12.03.2009 r.

Ćwiczenie 4

Temat: Cytogenetyka interfazalna - identyfikacja chromatyny płciowej.

1. Prelekcja wstępna.

2. Techniki uzyskiwania ciałka Barra.

3. Techniki uzyskiwania ciałka Y.

4. Techniki uzyskiwania pałeczek dobosza.

5. Technika fluorescencyjnej hybrydyzacji In situ (FISH) w cytogenetyce człowieka.

Cytogenetyka interfazalna - dotyczy chromosomów spoczynkowych. W interfazie chromosomy są niewidoczne, bo zawarte są w rozwiniętej chromatynie. Komórki w organizmie ludzkim większą część czasu przebywają w interfazie. W metafazę przechodzą po to, aby podzielić się na 2 równe części. Komórki interfazowe można również analizować pod względem zachowania się materiału genetycznego, w tym chromatyny odpowiadającej poszczególnym chromosomom.

Rodzaje heterochromatyny płciowej u człowieka w komórkach interfazalnych:

• u kobiet:

• ciałko Barra - nieaktywny chromosom X

Barr i Bertram odkryli, że w jądrach interfazowych komórek żeńskich wybarwia się ciemniejsza grudka zasadochłonnej chromatyny, dyskowato przylegająca do błony jądrowej - tę część chromatyny jądrowej nazwano ciałkiem Barra (X). Ciałko Barra występuje w komórkach, które zawierają minimum 2 chromosomy X, patologicznie również w komórkach męskich (kariotyp 47 XXY). Jest to ta część chromatyny, która w pierwszych dniach rozwoju zygoty uległa inaktywacji (lyonizacji, kondensacji).

Teoria Lyon - kobieta ma dwa chromosomy X. Na każdym z nich jest bardzo dużo genów. Mężczyzna ma tylko jeden chromosom X, chromosom Y w stosunku do X często nazywany jest chromosomem „pustym”. Na chromosomie Y zlokalizowane jest tylko parę aktywnych genów ulegających transkrypcji, a na X jest ponad 150 genów. Kobieta w porównaniu z mężczyzną miałaby 2 razy więcej aktywnych genów. Aby wyrównać ilość informacji genetycznej zawartej w XX u kobiety w stosunku do X u mężczyzny, pomiędzy 12 a 16 dniem życia zygoty żeńskiej jeden z X jest unieczynniony (zlyonizowany). W ciągu całego życia kobiety w komórkach somatycznych czynny jest tylko jeden X, w niektórych ojcowski, a w niektórych matczyny. Kobieta jest więc mozaiką. Komórki generatywne posiadają oba aktywne chromosomy X. Inaktywacji nie podlega grupa genów w regionie koniugacyjnym z chromosomem Y (PAR - pseudoautosomalny) oraz niektóre geny ułożone na proksymalnej części ramienia krótkiego i długiego chromosomu X. Jeżeli jeden X ma mutacje to unieczynniony jest zawsze ten uszkodzony.

Wybarwianie ciałek Barra to jedna z metod rozróżniania płci. Liczba ciałek Barra = liczba X - 1. Najłatwiej ciałka Barra uzyskać z nabłonka błony śluzowej jamy ustnej lub z płynu owodniowego zrobić rozmaz na szkiełku i wybarwić.

• pałeczka dobosza X - są to grudki chromatyny chromosomu X wyrzucone poza obręb jądra, ale pozostające z nim w łączności. Występują w granulocytach obojętnochłonnych, które mają segmentowane jądra. U kobiety pałeczka dobosza tworzy tą część chromatyny jądrowej, z której powstałby chromosom (nieczynny).

• u mężczyzn:

• pałeczka dobosza Y - u mężczyzn pałeczka dobosza tworzona jest przez tą część chromatyny jądrowej, z której powstałby chromosom Y - u mężczyzn fluoryzuje.

