na wyprodukowanie dużej ilości identycznych cząsteczek DNA, które następnie mogą być scharakteryzowane lub mogą posłużyć do innych celów. Technika ta jest oparta na fakcie, że chimeryczne, czyli hybrydowe, cząsteczki DNA mogą posłużyć do konstrukcji wektorów klonujących, którymi są zwykle plazmidy bakteryjne, fagi albo kosmity. Konstrukcje takie podlegają replikacji w komórce gospodarza pod kontrolą swoich systemów. W ten sposób chimeryczny DNA jest namnażany (amplifikowany).

Bakteryjne plazmidy są małe, koliste cząsteczki dwupasmowego DNA, których naturalna funkcją jest nadawanie komórce gospodarza oporności na antybiotyki. Istnieją one jako pojedyncze lub liczne kopie w Obrębie bakterii i replikują niezależne od bakteryjnego DNA. Znane SA kompletne sekwencje DNA licznych plazmidów, dzięki temu dostępne są precyzyjne miejsca przecięć enzymami restrykcyjnymi dla inercji obcego DNA. Plazmidy SA mniejsze niż chromosom gospodarza, można je wiec łatwo uzyskać przecięcie plazmidu enzymem swoistym dla miejsca restrykcyjnego, w które włączono oryginalny odcinek DNA.

Fagi zawierają cząsteczki linijnego DNA, do których może być włączony obcy DNA w licznych miejscach restrykcyjnych. Chimeryczny DNA otrzymuje się p przejściu faga przez jego cykl lityczny i po uzyskaniu dojrzałych zakaźnych cząsteczek fagowych. Wyższość wektorów fagowych nad plazmidami polega na tym, że plazmidy przyjmują fragmenty DNA o dł. 6 - 10 kz, a fagi 10 - 20 kz.

Kosmidy mają kombinacje najlepszych cech plazmidów i fagów. Kosmidy SA to plazmidy, które maja sekwencje DNA, tzn. miejsca cos, niezbędne do upakowania λDNA do cząsteczki faga.

12. Zastosowanie technik inżynierii genetycznej w diagnostyce i terapii chorób uwarunkowanych genetycznie.

1. naturalna zmienność genowa - w warunkach naturalnych zachodzi normalna zmienność w sekwencji DNA, czyli polimorfizm, z częstością 1 na każdych 500 nukleotydów (ok. 10⁷ razy na genom). Zmienność polegająca na inercjach i delecjach DNA oraz podstawieniach pojedynczych zasad, u zdrowych ludzi zachodzi w niekodujących regionach DNA, w miejscach które nie wywołują zmian w funkcji kodowanego białaka

2. zmienność genowa powodująca chorobę - genetyka klasyczna uczy, że większość chorób jest spowodowana mutacjami punktowymi w wyniku czego dochodzi do syntezy uszkodzonych białek. Nadal tak jest, ale należy zaznaczyć, że choroba genetyczna może być także wynikiem dezorganizacji jakiegokolwiek etapu przemian DNA lub RNA.

3. mutacje punktowe - klasycznym przykładem choroby jest niedokrwistość sierpowata, która jest spowodowana mutacja pojedynczej zasady w całym genomie składającym się z 3x10⁹ pz; jest to substytucja T przez A w DNA, która następnie powoduje zmianę A na U w mRNA odpowiadającą za 6 kodonowi w genie β-globiny. Zmieniony kodon określa inny aminokwas co powoduje nieprawidłowości strukturalne cząsteczki β-globiny. Inne mutacje punktowe w obrębie genu β-globiny i jego otoczeniu powodują zmniejszenie lub zatrzymanie wytwarzania β-globiny, w wyniku tych mutacji powstaje β-talesemia. Talesemie charakteryzują się wadami w syntezie podjednostek hemoglobiny, a β-talesemia powstaje wówczas gdy jest niedostateczne wytwarzanie β-globiny. Mutacje punktowe są zwykle określane na drodze sekwencjonowania danego genu, choć przypadkowo, gdy mutacja niszczy albo stwarza nowe miejsce restrykcyjne, technika analizy fragmentów restrykcyjnych może być użyta do wskazania uszkodzenia

4. Delecje, insercje i rearanżacje DNA - badania bakterii, wirusów, drożdży i muszki owocowej wykazują, że fragmenty DNA mogą w obrębie genomu przemieszczać się z jednego miejsca na drugie. Delecje, insercje, rearanżacje mogą wywoływać takie zmiany w ekspresji genu, które powadzą do choroby. Delecje w zespole genów α-globiny, umiejscowionym na chromosomie 16, powodują powstanie α-talesemii. Delecje lub insercje DNA większe niż 50pz, często SA wykrywane techniką „blotting” według Southerna.

