Data wykonania ćwiczenia nr 4: 25.03.2013

Data wykonania ćwiczenia nr 5: 08.04.2013

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Inżynieria genetyczna – laboratorium

Sprawozdanie nr 4

Sprawozdanie nr 5

Sprawozdanie nr 4:

przygotowanie komórek kompetentnych

1. WSTĘP.

Celem ćwiczenia było przygotowanie komórek kompetentnych XL1‑Blue. Komórki kompetentne to komórki zdolne przyjąć obce DNA. Szczep XL1-Blue to specjalny szczep wytworzony przez firmę Novagen. Szczep ten posiada następujący genotyp: E.coli K12 recA1 endA1 gyrA96 thi­-­1­ hsdR17(r_K12^- m_K12⁺) supE44 relA1 lac[F’ proAB lacI^q ZΔM15 Tn10(Tc^R)]. Znaczenie poszczególnych markerów genetycznych jest następujące

• recA1 - niezdolność do rekombinacji DNA; zwiększa stabilność niektórych insertów podczas propagacji wektorów;

• endA1 - mutacja genu endonukleazy A specyficznej dla DNA, zwiększająca wydajność i jakość izolowanych plazmidów;

• gyrA96 - mutacja w genie gyrazy DNA;

• thi-1 - mutacja uniemożliwiająca wzrost na podłożu pozbawionym tiaminy;

• hsdR17(r_K12^- m_K12⁺) - brak systemu restrykcji K przy zachowanej zdolności do modyfikacji DNA przez system metyzacji hsdR17;

• supE44 - mutacja supresorowa typu amber (kodon UAG jest rozpoznawany przez Gln-tRNA);

• relA1 - mutacja eliminująca sprzężenie transkrypcji z translacją;

• F’ - gospodarz posiada episom F’ z wymienionymi cechami;

• proAB - mutacja uniemożliwiająca wzrost na podłożu pozbawionym proliny;

• lacI^q - zdolnośc do nadprodukcji lac represora hamującego transkrypcję z promotorów zawierających lac operator;

• lacZΔM15 - częściowa delecja w genie kodującym β-galaktozydazę;

• Tn10(Tc^R) - transpozon warunkujący oporoność na tetracyklinę;

• Tc^R - obecność genu tet, nadającego oporność na tetracyklinę[1].

W trakcie swojego rozwoju komórki bakteryjne przechodzą następujące fazy: I fazę - fazę zastoju (komórki „przyzwyczajają się do nowych warunków), II fazę - fazę wzrostu logarytmicznego (komórki mają zdolność do podziałów); III faza - faza stacjonarna i IV faza - faza zamierania.

Rysunek 1 Wykres przedstawiający jak zmienia się ilośc komórek w hodowli wraz z upływem czasu[2].

Komórki bakteryjne pobieramy z fazy logarytmicznej, czyli takiej dla której gęstość optyczna wynosi OD 0,4-0,6. Komórki będące w tej fazie są najlepsze do indukcji białka i przygotowania komórek kompetentnych.

1. ODCZYNNIKI I APARATURA:

Odczynniki:

1. Pożywka płynna LB:

   • Ekstrakt drożdżowy 10 g

   • Hydrolizat kazeiny 5 g

   • NaCl 10 g

1 litr H₂O _miliQ, pH 7,5 (1N NaOH)

1. Podłoże LB-agar z tetracykliną (12,5 µg/ml)

   • Ekstrakt drożdżowy 10g

   • Hydrolizat kazeinowy 5 g

   • NaCl 10 g

   • Agar 15 g

1 litr H₂O _miliQ, pH 7,5 (1N NaOH)

1. Roztwór A: 100 mM MgCl₂, sterylny, schłodzony w lodzie;

2. Roztwór B: 100 mM CaCl₂, sterylny, schłodzony w lodzie;

3. Roztwór C: 100 mM CaCl₂, 20% glicerol, sterylny, schłodzony w lodzie.

Aparatura:

