Data wykonania ćwiczenia: 11.03.2013

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Inżynieria genetyczna – laboratorium

Sprawozdanie nr 2

1. CEL ĆWICZENIA:

Celem tego ćwiczenia było przygotowanie plazmidu pGEX-2T do klonowania. W tym celu wykonano elektroforezę preparatywną zlinearyzowanego i defosforylowanego plazmidu otrzymanego w ćwiczeniu numer 1. Elektroforeza preparatywna umożliwia izolację z żelu tej części preparatu, którą zamierzamy użyć do dalszej analizy. Następnie otrzymany DNA wyeluowano z żelu agarozowego metodą Gel-Out^®.

1. ODCZYNNIKI ORAZ APARATURA:

Odczynniki chemiczne oraz biochemiczne

1. Bufor TBE

   • 890 mM EDTA

   • 890 mM kwas borny

   • 20 mM EDTA

2. Bufor do nanoszenia próbek na żel agarozowy (6xSB)

   • 100 mM EDTA

   • 20% (w/v) fikol 400

   • 0,25% (w/v) błękit bromofenolowy

   • 0,25% (w/v) ksylenocyjanol

3. Odczynniki użyte w elucji DNA z żelu agarozowego: roztwór R7S, izopropanol, roztwór A1

4. Marker wagowy Fast Ruler^™ DNA Ladder, Middle Range, (MBI Fragments).

5. Bufor TE

   • 10 mM Tris-HCl pH 7,4

   • 1 mM EDTA

Aparatura chemiczna

1. Aparat do wykonywania elektroforezy BIO-RAD

2. Skalpel oraz ‘X-tracta’ do pobierania prążków DNA z żelu agarozowego

3. 3 pipety automatyczne Eppendorf o zakresach objętości 2 μl - 20 μl, 20 μl‑200 μl oraz 200 μl - 1000 μl

4. Wirówka stołowa Eppendorf

5. Aparat do naświetlania żelu agarozowego światłem ultrafioletowym

6. Termomikser Eppendorf

1. SKŁAD MIESZANIN WYKORZYSTANYCH W DOŚWIADCZENIU:

• Skład próbki do naniesienia na żel preparatywny:

• 20 µl mieszaniny po defosforylacji

• 4 µl 6xSB – bufor do nanoszenia próbek na żel agarozowy

= 24 µl

1. METODYKA EKSPERYMENTU:

A) Przygotowanie plazmidu pGEX-2T do klonowania – elektroforeza preparatywna zlinearyzowanego i defosforylowanego plazmidu.

W celu wykonania elektroforezy pobrano z lodówki próbkę zlinearyzowanego i defosforylowanego plazmidu pGEX-2T oraz bufor TE. Próbki rozmrożono w temperaturze pokojowej. W między czasie przygotowano aparat do elektroforezy i wylano żel agarozowy o stężeniu 0,8% zawierający bromek etydyny. Aparat do elektroforezy wypełniono buforem TBE. Do rozmrożonej próbki o objętości 20 µl zawierającej plazmid pGEX-2T dodano 4 µl sześciokrotnie stężonego buforu SB. Tak przygotowaną mieszaninę inkubowano w termomikserze Eppendorf w temperaturze 65 °C przez 15 minut. Wykonano to w celu dodatkowej denaturacji kompleksu fosfataza‑DNA. Po tym czasie próbkę schłodzono i nałożono na wcześniej przygotowany żel agarozowy. Do pierwszej studzienki dodano 7 µl markera wagowego FastRuler™ DNA Ladder, Middle Range, a do pozostałych po 24 µl przygotowanych próbek - każda grupa nałożyła swoją próbkę. Elektroforezę prowadzono przy stałym napięciu 80 V przez 29 minut. Po elektroforezie żel wyjęto z aparatu BIO‑RAD i umieszczono nad lampą UV. Żel analizowano przy długości fali 365 nm. Każda grupa zlokalizowała prążek zawierający ich próbkę. Prążki z DNA wycięto za pomocą narzędzia "x-tracta^™ Gel Extractor tool"  firmy Promega i umieszczono we wcześniej zważonych probówkach Eppendorfa. Probówka przed dodaniem żelu ważyła 1,005 g, natomiast po dodaniu żelu 1,076g, więc masa żelu wynosiła 71 mg.

