TWÓJ BIOTECHNOLOG
Aktywność enzymatyczna
Zadanie 1
Materiały:
Wyciąg z ziemniaków, 0,1 M bufor fosforanowy (pH=7,4), 0.3% r-r pirokatechiny
Wykonanie:
Do 4 probówek dodałem po 3 ml wyciągu z ziemniaka. Probówkę 3 umieściłem na 5 minut we wrzącej łaźni wodnej, a następnie ochłodziłem do temperatury pokojowej. Następnie do wszystkich probówek dodałem podane w poniższej tabeli ilości buforu
fosforanowego i roztworu pirokatechiny lub wody.
Numer próby |
Wyciąg z ziemniaka ( ml) |
Woda (ml) |
Bufor fosforanowy (ml) |
Pirokatechina (ml) |
Wynik |
1 |
3 |
0 |
0,5 |
1 |
Ciemno ceglasty |
2 |
3 |
1 |
0,5 |
0 |
Biały |
3 |
3 |
0 |
0,5 |
1 |
Szary |
4 |
3 |
0 |
0,5 |
1 |
ceglasty |
- Pirokatechina i tlen są substratami reakcji. Źródłem
enzymu - oksydazy polifenolowej jest wyciąg z ziemniaka.
- W probówce nr 2 nie zaobserwowano objawów reakcji, gdyż nie było w niej substratu - pirokatechiny, była to próba kontrolna.
-Próbka nr 1 dała pozytywny wynik próby, gdyż jej zawartość zabarwiła się na kolor ciemno ceglasty ciemniejszy niż w probówce nr 4. Probówka nr 1 była co jakiś czas wstrząsana, przez co enzym miał lepszy dostęp do tlenu, niż enzym w probówce nr 4, reakcja biegła szybciej niż w probówce nr 4, dlatego jej zawartość zabarwiła się na kolor intensywniejszy.
-W probówce nr 3 enzym uległ denaturacji, przez umieszczenie go w łaźni wodnej, dlatego stracił swoje właściwości katalityczne i wynik próby był negatywny. Celem przeprowadzenia próby w probówce nr 3 było sprawdzenie, czy substraty nie reagują same, bez udziału enzymu.
Zadanie 2
Proba benzydynowa
Materiały:
Wyciąg z ziemniaków, odczynnik benzydynowy
Wykonanie :
Do dwóch probówek dodałem wyciągu z ziemniaka. Probówkę nr 2 wstawiłem do wrzącej łaźni wodnej na kilka minut, a potem ostudziłem. Następnie szybko dodałem kilka
kropel świeżo przygotowanego roztworu benzydynowego do obu próbówek.
Obserwacje: :
Próbówka 1) zabarwianie niebieskie, pozytywny wynik próby.
Próbówka 2) zabarwienie jasno brązowe, negatywny wynik próby.
Wnioski:
Próbówka nr 1 dała wynik próby dodatni ponieważ obecny w niej enzym był aktywny, w próbówce nr 2 zaszła denaturacja enzymu.
Zadanie 3.
Materiały:
β-amylaza z nasion zbożowych, płyn Lugola, 0,5% r-r skrobi, odczynnik Benedicta
Wykonanie:
Wziołem 6 ponumerowanych probówek, do każdej dodałęm 1 ml roztworu skrobi 0,7 ml wody, a także do próbówki nr 1 zagotowanego i oziębionego roztworu z nasion. Do próbówek 2-6 ) roztwór z nasion.
Probówki nr 2 nie inkubowałem, natomiast probówki od 1-6 (bez 2) miały swój czas inkubacji przedstawiony w tabeli poniżej :
Numer próby |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
Czas inkubacji (min) |
30 |
0 |
5 |
10 |
20 |
30 |
Po zainkubowaniu każdej probówki w temperaturze 37C wstawiłem wszystkie probówki nr 2 (od razu po dodaniu wyciągu z nasion) do wrzącej łaźni wodnej, zagotowałem, ostudziłem, a następnie podzieliłem roztwory na 2 równe części i dla każdej probówki
wykonałem próbę Benedicta oraz Lugola.
Nr próbówki |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
Wynik próby Benedicta |
Dodatni pojawia się osad żółto- cielony |
Dodatni pojawia się osad żółto- cielony |
Negatywny, roztwór niebieski |
Dodatni pojawia się osad żółto- cielony |
Dodatni pojawia się osad żółto- cielony |
Dodatni pojawia się osad żółto- cielony |
Nr Próbówki |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
Wynik próby Lugola |
Dodatni, roztwór jasnogranatowy |
Dodatni, r-r mocno granatowy |
Dodatni, r-r mocno granatowy |
Negatywny, roztwór się nie zabarwił |
Negatywny, roztwór się nie zabarwił |
Negatywny, roztwór się nie zabarwił |
Próba Benedicta dała pozytywny wynik w wszystkich próbówkach poza próbówką nr 3. Próba Lugola dał wynik pozytywny w próbówkach 1, 2, 3.
Wnioski:
Prawdopodobnie została zamieniona próbówka 1 z 3 ponieważ w próbówce 1 enzym został zniszczony i próba Benedicta powinna dąć wynik ujemny a w próbówce 3 wynik dodatni.