1. Kolba Erlenmajera o pojemności 250 ml

2. Wytrząsarka rotacyjna firmy Multitron HT Infors

3. Sterylna pipeta plastikowa

4. Spektrofotometr

5. Probówka wirówkowa

6. Wirówka Eppendorf 5810R, rotor F-34-6-38

7. 3 pipety automatyczne Eppendorf o zakresach objętości 2 µl‑20 µl, 20 µl‑200 µl oraz 200 µl - 1000 µl

1. WYKONANIE ĆWICZENIA.

   1. Przygotowanie hodowli wstępnej.

Hodowla wstępna została przygotowana przez asystenta około 16 godzin przed zajęciami. W tym celu na płytkę zawierającą podłoże LB z tetracyklina w stężeniu końcowym 12,5 µg/ml wysiano ster lunie komórki XL1-Blue. Komórki te pobrano z roztworu glicerolowego, który był przechowywany w temperaturze -80°C i przed wysianiem rozcieńczono je jeszcze 1000‑krotnie w pożywce LB. Tak przygotowaną próbkę inkubowano następnie przez 16 godzin w temperaturze 37°C. Po tym czasie pobrano z płytki 1 kolonię za pomocą sterylnej końcówki do pipety o pojemności 200 µl a następnie zaszczepiono nią 30 ml płynnej pożywki LB również zawierającej tetracyklinę o stężeniu końcowym 12,5 µg/ml. Tak przygotowaną hodowlę znajdującą się w kolbie Erlenmajera o pojemności 250 ml umieszczono w wytrząsarce rotacyjnej i inkubowano w temperaturze 37°C przy 182 obr/min.

1. Przygotowanie komórek kompetentnych XL1-Blue.

Po całonocnej inkubacji pobrano z kolby 4,5 ml hodowli i przeniesiono za pomocą sterylnej plastikowej pipety do 60 ml świeżej pożywki LB z tetracykliną znajdującą się w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Tak przygotowaną hodowlę inkubowano ponownie w wytrząsarce rotacyjnej przy 182 obr/min i 37°C. Co jakiś czas mierzono gęstość optyczną hodowli, aż do osiągnięcia wartości około 0,4. Pomiar wykonywano przy długości fali 600 nm, a jako odnośnika używano czyste medium LB. Pierwszy pomiar wykonano po 45 minutach i zmierzona gęstość optyczna wynosiła 0,310, więc prowadzono dalszą inkubację. Po 70 minutach wykonano kolejny pomiar i gęstość optyczna wynosiła 0,400, więc przerwano inkubację i przystąpiono do właściwego przygotowania komórek kompetentnych. W tym celu pobrano 10 ml hodowli do zimnej probówki o pojemności 50 ml i umieszczono w wirówce Eppendorf 5810F. Wirowano przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przy 4500 x g. Po ukończonym wirowaniu supernatant odrzucono, a do pozostałego w probówce osadu dodano 1,2 ml zimnego roztworu A używając w tym celu pipety o pojemności 1 ml ustawionej na 600 µl. Jednocześnie po drugim dodaniu roztworu A dokładnie wymieszano bakterie, a następnie dodano jeszcze 2 ml tego roztworu. Po tych czynnościach probówkę inkubowano w lodzie przez 10 minut co jakiś czas mieszając. Po tych 10 minutach bakterie ponownie odwirowano w wirówce Eppendorf 5810F. Wirowanie również prowadzono przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy 4500 x g. Po skończonym wirowaniu supernatant odrzucono, a do pozostałego osadu dodano 1,2 ml zimnego roztworu B i podobnie jak wcześniej mieszając bakterie po drugim dodaniu roztworu. Następnie dodano jeszcze 2 ml roztworu B i pozostawiono probówki do inkubacji w lodzie przez 30 minut co jakiś czas mieszając. Po tym czasie ponownie bakterie odwirowano w wirówce Eppendorf 5810F przy takich samych ustawieniach jak wcześniej. Po 10 minutach wirowania supernatant odrzucono, a do osadu dodano 0,8 ml zimnego roztworu C. Tak przygotowaną zawiesinę bakterii rozdzielono do 6 probówek Eppendorf po 120 µl do każdej. Następnie probówki te zanurzono w ciekłym azocie po czym wyłowiono oraz przeniesiono do schłodzonego pudełka i przechowywano w‑80°C.