Dystalna część ramion dolnych chromosomu Y ma zdolność silnej fluorescencji. Aby odróżnić pałeczkę dobosza X od Y wystarczy wybarwić preparat barwnikiem fluorescencyjnym i jeżeli pałeczka dobosza zaświeci, jest to Y.

• ciałko Y (chromatyna Y) - występuje w jądrze komórkowym komórek męskich wybarwionych barwnikami fluorescencyjnymi - stanowi je dystalna hetero chromatynowa część ramion długich chromosomu Y, która ma dolność silnej fluorescencji. Liczba ciałek Y = liczba chromosomów Y. Jest to ta część, z której powstałby chromosom Y.

Barwienie ciałek Barra

Fuksyna zasadowa:

- roztwór podstawowy

• fuksyna zasadowa 3 g

• 70% alkohol etylowy - 100 ml

- roztwór fuksyny

• roztwór podstawowy - 10 ml

• 5% wodny kwas karbolowy (FENOL) - 30 ml

• kwas octowy lodowaty - 10 ml

• 37% formaldehyd (cz.d.a.) - 10 ml

(roztwór nadaje się do użycia po 24 godzinach)

Wykonanie:

1. Alkohol absolutny - 3 min

2. Alkohol 70% - 3 min

3. H₂O destylowana - 5 min

4. H₂O destylowana - 5 min

5. Fuksyna - 5 - 10 - 20 min

6. Alkohol 95% - 1 min

7. Alkohol absolutny - 3 min

8. Alkohol absolutny - 3 min

9. Ksylen

10. Ksylen

Przygotowanie kwasu karbolowego: wstawić fenol do cieplarki, odważyć 5 g i uzupełnić do 100 ml wodą.

Barwienie pałeczek dobosza X

Wykonanie rozmazu:

1. Kroplę krwi umieścić na jednym końcu szkiełka przedmiotowego.

2. Oprzeć brzeg szkiełka szlifowanego kroplę krwi tak, aby rozpłynęła się wzdłuż jego krawędzi. Szkiełko ustawić pod kątem 20-30⁰ w stosunku do szkiełka przedmiotowego.

3. Trzymając szkiełko szlifowane w prawej ręce a przedmiotowe w lewej podpierając je palcem środkowym, jednym ruchem rozmazać kroplę krwi.

4. Po wykonaniu rozmazu szkiełko wysuszyć na powietrzu.

Barwienie:

1. Utrwalić w alkoholu metylowym absolutnym - 10 min.

2. Zalać barwnikiem May - Grunwalda, zbuforowanym do pH 6,8 na 5 min.

3. Płukać w wodzie destylowanej.

4. Barwić 3% roztworem Giemsy przez 10-20 min.

5. Płukać w wodzie destylowanej.

6. Wysuszyć i przechowywać na sucho.

Analizować należy ok. 500 leukocytów. U osobników żeńskich stwierdza się co najmniej 12% granulocytów z typowymi pałeczkami dobosza X.

Barwienie ciałek Y oraz pałeczek dobosza Y w rozmazach krwi obwodowej

1. Sporządzić bardzo cienkie rozmazy krwi włośniczkowej pobranej z opuszki palca.

2. Preparaty wysuszyć na powietrzu. Utrwalić je w absolutnym metanolu (5-20 min).

3. Przeprowadzić preparaty przez szereg metanolowy o zmniejszającym się stężeniu. Opłukać w dwóch zmianach wody dejonizowanej.

4. Zanurzyć na 2 min w buforze McIlvane'a o pH 2,0.

5. Barwić 5% wodnym roztworem Q przez 5-20 min.

6. Preparaty opłukać w buforze McIlvane'a o pH 7.

7. Wysuszyć preparaty w cieplarce.

8. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym w kropli mieszaniny buforu i glicerolu.

9. Oceniać pod mikroskopem fluorescencyjnym nie później niż kilka godzin po wybarwieniu.

Wynik: Ciałka Y są widoczne w limfocytach, monocytach i granulocytach obojętnochłonnych.