Próba Lugola dała pozytywny wynik w próbówkach 1, 2, 3, i w próbówce 1 barwa była mniej zauważalna. Substratami reakcji są skrobia i enzym. Próba Benedicta jest przeprowadzana w celu wykrycia cukru redukującego jakim jest glukoza powstałą z rozkładu skrobi. Wynik próby powinien dać kolor najbardziej intensywny w próbówce nr 6 i coraz mniej intensywny przechodząc do próbówki 3. w próbówkach nr 1 i 2 wynik powinien być negatywny.
Błędny wynik były w próbówce 2.
Próba Lugola powinna dac pozytywny wynik w próbówkach 1 i 2 ( bardziej intensywny kolor granatowy) i w próbkach 3 i 4 mniej intensywny.
Próbówka 1 jest próbą kontrolną.
Zadanie 4. Inwertaza z drożdży
Materiały:
R-r inwertazy, bufor octanowy (pH=4.4), r-r skrobi, r-r sacharozy, odczynnik Benedicta
Wykonanie:
Do 4 probówek dodałem podane w poniższej tabeli ilości enzymu, wody, buforu, octanowego, roztworu skrobi i roztworu sacharozy.
Nr próby |
Enzym |
Woda |
Bufor |
Skrobia |
Sacharoza |
Próba Benedicta |
1 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
Niebieski |
2 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
Niebieski |
3 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
Czerwony osad |
4 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
Niebieski |
W próbówce 4 r-r enzymu zagotowałem przed dodaniem pozostałych składników. Próby inkubowałem przez 30min, po tym czasie zawartość próbówek zobojętniłem r-rem węglanu sodu ( wobec papierka lakmusowego ) i wykonałem próbę Benedicta, wyniki:
Inwertaza katalizowała reakcję hydrolizy sacharozy.
Użycie buforu octanowego miało na celu zapewnienie optymalnego (kwaśnego) pH dla enzymu. Odczynnik Benedicta miał wykazać obecność cukrów redukujących w mieszaninie. W probówce 1 przeprowadzono próbę kontrolną z wodą bez udziału substratu (cukru). Wykazała ona negatywny wynik próby Benedicta.
W probówce 2 wynik próby był negatywny, bo inwertaza wykazuje cechę charakterystyczną dla enzymów - specyficzność dla danej reakcji. Oznacza to, że dany enzym katalizuje tylko jeden rodzaj reakcji, w tym przypadku jest to reakcja hydrolizy sacharozy.
Dlatego skrobia - mimo tego, że składa się z monomerów glukozy (cukru redukującego), to nie wykaże pozytywnego wyniku próby Benedicta, bo nie ulegnie hydrolizie. Zawartość probówki 3 wykazała wynik pozytywny, ponieważ sacharoza pod wpływem inwertazy uległa hydrolizie na glukozę i fruktozę - cukry redukujące, w wyniku czego wodorotlenek miedzi (II) został zredukowany do tlenku miedzi (I), który ma postać ceglastoczerwonego osad. Zagotowanie enzymu w probówce 4 spowodowało jego denaturację, przez co nie doszło do
hydrolizy sacharozy. Sacharoza jest cukrem nieredukującym, dlatego wykazała negatywny wynik próby Benedicta.
Zadanie 5.
Enzymatyczna hydroliza skrobi przez alfa-amylazę śliny
Materiały:
1% roztwór skrobi, odczynnik Benedicta, ślina, płyn Lugola.
Wykonanie:
Do dwóch probówek nr 1 i nr 2 dodałem około 1 ml śliny oraz 3 ml roztworu skrobi.
Probówki wymieszałem, a po 10 min wykonałem próbę Lugola (1) oraz próbę Benedicta (2)
Do dwóch probówek nr 3 i nr 4 dodałem około 1 ml śliny którą zagotowałem, po ochłodzeniu wykonałem obie próby analogicznie.
Obserwacje:
W probówce nr 1 roztwór bezbarwny L
W probówce nr 2 fioletowe kłaczki B
W próbówce nr 3 fioletowe kłaczki L
W probówce nr 4 fioletowe kłaczki B
A powinno wyjść:
1) W probówce brak objawów reakcji. L
2) W probówce wytrącił się ceglastoczerwony osad. B
3) W probówce roztwór zabarwił się na granatowo. L
4) W próbówce po podgrzaniu brak objawów reakcji - niebieski kolor. B
Wnioski:
Probówka nr 1 wykazała negatywny wynik próby Lugola - probówka po 10 minutach nie zawierała już skrobi a glukozę, która nie odbarwia płynu.
Probówka nr 2 wykazała pozytywny wynik próby Benedicta, ponieważ amylaza ślinowa spowodowała hydrolizę skrobi do glukozy - cukru redukującego.
Po podgrzaniu zawartości probówek nr 3 i nr 4 enzym uległ denaturacji. W probówkach nadal obecna była skrobia, która nie wykazuje właściwości redukujących.
Probówka nr 3 wykazała pozytywny wynik próby Lugola.
Probówka nr 4 wykazała negatywny wynik próby Benedicta.