Ćwiczenie 3 -genetyka
Enzymy restrykcyjne-są to endonukleazy tnące DNA w specyficznych miejscach, niezależnie od jego pochodzenia. Stały się one 1-szym narzędziem stosowanym do pocięcia całego genomu na charakterystyczne fragmenty DNA (tzw. Fragmenty restrykcyjne).W ten sposób geny lub zespoły genow stają się jednostkami fizycznie możliwymi do wyizolowania , a nie tylko informacja rozsianą w olbrzymiej ciągłości genomu. W warunkach naturalnych enzymy te występują w komórkach bakterii i sinic i pełnia tam rolę systemu obronnego. Ich zadaniem jest niszczenie obcego DNA najcześciej wirusowgo. Własny DNA nie jest niszczony gdyż nie ma w nim specyficznych rozpoznawanych przez restryktazy sekwencji zasad albo Są one zmetylowane i w ten sposób staja się niedostępne dla enzymu. Obecnie znanych jest ok. 3000 enzymów restrykcyjnych natomiast niewiele z nich ma zastosowanie .Zasady nazewnictwa np. Eco R I - 1- sza litera - rodzaj bakterii, z której wyizolowano enzym, 2 następne litery-gatunek bakterii, z której wyizolowano enzym, R -szczep, cyfra rzymska-przedstawia klejnosc odkrycia enzymu u tego samego gatunku bakterii. Charakterystyczna cechą enzymów restrykcyjnych jest rozpoznawanie swoistych dla danego enzymu sekwencji zasad w Dna (4-8 pz).Charakterystyczna cechą rozpoznawanych sekwencji jest polindromiczność-co oznacza, że kolejność zasad w jednej nici Dna odczytywana w kierunku 5` 3` jest taka sama jak kolejność zasad w drugiej nici w kierunku 5`3`.Endonukleazy rozpoznawszy sekwencje tną Dna albo w obrębie tej sekwencji albo w pewnej odległości od niej. Ze względu na miejsce cięcia, ale tez ze względu na kofaktory i ilość podjednostek można dokonać podziału enzymów restrykcyjnych na 3 klasy.
Klasa I- najliczniejsza i najbardziej skomplikowana,3 podjednostki, aktywność metylazy. Działanie zależy od kofaktorów ATP, jony magnezu i s-adenozynometionina. Enzymy rozpoznają sekwencję łączą się z nią, ale tną w pewnej odległości -nawet 1000 pz od miejsca rozpoznawanego.
Klasa III-2 typy podjednostek. Wymagają ATP, jonów magnezu ,s-adenozynometionia nie jest niezbędna. Przecinają Dna w pewnej odległości od rozpoznanej sekwencji- ok. 25 nukleotydów.
Klasa II-najprostszy system , 1 typ podjednostki . Aktywowane jonami magnezu,nie maja aktywności metylazy. Przecinają Dna w miejscu rozpoznawanej sekwencji.
Do badań genetycznych wykorzystywana jest tylko klasa II.
Typy cięć-enzymy restrykcyjne mogą przecinać podwójną nić Dna na 2 różne sposoby:
-przecinają obie nici Dna na tej samej wysokości(naprzeciw siebie) tak że powstają zakończenia Dna z tępymi końcami, na których nie ma wolnych niesmarowanych zasad. fragmenty o tępych końcach mogą się połączyć tylko za pomocą enzymu ligazy polinukleotydowej T4.
-przecinają każdą nić Dna nie naprzeciwko siebie, ale cięcia na 2 niciach przesunięte są jedno względem drugiego o kilka zasad. Powstają w ten sposób lepkie końce, na których znajdują się niesmarowane zasady. Końce te mogą tworzyć wiązania wodorowe zgodnie z zasadą komplementarności z lepkimi końcami każdego innego fragmentu Dna powstałego powstałego wyniku działania tej samej endonukleazy.
Zastosowanie-inżynieria genetyczna umożliwiły postęp w mapowaniu genomu,nieodzowne w analizie RFLP, wykrywanie mutacji, ustalanie stopnia pokrewieństwa , ustalanie ojcostwa, kryminalistyka.