1. KOMENTARZ I WNIOSKI

• Ukompetentnianie komórek jest bardzo ważnym zabiegiem, którego celem jest zmiana struktury błon komórkowych tak, aby zdolne były przyjąć dodatkowy materiał genetyczny z otoczenia w postaci plazmidu lub fagowego DNA.

• Często komórki są wcześniej mutowane w taki sposób, aby nie sprzęgać translacji z transkrypcją, lub aby mogły one utrzymywać niezmodyfikowany plazmid. Najczęściej syntetyzuje się białka eukariotyczne.

• Mutacje mogą również zwiększać tolerancję komórek na białka obce. Wykonuje się mutacje supresorowe (translacja jest zablokowana dla danego rRNA) lub blokujące powstawanie proteaz trawiących preparat.

• Najłatwiej pobierane jest DNA superskręcone. Wprowadzenie liniowego DNA do komórki jest niezwykle trudne.

• Plazmid pobierany jest ze specyficznych regionów nazwanych tratwami (strefami adhezji) – w tym miejscu możliwe jest pobranie i wprowadzenie DNA.

• Kationy dwuwartościowe stabilizują strukturę DNA. Przy obniżeniu temperatury jony te wiążą się z polianionem DNA i z polarną częścią błony komórkowej stwarzając optymalne warunki do wprowadzenia kwasu nukleinowego do wnętrza komórki. Zawieszone komórki kompetentne w buforze z jonami są przechowywane w -80°C, potem dopiero dodawane jest DNA i mieszanina jest podgrzewana. Po ponownym podgrzaniu mieszaniny (szok cieplny), DNA pobierane jest do cytoplazmy.

• Komórki kompetentne używane są do nadekspresji genów, a także uzyskiwania preparatów białek.

LITERATURA.

Piśmiennictwo

1. http://eportal‑ch.pwr.wroc.pl/file.php/133/INSTRUKCJE_2012_2013_zima/Inzynieria_Genetyczna_-_Instrukcja_4.pdf; 06.04.2013; 22:15

2. http://www.phmd.pl/fulltxthtml.php?ICID=955129; 06.04.2013; 22:45

Sprawozdanie nr 5 – ligacja wektora oraz transformacja komórek kompetentnych

1. CEL ĆWICZENIA:

Celem ćwiczenia była ligacja wektora pGEX-2T uprzednio zlinearyzowanego restryktazą BamHI i defosforylowanego z fragmentem DNA kodującym domenę wiążącą DNA receptora ekdysteroidowego EcRDBD/BamHI) z wykorzystaniem bakteriofagowego enzymu - ligazy T4. W drugiej części przeprowadzono transformację komórek kompetentnych i sprawdzono wydajność defosforylacji.

1. ODCZYNNIKI I APARATURA:

Odczynniki:

1. 10x bufor reakcyjny dla ligazy DNA faga T4 (MBI Fermentas):

• 400 mM Tris-HCl (pH 7.8 w temp. 25)

• 100 mM MgCl₂

• 5 mM ATP

• 100 mM ditiotreitol (DTT)

1. Podłoże LB-agar z karbenicyliną (100 μg/ml)

• Ekstrakt drożdżowy – 10 g

• Hydrolizat kazeinowy – 5 g

• NaCl – 10g

• Agar – 15 g

1 litr H₂O_miliQ pH 7.5 (1N NaOH)

1. roztwór wektora pGEX-2T (w odpowiednim stężeniu tak, aby masa wyniosła ok. 10 ng)

2. roztwór ligazy T4 (1U/μl)

3. insert cDNA (EcRDBD) (o stężeniu równym masie ok. 1,86 ng)

Aparatura:

1. 3 pipety automatyczne Eppendorf o zakresach objętości 2 μl ‑ 20 μl, 20 μl‑200 μl oraz 200 μl - 1000 μl

2. Wirówka stołowa Eppendorf

3. Termomikser Eppendorf Thermomixer comfort

4. Plastikowe szalki Petriego

5. Wysterylizowane głaszczki szklane

6. Palnik gazowy

1. PRZEBIEG DOŚWIADCZENIA:

   1. Ligacja wektora pGEX-2T z fragmentem DNA.

W ćwiczeniu 4 wykonano elektroforezę naszej próbki zawierającej wektor. A następnie specjalnym programem wykonano analizę densymetryczną badanej próbki.