Ziarnistości krwinek zasado i kwasochłonnych nieco przysłaniają ciałko Y.

Pałeczki dobosza Y są najlepiej widoczne w granulocytach obojętnochłonnych.

Barwienie ciałek Y w rozmazach nabłonka jamy ustnej

1. Rozmazy z komórek nabłonka jamy ustnej utrwalać w metanolu lub w mieszaninie etanolu z eterem (1:1).

2. Barwić przez 5 minut w 0,5% roztworze wodnym atebryny (Q).

3. Płukać 3 min w bieżącej wodzie.

4. Opłukać w buforze McIlvane'a o pH 5,5 lub 4,2, zamknąć preparat w nim lub w mieszaninie glicerolu z buforem 1:1.

5. Oceniać w mikroskopie fluorescencyjnym.

Wynik: ciałko Y ma średnicę 0,25 µm, występuje w 25-50% komórek.

Hybrydyzacja in situ

Jest to technika cytochemiczna pozwalająca na wykrywanie zarówno pojedynczego genu lub jego fragmentu w chromatynie lub chromosomie, jak i jego swoistej ekspresji w komórce czy tkance (in situ, tzn. w miejscu naturalnego występowania).

Hybrydyzacja może zachodzić pomiędzy wszystkimi rodzajami kwasów nukleinowych: DNA - RNA, DNA - DNA, RNA - RNA.

Istotą hybrydyzacji jest wzajemne oddziaływanie między cząsteczką badanego kwasu nukleinowego a cząsteczką sondy molekularnej, które prowadzi do utworzenia hybrydu.

Materiał, na którym można przeprowadzić hybrydyzację in sito, to: skrawki tkanek, pojedyncze komórki, struktury subkomórkowe (chromosomy - możliwa jest identyfikacja addycji, złożonych translokacji, identyfikacja mikrodelecji).

Reakcja enzymatyczna przeprowadzana jest na szkiełku mikroskopowym i oceniana jest pod mikroskopem. W technice FISH preparaty są analizowane w mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w lampę rtęciową o mocy 50 lub 100 W i odpowiedni zestaw filtrów.

FISH (fluorescencje in situ hybrydyzation) - sonda molekularna wyznakowana jest barwnikiem fluorescencyjnym.

Na wieloetapowy proces hybrydyzacji in situ składa się:

• sporządzenie i wyznakowanie sondy

• przygotowanie preparatu cytologicznego

• denaturacja sondy i DNA chromosomowego

• reakcja hybrydyzacji

• usunięcie niespecyficznie związanej sondy

• detekcja sondy

• analiza mikroskopowa.

Sondy molekularne:

• dwuniciowe lub jednoniciowy sondy DNA, cDNA

• jednoniciowy sondy oligonukleotydowe (DNA) o długości 20-50 nukleotydów (syntetyzowane chemicznie)

• jednoniciowe sondy RNA.

Optymalna długość sondy to 100-250 nukleotydów. Powyżej 500 mają wyższą swoistość, ale trudniej penetrują do wnętrza komórki, zwiększają tło reakcji.

Sondy jednoniciowy (cDNA, RNA) - cechuje wyższa czułość, jednak ich przygotowanie jest znacznie trudniejsze.

Dwie grupy znaczników:

1. radioaktywne: ³²P, ³³P, ³⁵S, ³H

2. fluorochromy: biotyna + audiyna, digoktygenina (sondy są trwałe, mają dużą rozdzielczość).

Zastosowanie hybrydyzacji in situ:

• wykrywanie mRNA, np. dla danego hormonu, badanie ekspresji onkogenów na poziomie RNA

• wykrywanie wirusowego DNA i RNA

• identyfikacja genów, wykrywanie mutacji

• wykrywanie liczbowych i strukturalnych aberracji chromosomowych (metafazowe, jądra interfazowe).

---