RFLP- polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych. Jest to polimorfizm fragmentów Dna powstających wyniku działania enzymów restrykcyjnych na nic Dna. Polimorfizm ten może być wynikiem tranzycji, transwersji , delecji, inercji co prowadzi do powstania lub zaniku miejsca rozpoznawanego przez enzymy restrykcyjne. Mutacje zachodzące w obrębie miejsc restrykcyjnych zmieniają długość fragmentów restrykcyjnych, które można wykrc np. metodą Southerna. Polimorfizm fragmentów restrykcyjnych jest dość powszechny , szczególnie w niekodujących regionach Dna.
Zastosowanie-identyfikacja mutacji w chorobach genetycznych -tą metoda badamy mutacje znane. Badanie dziedzicznych uwarunkowań do powstania danych chorób genetycznych. Mapowanie genów.
SSCP- metoda ta wykorzystuje unikalną właściwość kwasów nukleinowych polegającą na tworzeniu przez pojedyncze nici Dna tzw. konformerów, których kształt jest zależny od sekwencji Dna np. mutacje punktowe zmieniają konformacje pojedynczej nici Dna co jest wykrywane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym
Przebieg procesu- amplifikacja badanego fragmentu Dna met PCR ze znakowaniem fosforemprodukt PCR wyznakowały radioizotopemdenaturacjajednoniciowe fragmenty Dna wykazujące polimorfizm tzw. konformeryelektroforeza w niedenaturującym żelu poliakrylamidowaym i autoradiografia
Zastosowanie-metoda wykorzystana do badań mutacji nieznanych
Hybrydyzacja z sondą molekularną
Hybrydyzacja to zdolność 2 komplementarnych lub częściowo komplementarnych cząsteczek kwasów nukleinowych do tworzenia stabilnej hybrydy o zasadach połączonych w pary . Wzajemne oddziaływanie między cząsteczka badanego kwasu nukleinowego a cząsteczką sondy prowadzi do utworzenia hybrydy(dupleksu). Hybrydyzacja może zachodzić między 2 dowolnymi jednoniciowymi łańcuchami kwasów nukleinowych:DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA. Łączenie się z sonda jest wysoce specyficzne i zachodzi wg. zasady komplementarności. Podstawową cechą hybrydyzacji jest specyficzność i stabilność formowanego hybrydu. Stabilność powstającego kompleksu jest tym większa im dłuższe odcinki wykazują komplementarność nukleotydów.
Sondą molekularną mogą być:
-syntetyczne odcinki DNA służące do wykrywania pojedynczych substytucji nukleotydowych
-naturalne geny zawierające oprócz sekwencji kodujących także sekwencje flankujące i wtrącone wchodzące w skład danego genu
-syntetyczne geny zawierające wyłącznie sekwencje kodujące
-odcinki c DNA syntetyzowane przy pomocy odwrotnej transkryptazy
-fragmenty chromosomów stosowane, gdy molekularne podłoże choroby nie jest znane znany jest natomiast region chromosomu, w którym lub w pobliżu, którego występuje mutacja
-sondy genomowe
-odcinki DNA komplementarne do r RNA stosowane w diagnostyce radiologicznej
Aby wykryć taką sondę musi być ona znakowana: znakowanie radioaktywne(stosowane fosfor , wodór, siarka), lub metody fluorescencyjne- bardziej proste i mniej niebezpieczne.
Hybrydyzacja metodą Southern
Zadaniem tego typu hybrydyzacji jest identyfikacja poszukiwanych sekwencji DNA w mieszaninie fragmentów otrzymanych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi.
Etapy:
1) Genomowy DNA trawiony przez wybrane enzymy restrykcyjne
2) Fragmenty DNA otrzymane po trawieniu rozdziela się przez elektroforezę w żelu agarozowym
3) Zestaw fragmentów restrykcyjnych przenosi się z żelu agarozowego na błonę nylonową( filtr nitrocelulozy)
4) Badany fragment wykrywa się przez hybrydyzacje z sondą
Metoda Southerna stosowana jest powszechnie do badań polimorfizmu DNA.
Zastosowanie-analiza RFLP
Metoda Nothern
W przeciwieństwie do met Southern tym co rozdzielamy jest RNA natomiast sondą możę być DNA. Wszystkie etapy procesu są takie same. Najtrudniejsza w tej metodzie jest sama izolacja RNA gdyż jest ono niestabilne i łatwo ulega trawieniu przez endonukleazy.
