2. MIKROSKOPY ELEKTRONOWE

W mikroskopach elektronowych do tworzenia obrazu powiększonego służy strumień elektronów wytwarzany w warunkach wysokiej próżni. Uzyskiwane powiększenia mieszczą się w zakresie od 1000 do 500 000 *.

2.1. Zasady optyki elektronowej

Zgodnie z falową teorią materii, strumień elektronów posiada jednocześnie charakter korpuskularny (cząsteczkowy) i falowy. Ta ostatnia własność pozwala na zastosowanie do wiązki elektronów wszystkich podstawowych praw fizycznych obowiązujących w optyce dla wiązki świetlnej. Długość fali elektronowej wyraża wzór:

h v²

λ = ----- √1 - -- , gdzie

m₀v c²

h = stała Plancka,

m₀ = masa spoczynkowa elektronu,

v = prędkość elektronu, wprost proporcjonalna do napięcia przyspieszającego (E),

c = prędkość światła.

Z uwagi na fakt, iż h, m₀ i c są wartościami stałymi, długość fali elektronowej zależy wyłącznie od prędkości elektronu, warunkowanej przez napięcie przyspieszające. Przykładowo, dla E = 60 kV, długość fali elektronowej wynosi 0,005 nm, a dla E = 100 kV spada do 0,0037 nm. Podstawiając te wartości do wzoru na zdolność rozdzielczą układu optycznego, otrzymujemy teoretyczną zdolność rozdzielczą mikroskopu elektronowego wynoszącą ok. 0,002 nm, co jest wartością mniejszą od średnicy atomu wodoru! W rzeczywistości okazuje się, że apertura numeryczna obiektywów używanych w mikroskopach elektronowych wielokrotnie ustępuje analogicznemu parametrowi mikroskopów świetlnych i faktyczna zdolność rozdzielcza współczesnych mikroskopów elektronowych mieści się w granicach od 0,1 do 0,5 nm, czyli jest ok. 1000 razy wyższa niż w przypadku mikroskopu świetlnego.

Układ formujący obraz w mikroskopie elektronowym jest w zasadzie powieleniem analogicznego układu mikroskopu świetlnego. Mikroskop elektronowy posiada zatem źródło strumienia elektronów oraz system "soczewek", przez które strumień ten jest odpowiednio załamywany. Kierunek biegu elektronów ulega zmianie w polu magnetycznym, stąd też tzw. soczewki elektromagnetyczne stanowią odpowiednik soczewek szklanych mikroskopu świetlnego. Soczewka elektromagnetyczna jest to cewka otoczona płaszczem z miękkiego żelaza. Płaszcz ten posiada przerwę biegnącą wokół wewnętrznego obwodu cewki, zazwyczaj przy jednym z jej końców. W tym właśnie miejscu na skutek przepływającego przez uzwojenie cewki prądu elektrycznego wytwarza się niezwykle silne pole magnetyczne, które ugina strumień elektronów, skupiając go analogicznie do skupiania wiązki świetlnej przez soczewkę szklaną (ryc. 2.1).

Zmiana parametrów prądu przepływającego przez uzwojenie soczewki elektromagnetycznej powoduje zmianę charakterystyki wytwarzanego pola magnetycznego i w konsekwencji zmianę "parametrów optycznych" soczewki (powiększenie, ogniskowanie). Powstający w mikroskopie elektronowym obraz nie jest oczywiście widzialny, może natomiast zostać odtworzony na ekranie luminescencyjnym, emitującym światło widzialne pod wpływem bombardowania elektronami, na emulsji fotograficznej, a także może być prztworzony elektronicznie i wyświetlony na monitorze.

Zetknięcie się rozpędzonych do znacznej szybkości elektronów z próbką (preparatem) prowadzi do ich zderzeń z atomami próbki i wywołuje kilka zjawisk (ryc. 2.2):

• część elektronów przechodzi przez próbkę prostoliniowo (elektrony pierwotne nierozproszone),

• część elektronów przechodzi przez próbkę zmieniając swój tor (elektrony pierwotne rozproszone),

• część elektronów odbija się od próbki (elektrony pierwotne wstecznie rozproszone),

• z orbit atomów próbki wybijane są elektrony, które biegną w kierunku przeciwnym niż wiązka pierwotna (elektrony wtórne),

• atomy pozbawione elektronu (zjonizowane) powracają do stanu podstawowego, czemu towarzyszy emisja promieniowania rentgenowskiego.