Rysunek 2 Obraz przedstawiający wynik elektroforezy. Kolejno od lewej znajduje się standard, a nastepnie próbki grup od 1 do 6 [1].

Wynik wykonanej analizy określił ilość badanego wektora znajdującego się w danym paśmie. W naszej - trzeciej - grupie znajdowało się 26,7 ng wektora. Do mieszaniny którą nałożono na żel dodano 3 µl wektora, więc jego stężenie w próbce wyjściowej wynosiło 8,9 ng/µl.

Następnie przystąpiono do wykonania mieszaniny ligacyjnej oraz mieszaniny kontrolnej. Do mieszaniny ligacyjnej dodano 10 ng wektora, więc znając jego stężenie obliczono objętość, którą należy dodać i wyniosła ona 1,2 µl. Tyle samo wektora dodano do mieszaniny kontrolnej. Kolejnym składnikiem był insert. Dodano go trzykrotnie więcej niż wektora. Masa molowa wektora wynosi 3166720 g/mol, więc:

1 mol pGEX-2T/BamHI = 3166720 g

x mol pGEX-2T/BamHI = 10 x 10^-9 g

x = 3,16 x 10^-15 mola

Insertu dodano trzy razy więcej, więc:

y = 3,16 x 10^-15 mola x 3 = 9,48 x 10^-15 mola insertu.

Masa molowa insertu wynosi 195840 g/mol, więc:

1 mol insertu = 195840 g

9,48 x 10^-15 mola insertu = b

b = 1,86 ng

Przygotowany insert miał stężenie 10 ng/µl, więc należało dodać 1,9 µl insertu. Do mieszaniny kontrolnej nie dodano insertu. Następnie dodano buforu. Końcowa objętość mieszaniny ligacyjnej oraz kontrolnej wynosiła po 30 µl, więc dodano po 3 µl 10-krotnie stężonego buforu dla ligazy T4. Do obydwóch mieszanin dodano również po 1 µl ligazy T4 i dopełniono wodą do 30 µl, w mieszaninie kontrolnej dodając odpowiednio więcej wody. Tak przygotowanie probówki Eppendorfa pozostawiono na 2 godziny i 10 minut w temperaturze pokojowej aby przeprowadzić reakcję ligacji.

1. Transformacja komórek kompetentnych.

Probówki Eppendorfa zawierające zawiesiny komórek kompetentnych rozmrożono w lodzie, a następnie przy palniku połączono w jednej probówce zawartość dwóch. Z tej probówki pobrano 150 µl zawiesiny i przeniesiono do probówki zawierającej mieszaninę po ligacji. Podobnie postąpiono z dwoma innymi probówkami zawierającymi komórki kompetentne, z tym że przeniesiono je do mieszaniny kontrolnej. Całość delikatnie wymieszano i inkubowano w lodzie przez 23 minuty. Po tym czasie przeniesiono probówki do termo miksera i inkubowano w temperaturze 37 °C przez 24 minuty. Po tym czasie dodano do obydwóch probówek po 150 µl płynnej pożywki LB i ponownie inkubowano w temperaturze 37 °C przez 23 minuty. Po skończonej inkubacji, całą zawartość probówek wysiano na odpowiednio podpisane szalki Petriego zawierające podłoże LB-agar z karbenicyliną o stężeniu końcowym 100 µg/ml. Tak przygotowaną hodowlę pozostawiono na ponad 12 godzin, a następnie policzono i porównano ilość koloni na płytce z mieszaniną ligacyjną oraz płytce kontrolnej.

1. KOMENTARZ I WNIOSKI:

• Ligacja to łączenie dwóch cząsteczek DNA jednoniciowych lub dwuniciowych, RNA jednoniciowych i dwuniciowych, a także hybryd RNA-DNA. Wszystko zależy od ligazy: np. aby zamknąć ssDNA lub ssRNA w formę kolistą stosuje się ligazę RNA, a gdy chcemy zamknąć dsDNA lub dsRNA , lub hybrydy DNA-RNA, używamy ligazy DNA.