Metoda Western
Hybrydyzacja dotyczy białek. Na membranę przenosimy białka a detekcji dokonujemy przeciwciałami znakowanymi(hybrydyzacja z białkami unieruchomionymi na membranie)
Hybrydyzacja in situ
Jest to technika cytochemiczna służąca do wykrywania pojedynczego genu lub jego fragmentu bezpośrednio w preparacie cytogenetycznym i cytologicznym(tkankowym)
In situ oznacza :w miejscu naturalnego występowania. Metodą tą można badać swoistą ekspresję genu w komórce lub tkance.
Materiał: skrawki tkanek, pojedyncze komórki, struktury subkomórkowe tj. chromosomy
Prowadzona jest bezpośrednio na szkiełku mikroskopowym bez przenoszenia na nośnik;w zawiesinach komórek lub próbkach tkanek pobranych w czasie biopsji. Aby zastosować hybrydyzacje In situ DNA w chromosomie musi być w formie 1-niciowej. Podstawowe warunki hybrydyzacji In situ to czułość i rozdzielczość.
Fluorescencyjna hybrydyzacja In situ-FISH
Technika ta wykorzystuje fluorescencyjne metody detekcji sondy . Po hybrydyzacji preparat ocenia się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Ze względu na duża rozdzielczość rozdzielczość łatwość użycia FISH wyparł radioaktywną hybrydyzacje in situ.
Wykorzystuje się 3 rodzaje sond:
-centromerowe
-malujące
-unikatowe
Etapy:
-przygotowanie preparatu chromosomowego
-denaturacja DNA chromosomowegopowstają 1-niciowe łańcuchy
- jednocześnie przygotowujemy sondę (denaturacja z wytworzeniem fragmentow jednoniciowych , znakowanie)
-hybrydyzacja In situ -nakrapiamy sondę na preparat chromosomowy
-odstawienie i tworzenie się hybryd
-po hybrydyzacji odpukanie niespecyficznie związanej sondy
-detekcja związanej sondy(metoda bezpośrednia-od razu preparat oglądany pod mikroskopem fluorescencyjnym albo jeśli znacznikiem była biotyna dodać avidynę i fluoresceinę-metoda pośrednia)
Zastosowanie
-wykrywanie aberracji chromosomowych-liczbowych i strukturalnych
-wykrywanie mikrodelecji
-identyfikacja złożonych translokacji
-diagnostyka komórek nowotworowych
-diagnostyka prenatalna
-wykrywanie płci
-identyfikacja chromosomów markerowych
Sekwencjonowanie DNA
Metoda chemicznej degradacji DNA (metoda Maxama i Gillberta)
Metoda terminacji łańcucha - metoda Sangera, metoda dideoksy
1 - Metoda chemicznej degradacji DNA (metoda Maxama i Gillberta)
Izolacja DNA
Denaturacja - 1 nić
Znakowanie (np. izotopami radioaktywnymi) na końcu 5'
W wyniku różnych reakcji chemicznych dochodzi do metyzacji odpowiednich zasad DNA
dodanie siarczku dimetylu powoduje metyzację guaniny
Kwas mrówkowy - adenina lub guanina
Hydrazyna - tymina i cytozyna
Hydrazyna i stężona sól - cytozyna
Dodajemy piperydyny - usuwa zmetylowane zasady i przerywa łańcuch DNA
W efekcie otrzymujemy różnej długości łańcuchy pociętego DNA
Które następnie poddajemy elektroforezie na żelu poliakrylamidowym
2. - Metoda terminacji łańcucha - metoda Sangera, metoda dideoksy
Starter, polimeraza DNA, deoksyrybonukleotydy
W każdej próbówce znajduje się też pewna ilość dideoksyrybonukleotydów (w każdej po 1 specyficznym)
Polimeraza DNA nie ma zdolności rozróżnienia czy wbudowywany nukleotyd to dideoksy, czy prawidłowy
Po wbudowaniu w łańcuch dideoksyrybonukloeotydu następuje koniec elongacji łańcucha
Ponieważ w każdej probówce znajduje się określony dideoksyrybonukleotyd, wiemy jaka zasada została wbudowana ostatnia
W wyniku elektroforezy możemy odczytać sekwencję DNA
Mikromacierze DNA
Pozwalają na badanie całej grupy genów
Hybrydyzacja jednoczasowa w kilku grupach genów
Opiera się na metodzie Southern lub Northern