B) Elucja DNA z żelu agarozowego metodą Gel-Out (A&A Biotechnology)

Następnie przystąpiono do elucji DNA z żelu agarozowego metodą Gel-Out^®. W tym celu dodano do probówki 400 µl roztworu R7S. Roztwór ten służy do rozpuszczenia żelu agarozowego. Następnie po wymieszaniu probówke inkubowano w termomikserze w temperaturze 50 °C przy obrotach 500 rpm do momentu aż cały żel się rozpuścił. Po inkubacji do probówek dodano 200 µl izopropanolu w celu wytrącenia DNA. Otrzymaną mieszaninę naniesiono na kolumnę służącą do oczyszczania DNA zawierającą złoże krzemionkowe i całość odwirowano w wirówce stołowej przez 30 sekund przy obrotach 10000 rpm. Po wirowaniu kolumnę przeniesiono do czystej probówki Eppendorfa, a przesącz odrzucono. Na kolumnę naniesiono 600 µl roztworu A1. Roztwór ten zawiera alkohol o stężeniu około 82 % i służy przepłukaniu i oczyszczeniu DNA zatrzymanego na złożu. Całość ponownie wirowano przez 30 sekund przy obrotach 10000 rpm. Po wirowaniu kolumnę ponownie przeniesiono do czystej probówki Eppendorfa, przesącz odrzucono, a na kolumnę naniesiono 300 µl roztworu A1. Tym razem wirowano przez 2 min przy obrotach 10000 rpm. Po tym czasie kolumnę przeniesiono do czystej probówki Eppendorfa i ze względu na to, że była jeszcze trochę wilgotna ponownie całość odwirowano przy obrotach 10000 rpm, ale przez 1 minutę. Następnie kolumnę przeniesiono do następnej czystej probówki i pozostawiono na około 3 minuty do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Po tym czasie na kolumnę nałożono 15 µl buforu TE. Jest to bufor o niskiej sile jonowej i służy usunięciu DNA ze złoża. Całość krótko zwirowano, a następnie dodano drugą porcję 15 µl buforu TE. Tym razem pozostawiono całość na 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie wirowano przez 1 minutę przy obrotach 10000 rpm. Objętość przesączu zawierającego zlinearyzowany, defosforylowany i oczyszczony plazmid pGEX-2T oraz bufor TE wynosiła 27 µl. Objętość ta w innych grupach mogła wynieść więcej, ponieważ grupy te nie wykonały dodatkowego wirowania i kolumna mogła być nie do końca wysuszona i mogła zawierać znaczne ilości roztworu A1. Tak otrzymany preparat umieszczono w celu przechowywania w temperaturze - 20 °C.

1. KOMENTARZ I WNIOSKI:

• Elektroforeza została wykonana poprawnie, gdyż po naświetleniu żelu światłem ultrafioletowym obserwowano charakterystyczne prążki kwasu DNA z EtBr, który interkalował między zasady azotowe.

• Nie można stwierdzić, czy procedura elucji została wykonana poprawnie, gdyż DNA po doświadczeniu nie poddano analizie jakościowej.

1. LITERATURA:

Piśmiennictwo

• Instrukcja do ćwiczenia nr 2 z Inżynierii Genetycznej:

http://eportal-ch.pwr.wroc.pl/file.php/133/INSTRUKCJE_2012_2013_zima/Inzynieria_Genetyczna_-_Instrukcja_2.pdf

Inne

• Informacje z zajęć laboratoryjnych.