• W doświadczeniu wykorzystano bakteriofagową ligazę T4, która katalizuje reakcję tworzenia wiązania fosfodiestrowego pomiędzy resztą fosforanową końca 5’ i hydroksylową końca 3’ DNA. Substratem dla enzymu są dsDNA oraz hybrydy DNA‑RNA. Enzym umożliwia łączenie pęknięć w pojedynczych łańcuchach wchodzących w skład dsDNA. Może też łączyć ze sobą fragmenty DNA o tępych końcach z tym, że wydajność tego procesu jest znacznie niższa. Ligaza faga T4 potrzebuje do swojego działania ATP jako kofaktora. Jej zastosowanie to między innymi klonowanie molekularne, przyłączanie oligonukleotydowych linkerów lub adaptorów do DNA, naprawa pęknięć w dsDNA, dsRNA u hybrydach, oraz mutageneza miejscowo-specyficzna.

• Ligazy do swojej aktywności potrzebują jonów magnezu, oraz ATP (dla ligaz eukariotycznych i bakteriofagowych) lub NAD⁺ (dla ligaz bakteryjnych).

• Bufor z jonami stabilizuje enzym w roztworze, a jony magnezu wchodzą do centrum aktywnego wraz z ATP.

• Przynajmniej jeden z dwóch łączonych fragmentów musi mieć ufosforylowane grupy 5’, aby reakcja ligacji była efektywna.

• Insert w stosunku do wektora powinien być dodawany w odpowiednim nadmiarze, zależy on od końców insertów – gdy będzie go bardzo dużo, ligaza będzie łączyć inserty same ze sobą (tworzyć strukturę konkatameryczną). Żeby ograniczyć tworzenie struktur poliinsertów wklejanych do jednego miejsca restrykcyjnego nadmiar powinien mieścić się w przedziale 1,5x-7x.

• Do łączenia tępych końców często dodaje się glicerolu, aby próbkę zagęścić i zwiększyć prawdopodobieństwo styku tych końców.

• Transformacja komórek zapewnia ich przeżycie.

• Poprzez hodowle komórek na podłożu z karbenicyliną można było wyizolować szczepy, w których poprawnie zaszła reakcja wklejana insertu.

• Orientacyjny wynik po ligacji. Na płytce po lewej ligacja zaszła, gdyż wektor był odpowiednio defosforylowany. Na płytce po prawej obecność klonów może świadczyć o samoligacji lub pobraniu plazmidu, gdyż nie został on dotrawiony do końca. Inne możliwości to izoschimeryzacja i neoschimeryzacja.

• Możlwiości sprawdzenia, czy wektor został poprawnie wstawiony i czy jego orientacja jest prawidłowa to m.in. izolacja DNA z kilku szczepów, następnie preparacja plazmidowego DNA, odtrawienie insertu BamHI i elektroforeza, testy EMSA, sekwencjonowanie DNA, czy PCR kolonijny.

Stopień religacji wektora pGEX-2T wyniósł:

$$Stopien\ religacji = \ \frac{liczba\ kolonii\ na\ plytce\ kontrolnej}{liczba\ kolonii\ na\ plytce\text{\ po\ ligacji}} = \frac{\mathbf{7}}{\mathbf{928}}\mathbf{\bullet 100 = 0,75\%}$$

LITERATURA.

Piśmiennictwo:

1. http://eportal-ch.pwr.wroc.pl/file.php/133/WYNIKI_-_M._Orlowski/2012-2013_-_Semestr_letni/M._Orlowski_-_PONIEDZIALEK_13_15.pdf

2. http://eportal‑ch.pwr.wroc.pl/file.php/133/INSTRUKCJE_2012_2013_zima/Inzynieria_Genetyczna_-_Instrukcja_5.pdf; 14.04.2013; 20:46

3. http://www.phmd.pl/fulltxthtml.php?ICID=955129; 14.04.2013; 20:46

4. http://sklep-aabiot.com/pl/p/Ligaza-T4-DNA-1000U/131; 14.04.2013; 20:48

Inne

1. Materiał omówiony na zajęciach laboratoryjnych