Wszystkie powyższe zjawiska wykorzystywane są w mikroskopii elektronowej: elektrony pierwotne nierozproszone i rozproszone w mikroskopie transmisyjnym, elektrony wstecznie rozproszone i wtórne w mikroskopie skaningowym, a promieniowanie rentgenowskie w mikroanalizatorze rentgenowskim.

2.2. Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)

Transmisyjny mikroskop elektronowy jest niejako odpowiednikiem mikroskopu świetlnego (ryc. 2.3): strumień elektronów przechodzi przez preparat (stąd nazwa mikroskopu - transmisyjny) analogicznie do strumienia promieni świetlnych w mikroskopie optycznym.

Preparat powoduje rozproszenie części przechodzących elektronów. Liczba rozproszonych elektronów i ich tory zależne są od liczby atomowej pierwiastka, przez który przechodzi wiązka elektronów (największe rozproszenie elektronów powodują pierwiastki o wysokich liczbach atomowych, np. metale ciężkie: ołów, osm, wolfram, uran) oraz od jego zagęszczenia w badanym materiale. Z tego powodu "barwnikami" (kontrastami) dla preparatów badanych w transmisyjnym mikroskopie elektronowym są związki metali ciężkich. W tak przygotowanym preparacie, rejony nie wykontrastowane swobodnie przepuszczają elektrony, natomiast rejony wykontrastowane powodują ich znaczne rozproszenie - w ostatecznym obrazie mikroskopowym rejony takie będą odpowiednio jasne i ciemne.

Wszystkie elementy układu tworzenia obrazu znajdują się w hermetycznej metalowej kolumnie mikroskopu, stanowiącej najważniejszą część urządzenia. Kolumna jest połączona z zespołem pomp wytwarzających w niej wysoką próżnię (rzędu 10^-5-10^-6 Torr).

2.2.1. Działo elektronowe

Źródłem wąskiego strumienia elektronów o wysokiej gęstości jest tzw. działo elektronowe spełniające dwa zadania: emitujące elektrony a następnie formujące je w wiązkę i przyspieszające do szybkości roboczej. Ponieważ przyspieszanie elektronów może powodować jedynie pole elektryczne, działo elektronowe składa się z dwóch biegunów: katody i anody, pomiędzy którymi wytwarzana jest różnica potencjałów (napięcie) rzędu 50-200 kV.

Istnieją dwa podstawowe typy konstrukcyjne działa elektronowego. W pierwszym, elektrony wyrzucane są przez cienkie włókno wolframowe lub przez otoczony wolframową spiralą zaostrzony pręt z borku lantanu na zasadzie termoemisji, tzn. po elektrycznym rozżarzeniu do bardzo wysokiej temperatury (ok. 2000°C). Element emitujący elektrony, tzw. filament, wchodzi w skład katody, natomiast anoda ma postać tarczy z niewielkim otworem w środku. Przez ten właśnie otwór wydostaje się wytworzona i przyspieszona w polu elektrycznym wiązka elektronów. Wadą takiego działa elektronowego stanowi ograniczony czas pracy żarzonego filamentu, który podobnie jak włókno żarówki przepala się - tym szybciej, im intensywniej ("jaśniej") jest "oświetlana" próbka.

Wady tej jest pozbawiony drugi rodzaj działa elektronowego, oparty na zjawisku emisji polowej ("zimnej"): wyrzucania elektronów z metalu pod wpływem silnego pola elektrycznego. Zjawisko to może zachodzić w temperaturze pokojowej. W skład takiego działa elektronowego wchodzi wolframowa katoda o zaostrzonym, "punktowym" końcu oraz podwójna anoda: jedna wytwarza silne pole elektryczne w pobliżu katody, indukując emisję elektronów, natomiast druga pełni rolę elektrody przyspieszającej elektrony. Wykorzystanie emisji polowej zapewnia znacznie dłuższy czas pracy katody oraz intensywniejszy strumień elektronów (lepsze "oświetlenie" próbki).

2.2.2. Kondensor

Podobnie jak w mikroskopie optycznym, mikroskop elektronowy wyposażony jest w jedną lub dwie soczewki kondensorowe, których zadaniem jest skupienie wiązki elektronów na bardzo małej powierzchni preparatu. Jest to szczególnie ważne przy dużych powiększeniach, gdyż tylko mocne skupienie strumienia elektronów zapewnia uzyskanie obrazu o wystarczającej jasności.

