Inżynieria Genetyczna

Sprawozdanie – Ćwiczenie nr 1

Data wykonania ćwiczenia: 4 marca 2013 r.

Cel ćwiczenia:

• Strawienie wektora plazmidowego pGEX-2T, wyizolowanego ze szczepu bakteryjnego w miejscu MCS, restryktazą BamHI w celu przygotowania go do klonowania.

• Przeprowadzenie analizy elektroforetycznej strawionego wektora pGEX-2T w żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny.

• Defosforylacja zlinearyzowanego plazmidu alkaliczną fosfatazą Fast-AP^TM w celu usunięcia grup fosforanowych z końców 5’PO₃^2- wektora i przygotowania go do klonowania.

Aparatura i odczynniki chemiczne:

Spis aparatury laboratoryjnej

Spis zastosowanych odczynników chemicznych i biochemicznych

3 pipety automatyczne Eppendorf o zakresach objętości 2 μl - 20 μl,  20 μl - 200 μl oraz 200 μl - 1000 μl Wirówka stołowa Eppendorf Komora inkubacyjna Aparat do elektroforezy BIO-RAD Aparat do naświetlania żelu agarozowego światłem ultrafioletowym

Superskręcony wektor bakteryjny pGEX-2T Enzym restrykcyjny BamHI Bufor do prawidłowego działania restryktazy BamHI: 100 mM TRIS/HCl (pH 8.0) + 50 mg MgCl2 + 1 M KCl + 0,2% Triton X-100 + 1 mg/ml BSA Bufor TRIS+EDTA (TE): 10 mM TRIS-HCl pH 7.4 Bufor TRIS+Kwas borny+EDTA (TBE): 890 mM TRIS + 890 mM kwas borny + 20 mM EDTA pH 8.3 Bufor sodowo-boranowy (SB): 100 mM EDTA + 20% (w/v) fikol 400 + 0,25% (w/v) błękit bromofenolowy + 0,25% ksylenocyjanol Fosfataza alkaliczna Fast-AP^TM (Fermentas) Bromek etydyny Żel agarozowy 0,8% Woda destylowana H20miliQ auto Marker wagowy FastRuler^TM (MBI Fermentas)

Skład mieszanin reakcyjnych wykorzystanych w ćwiczeniu:

1. Mieszanina na siedmiokrotne trawienie wektora pGEX-2T (MIX):

• 7 μl BamHI (10 U/ μl)

• 10,5 μl buforu BamHI⁺ (10x)

• 73,5 μl H₂0_{miliQ auto}

= 91 μl

1. Próbka do reakcji trawienia z wektorem pGEX-2T:

• 2 μl pGEX-2T (2 μg plazmidowego DNA)

• 13 μl MIX

= 15 μl

1. Próbka kontrolna bez zawartości enzymu:

• 2 μl pGEX-2T (2 μg plazmidowego DNA)

• 1,5 μl buforu BamHI⁺ (10x)

• 11,5 μl H₂0_{miliQ auto}

= 15 μl

1. Próbka wektora pGEX-2T do elektroforezy:

• 3 μl mieszaniny po trawieniu wektora pGEX-2T ( w kontroli 3 μl próbki kontrolnej)

• 8 μl buforu TE

• 2 μl buforu do próbek SB (6x)

= 12 μl

1. Mieszanina do defosforylacji wektora:

• 12 μl mieszaniny po trawieniu wektora pGEX-2T

• 6 μl buforu BamHI⁺ (1x)

• 1 μl fosfatazy alkalicznej FastAP^TM

= 19 μl

Metodyka przeprowadzonych eksperymentów:

1. Przygotowanie plazmidu pGEX-2T do klonowania – trawienie enzymem BamHI

• Pobrano do eppendorfki podaną w mieszaninie (Skład mieszanin reakcyjnych wykorzystanych w ćwiczeniu – nr 2) objętość bakteryjnego wektora plazmidowego pGEX-2T. Oddzielnie wykonano roztwór MIX o składzie podanym powyżej (Skład mieszanin reakcyjnych wykorzystanych w ćwiczeniu – nr 1) , z którego do eppendorfki z wektorem pobrano 13 μl. Kolejność dodawania odczynników w roztworze MIX była następująca: woda destylowana H₂O_miliQ, bufor BamHI⁺, enzym BamHI.

• Całość włożono do wirówki stołowej i odwirowano (2 min.; 5krpm)

• Po odwirowaniu mieszaninę reakcyjną włożono do komory cieplnej i inkubowano przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

1. Analiza elektroforetyczna strawionego wektora pGEX-2T

• Strawione DNA poddano rozdziałowi elektroforetycznemu w przygotowanym przed doświadczeniem żelu agarozowym z dodatkiem EtBr (0,4 μg/ml).