5. analiza rodowodu - podstawienie T przez A w pasmie matrycowym β-globiny zmienia sekwencje w regionie , który odpowiada 6 kodonowi z sekwencją i niszczy miejsce rozpoznania enzymu restrykcyjnego. Inne miejsca umiejscowione w kierunku 5' i 3' od zmienionego miejsca rozpoznania nie są objęte mutacją, a zatem będą przecięte. W wyniku tego inkubacja z enzymem restrykcyjnym DNA od osobników normalnych (AA), heterozygot (AS) i homozygot (SS) da trzy różne wzory prążków uzyskanych metodą Southerna. Przykład ten ilustruje, jak można ustalić rodowód DNA. Analiza rodowodu jest stosowana w odniesieniu do licznych chorób genetycznych i jest najbardziej użyteczna w przypadku chorób spowodowanych inercjami i delecjami lub rzadziej w przypadku zmian w miejscu restrykcyjnym.

6. Diagnostyka prenatalna - jest możliwa w przypadku, gdy jest znana wada genetyczna i gdy jest dostępna swoista sonda molekularna. DNA uzyskany z niewielkiej ilości płynu owodniowego może być użyty do analizy metodą Southerna. Płód mający wzór restrykcyjny AA nie jest chory na niedokrwistość sierpowatą, ani nie jest nosicielem, mający wzór SS będzie chory na niedokrwistość sierpowatą.

7. Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) - wrodzone różnice fragmentu restrykcyjnego są znane jako polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych, czyli RFLP. RFLP powstałe w wyniku zmian w pojedynczej zasadzie albo w wyniku delecji lub insercji DNA w obrębie fragmentu restrykcyjnego są użytecznym narzędziem diagnostycznym. Polimorfizm taki znaleziono w znanych genetycznych loci, a także w Erebie sekwencji, których funkcja nie jest znana. Tak wiec polimorfizm RFLP może prowadzić do zniszczenia funkcji genu, lub też nie mieć żadnych konsekwencji biologicznych. Polimorfizmy te są dziedziczne i segregują się wg wzoru Mendla. RFLP jest używany głównie w celu określania chorób dziedzicznych, w których nie znamy ubytku funkcji w celu określania chorób dziedzicznych. RFLP może być użyty do ustalenia grup sprzężeń, które następnie w procesie zwanym krocznie po chromosomie, mogą ewentualnie określić locus związany z chorobą. W metodzie krocznie po chromosomie fragment przedstawiający jeden z końców długiego odcinka DNA jest użyty do izolowania innego fragmentu, który pokrywa się z pierwszym, ale wychodzi poza jego obręb. Kierunek ten jest określany poprzez mapowanie restrykcyjne i proces ten jest powtarzany stopniowo aż uzyska się sekwencje stanowiącą przedmiot zainteresowania.

8. Polimorfizm mikrosatelitarnych DNA - w ludzkim genomie występują dziedziczne, krótkie tandemowe, powtarzające się sekwencje występujące w liczbie 50000-100000. Ponieważ występują one częściej, mogą zstąpić RFLP jako maker określonego locus w różnych analizach genomowych.

9. RFLP i VNTR w medycynie sądowej - zmienne liczba jednostek sekwencji powtarzanych tandemowych jest powszechnym typem insercji które powodują wystąpienie RFLP. Sekwencje VNTR są dziedziczone i w tym przypadku są one użyteczne dla ustalenia sprzężenia z chorobą w dane rodzinie lub grupie spokrewnionych rodzin, mogą służyc także do molekularnej identyfikacji danego osobnika.

10. Terapia genowa - choroby wywołane niedoborem produktu genowego mogą być odpowiednie do leczenia zastępczego. Strategia takiego leczenia polega na sklonowaniu genu w wektorze, który może być pobrany przez komórkę gospodarza i włączony do genomu. Komórki prekursorowi szpiku kostnego są przydatne do tego celu, ponieważ komórki takie mogą zasiedlić szpik i tam się namnażać. Wprowadzony gen może zacząć kierować ekspresją swego białkowego produktu i w ten sposób naprawiać ubytk w komórce gospodarza.

11. Zwierzęta transgeniczne - zastąpienie genu w komórce somatycznej oczywiście nie może być przekazane potomstwu. Do zapłodnionych jaj myszy z genetycznym hipogonadyzmem, wstrzykiwano DNA zawierający kodującą sekwencję prekursora białkowego hormonu uwalniającego gonadotropinę (GnRH). Gen ten ulegał ekspresji i podlegał prawidłowej regulacji w podwzgórzu pewnej liczby myszy, a zwierzęta ta były pod wszystkimi względami prawidłowe. Ich potomstwo nie wykazywało niedoboru GnHR. Jest to zatem dowód na somatyczną ekspresję transgenu i na jego egzystencję w komórkach rozrodczych.

---