2.2.3. Soczewka obiektywowa

Po przejściu przez preparat strumień elektronów załamywany jest przez soczewkę obiektywową, która tworzy pierwszy powiększony obraz badanego obiektu. Od własności soczewki obiektywowej zależy w największym stopniu zdolność rozdzielcza mikroskopu elektronowego, stąd jest to najbardziej precyzyjnie wykonany element układu tworzącego obraz. Soczewki elektromagnetyczne posiadają wszystkie wady soczewek szklanych (aberracje geometryczne, astygmatyzm) i jest rzeczą szczególnie istotną, aby soczewka obiektywowa była wolna od tych wad.

2.2.4. Soczewki projekcyjne

Zadaniem soczewek projekcyjnych jest wtórne powiększenie obrazu wytworzonego przez soczewkę obiektywową. Bez nich również możliwe byłoby uzyskanie obrazu powiększonego kilkanaście czy kilkadziesiąt tysięcy razy, ale wówczas ekran mikroskopu musiałby się znajdować w odległości kilkunastu metrów od soczewki obiektywowej, podczas gdy odległość ta, warunkowana wysokością kolumny, nie przekracza zazwyczaj 1 m. Przeważnie stosuje się dwie soczewki projekcyjne: pierwszą, czyli pośrednią i drugą, właściwą. Zmiany powiększeń uzyskuje się poprzez regulację natężenia prądu przepływającego przez uzwojenie soczewki pośredniej.

2.2.5. Stolik przedmiotowy

Stolik przedmiotowy, na którym umieszcza się oglądany preparat, znajduje się pomiędzy kondensorem a soczewką obiektywową. Urządzenie to musi stwarzać warunki do wielokrotnego wkładania i wyjmowania preparatu bez zaburzenia wysokiej próżni panującej w kolumnie mikroskopu.

2.2.6. Ekran luminescencyjny

Strumień elektronów tworzący obraz preparatu pada na ekran umieszczony w dolnej części kolumny i pokryty warstwą substancji fluoryzującej (np. siarczku cynku). Pod wpływem wiązki elektronów substancja ta emituje światło widzialne i w ten sposób na ekranie tworzy się dostrzegalny obraz, oglądany przez wbudowane u podstawy kolumny okienko.

2.2.7. System fotograficznej rejestracji obrazu

Wiązka elektronów, podobnie jak strumień świetlny, zderzając się z emulsją fotograficzną powoduje jej zaczernienie, co pozwala na bezpośrednią rejestrację obrazu na płytach lub błonach fotograficznych. Bezpośrednio pod ekranem, który można odchylać, znajduje się komora fotograficzna oddzielona od kolumny śluzą. Po otwarciu śluzy i podniesieniu ekranu strumień elektronów pada bezpośrednio na kliszę lub film. W skład systemu rejestracji fotograficznej wchodzą:

• miernik gęstości strumienia elektronów (odpowiednik światłomierza), automatycznie regulujący czas naświetlania,

• urządzenie będące odpowiednikiem migawki aparatu fotograficznego, otwierające i zamykające dopływ strumienia na kliszę,

• kaseta z płytami, błonami lub filmem fotograficznym wraz z mechanizmem ich automatycznego przesuwu po każdej ekspozycji.

Komora fotograficzna jest hermetycznie zamknięta i jej otwarcie w celu wymiany kaset (z kliszami czy filmem) możliwe jest dopiero po zamknięciu śluzy oddzielającej komorę od kolumny mikroskopu. W niektórych typach mikroskopów, kaseta z kliszami lub filmem znajduje się na zewnątrz, w łatwo dostępnym miejscu, a obraz przekazywany jest z ekranu na emulsję poprzez grubą, uszczelnioną wiązkę światłowodów; jednak w tym przypadku rozdzielczość obrazu fotograficznego ograniczona jest do średnicy pojedynczego światłowodu i ustępuje rozdzielczości fotogramów uzyskanych w sposób konwencjonalny.

2.2.8. Zespół pomp próżniowych

Do uzyskania wysokiej próżni w kolumnie mikroskopu niezbędne są wydajne pompy próżniowe. Z reguły stosuje się dwie połączone ze sobą pompy: rotacyjną, wytwarzającą wstępną próżnię, i dyfuzyjną, jonową lub turbomolekularną, wytwarzającą właściwą, wysoką próżnię. Pompy wymagają chłodzenia, stąd większość mikroskopów elektronowych posiada wodny obieg chłodniczy (otwarty lub zamknięty). Pompy połączone są z kolumną mikroskopu, komorą fotograficzną, a w niektórych przyrządach również z niewielką komorą wstępną stolika przedmiotowego. Dzięki odpowiednim zaworom, w każdym z tych elementów można niezależnie tworzyć warunki próżniowe i powracać do ciśnienia atmosferycznego.