• Żel podgrzano do temperatury w którym się upłynnił, następnie wylano do sanek aparatu do elektroforezy BIO-RAD i zalano buforem 1x TBE. Wymiary żelu: 81x56x3 mm.

• Na żel naniesiono próbki o składzie podanym w mieszaninie (Skład mieszanin reakcyjnych wykorzystanych w ćwiczeniu – nr 4)

• z każdej grupy, a także próbkę kontrolną o takiej samej objętości (12 μl) i marker wagowy FastRuler^TM o objętości 5 μl.

• Włączono aparaturę i prowadzono elektroforezę pod stałym napięciem 70 V przez około godzinę.

• Pobrano żel i naświetlono go światłem UV o długości fali 254 nm. Odczytano wyniki.

1. Defosforylacja zlinearyzowanego restryktazą plazmidu przy użyciu alkalicznej fosfatazy

• Otrzymany zlinearyzowany plazmid poddano działaniu fosfatazy alkalicznej Fast-AP^TM. W tym celu wykonano mieszaninę (Skład mieszanin reakcyjnych wykorzystanych w ćwiczeniu – nr 5) a dodawany bufor dziesięciokrotnie rozcieńczono dodając do 5 μl buforu BamHI (10x) 45 μl wody destylowanej H₂O_miliQ.

• Reakcję nastawiono w komorze inkubacyjnej o ustalonej temperaturze 37 stopni Celsjusza, którą po zajęciach dokończył prowadzący.

• Próbki przechowywano w buforze TE w temperaturze -20 stopni Celsjusza.

Wyniki elektroforezy

Komentarz i wnioski:

• Enzym BamHI rozciął superskręcony kolisty wektor w charakterystycznym dla siebie miejscu znajdującym się na polilinkerze (MCS) z utworzeniem lepkich końców, co skutkowało linearyzacją całego plazmidu w celu przygotowania go do klonowania. Enzym znajdował się w optymalnych dla siebie warunkach dzięki zawartości buforu (BamHI – MBI Fermentas), w którym znajdował się Triton X‑100 stabilizujący restryktazę, BSA (albumina z surowicy wołowej), która, jako neutralne białko nie interferujące z aktywnością restryktazy stwarzała warunki przypominające środowisko in vivo działania BamHI, oraz KCl zapewniającym odpowiednią siłę jonową.

• Elektroforeza dzięki zawartości bromku etydyny, który interkaluje między DNA umożliwiła naświetlenie żelu światłem UV (długość fali 254 nm, aby nie uszkodzić struktury DNA między innymi przez stworzenie niestandardowych połączeń reszt tymidynowych), drogę przebytą przez DNA ukazując prążki, które po odniesieniu do markera można ocenić pod względem ich długości. Barwnikiem do nanoszenia próbek był bufor z zagęstnikiem (fikol), chelator EDTA (inaktywacja restryktazy poprzez wiązanie jonów magnezu) oraz dwoma indykatorami: błękitem bromofenolowym (300 pz) oraz ksylenocyjanolem (5000 pz), nie interkalującymi DNA, a pozwalającymi jedynie śledzić przebieg elektroforezy. Bufor TE posłużył natomiast do zapewnienia optymalnego pH DNA (dzięki TRIS-HCl), i oczyszczenia go, a także ochronie przed działaniem endonukleaz.

• Defosforylacja zlinearyzowanego plazmidu alkaliczną fosfatazą FastAP^TM pozbawiła wektor grup fosforanowych na jego końcach 5’, aby zapobiec ponownemu łączeniu się jego lepkich końców i umożliwienia bezpiecznego wstawienia do niego insertu.

• Elektroforeza ukazała prawidłowy rozdział prążków markerowych FastRuler^TM, co oznacza że warunki przeprowadzanej elektroforezy były prawidłowe.

• Wyniki elektroforezy dla próbki kontrolnej ukazały cienki prążek na wysokości ok. 5000 pz., który prawdopodobnie odpowiada części niestrawionego wektorowego i superskręconego DNA, niezanieczyszczonego elementami białkowymi lub cząsteczkami RNA, natomiast położony wyżej gruby prążek stanowi część zanieczyszczoną tego DNA.

• Wyniki wszystkich grup pokazały, iż otrzymano strawiony zlinearyzowany wektor pGEX-2T o długości 4948 pz.; prążki charakteryzują się podobną intensywnością, natomiast w gr. II oraz III widoczny jest ślad nad prążkiem, spowodowany nakłuciem dna studzienki tipsem pipety.

Literatura

- piśmiennictwo

• Instrukcja do ćwiczenia nr 1 z Inżynierii Genetycznej:

http://eportal-ch.pwr.wroc.pl/course/view.php?id=133

- inne

• Omówiony materiał na zajęciach laboratoryjnych.