2.2.9. Pulpit sterowniczy

Pulpit sterowniczy pozwala na regulację praktycznie wszystkich parametrów czynnościowych mikroskopu. Przygotowanie mikroskopu elektronowego do pracy jest złożoną, kilkunastoetapową procedurą. W jej skład wchodzą m.in.:

• wytworzenie wysokiej próżni w kolumnie,

• regulacja wysokiego napięcia dla działa elektronowego,

• regulacja prądu grzania filamentu wolframowego,

• centrowanie filamentu,

• centrowanie przesłon kondensora i obiektywów,

• regulacja parametrów optycznych soczewki obiektywowej,

• włączenie systemu rejestracji fotograficznej.

Natomiast praca przy mikroskopie wymaga stałej regulacji:

• jaskrawości obrazu i wielkości oświetlonego pola (czyli stopnia skupienia wiązki elektronów przez kondensor),

• powiększenia,

• ostrości obrazu.

Poza odpowiednimi pokrętłami regulacyjnymi i przełącznikami, na pulpicie znajdują się również wskaźniki próżni, wysokiego napięcia, liczby wykonanych zdjęć, a także lampki kontrolne informujące o prawidłowej pracy poszczególnych podzespołów mikroskopu.

W nowych modelach mikroskopów zaawansowana elektronika (wykorzystanie mikroprocesorów lub sprzężenie z komuterem klasy PC) pozwala na częściowe lub całkowite zautomatyzowanie całej procedury. Przygotowanie mikroskopu do pracy dokonuje się automatycznie, mikroskop posiada funkcje zoom (płynna regulacja powiększenia) i autofocus (automatyczna regulacja ostrości obrazu), jasność obrazu regulowana jest automatycznie przy zmianach powiększeń, można też zapisywać w pamięci elektronicznej i następnie odtwarzać wybrane położenia stolika przedmiotowego (odnajdywanie uprzednio oglądanych szczegółów w preparacie). Niektóre mikroskopy wyposażone są w kamerę cyfrową, pozwalającą na zapis obrazu w pamięci komputera, a następnie jego odtwarzanie lub analizę (p. rozdz. 11.4).

2.3. Wysokonapięciowy mikroskop elektronowy (HVEM)

Wysokonapięciowy mikroskop elektronowy jest odmianą mikroskopu transmisyjnego, w którym napięcie przyspieszające wiązkę elektronów wynosi 1-3 MV. W wyniku tak dużej różnicy potencjałów strumień elektronów ma znacznie zwiększoną energię i może przechodzić przez wielokrotnie grubsze próbki niż w przypadku normalnego mikroskopu transmisyjnego. Stwarza to możliwość oglądania grubych skrawków tkanek, a nawet całych komórek, przez co uwidacznia się np. przestrzenna struktura organelli komórkowych. Wysokonapięciowy mikroskop elektronowych charakteryzuje się kolumną o znacznej wysokości, dochodzącej nawet do kilkunastu metrów.

2.4. Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM)

Skaningowy mikroskop elektronowy służy do badania zróżnicowanych przestrzennie powierzchni próbek i pozwala na uzyskanie ich plastycznego, nieomal trójwymiarowego obrazu o znacznej głębi ostrości. Zasada jego działania znacznie się różni od zasady działania mikroskopu transmisyjnego (ryc. 2.4).

Strumień elektronów jest skupiany przez kondensor i obiektyw w taki sposób, że maksymalnie skoncentrowana, prawie punktowa wiązka elektronów pada na powierzchnię próbki pokrytą warstewką metalu (złoto, platyna), która nie przepuszcza elektronów. Pomiędzy soczewką obiektywową a próbką znajduje się specjalny układ elektromagnetyczny, tzw. deflektor, stale zmieniający kierunek biegu wiązki, tak, iż ta skanuje (p. str. 18) linia po linii powierzchnię próbki. Pod wpływem bombardowania elektronami, od nieprzenikliwej powierzchni odrywane są elektrony wtórne, a także odbijają się od niej elektrony wstecznie rozproszone. Intensywność ich emisji zależy od kąta nachylenia danego wycinka powierzchni próbki do pierwotnej wiązki elektronowej, czyli od konfiguracji przestrzennej tej powierzchni.

Elektrony wtórne i wstecznie rozproszone wychwytywane są przez układ detektorowy złożony ze scyntylatora, fotokatody i fotopowielacza, które przetwarzają energię elektronów na impulsy świetlne, a następnie elektryczne. Zostają one wzmocnione i wtórnie przetworzone w obraz na monitorze dzięki synchronizacji ruchu pierwotnej wiązki elektronów po powierzchni próbki z ruchem plamki świetlnej na ekranie. Istnieje również możliwość fotograficznej lub elektronicznej rejestracji obrazu.

Mikroskop skaningowy pracuje przy napięciu przyspieszającym rzędu 10-60 kV (przeważnie ok. 15-30 kV). Jego zdolność rozdzielcza (3-10 nm) uzależniona jest w pierwszym rzędzie od rozmiarów (średnicy) wiązki elektronowej padającej na próbkę oraz od odległości pomiędzy badaną powierzchnią i soczewką obiektywową.

2.5. Wysokorozdzielczy skaningowy mikroskop elektronowy (HR-SEM)

W ostatnich latach udoskonalono konstrukcję mikroskopu skaningowego, wprowadzając wydajne źródło elektronów działające na zasadzie emisji polowej, co umożliwiło uzyskanie średnicy wiązki elektronów padających na preparat rzędu 0.7 nm, a także zmieniono budowę układu tworzącego obraz, umieszczając preparat w obrębie pola magnetycznego soczewki obiektywowej. Zbudowane według tych zasad mikroskopy charakteryzują się zdolnością rozdzielczą wynoszącą ok. 0,5 nm i noszą nazwę wysokorozdzielczych mikroskopów skaningowych. Pozwalają one na uwidocznienie bardzo niewielkich szczegółów budowy badanych powierzchni, jakie dotychczas były uchwytne jedynie przy pomocy transmisyjnego mikroskopu elektronowego i specjalnych technik przygotowania materiału.

2.6. Mikroanalizator rentgenowski

Zderzeniu rozpędzonego elektronu z atomem próbki towarzyszy przekazanie mu części energii elektronu. Powoduje to wyrwanie innego elektronu z którejś z powłok atomu próbki, czyli jonizacja atomu. Taki atom może wrócić do stanu podstawowego albo poprzez przeskok elektronu z sąsiedniej, zewnętrznej powłoki, albo poprzez wyrzucenie kolejnego elektronu (tzw. elektronu Augera). To pierwsze zjawisko, określane mianem przejścia promienistego zawsze wiąże się z wypromieniowaniem fotonu o określonej energii. Przy energiach elektronów wiązki wytworzonej w mikroskopie elektronowym, emitowane podczas przejść promienistych fotony mają charakter promieniowania rentgenowskiego. Długość fali tego promieniowania jest charakterystyczna dla pierwiastka, którego atom go wyemitował. Wykorzystanie tego zjawiska umożliwia analizę pierwiastkową materiału oglądanego w mikroskopie elektronowym pod warunkiem wyposażenia mikroskopu w odpowiedni detektor promieniowania rentgenowskiego, popularnie zwany mikroanalizatorem rentgenowskim. Mikroanalizator taki można zainstalować zarówno w transmisyjnych jak i w skaningowych mikroskopach elektronowych.

Pozwala on na identyfikację niewyobrażalnie małych ilości danego pierwiastka (rzędu 10^-15 g) w wybranym obszarze preparatu mikroskopowego (dla skrawków ultracienkich w obszarze o wielkości 10-40 nm). Istnieją dwa podstawowe rodzaje mikroanalizy rentgenowskiej: energo-dyspersyjna, umożliwiająca równoczesną identyfikację wielu pierwiastków, oraz falowo-dyspersyjna, pozwalająca na pomiar zawartości jednego, wybranego pierwiastka.

Podpisy pod ilustracje:

Ryc. 2.1. Soczewka elektromagnetyczna. U - uzwojenie cewki, P - płaszcz z miękkiego żelaza, e - strumień elektronów

Ryc. 2.2. Efekty zderzeń strumienia elektronów (pierwotnych) z atomami próbki

Ryc. 2.3. Schemat budowy układu tworzącego obraz w transmisyjnym mikroskopie elektronowym

Ryc. 2.4. Schemat układu tworzącego obraz w skaningowym mikroskopie elektronowym

Scyntylator - substancja emitująca błyski światła pod wpływem promieniowania jonizującego (w tym strumienia elektronów). Fotokatoda - katoda emitująca elektrony pod wpływem światła. Fotopowielacz - urządzenie wzmacniające prąd wytwarzany przez fotokatodę.

23

---