Data wykonania ćwiczenia: 15.04.2013

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Inżynieria genetyczna – laboratorium

Sprawozdanie nr 6

1. WSTĘP:

Celem ćwiczenia była indukcja ekspresji domeny wiążącej DNA receptora ekdysteroidowego (EcRDBD) z plazmidu pGEX-2T, w komórkach Escherichia coli szczepu XL1-Blue. Induktorem używanym w doświadczeniu jest izopropylotiogalaktozyd (IPTG). Nasz wektor posiada powtórzone sekwencje operatorowe i gen represora lac. IPTG wiążąc się z represorem uniemożliwia mu wiązanie się w obrębie operatora i tym samym indukuje ekspresję genu. Ekspresjonowane EcRDBD będą następnie analizowane w kolejnym ćwiczeniu za pomocą elektroforezy SDS‑PAGE [1].

1. ODCZYNNIKI I APARATURA [1]:

Odczynniki:

1. Płynna pożywka LB zawierająca karbenicyline w stężeniu końcowym 50 µg/ml

2. Dwukrotnie stężony bufor do nanoszenia próbek na żel poliakrylamidowy

   • 124 mM TRIS-HCl ph 6,8

   • 4% (w/v) SDS

   • 10% (v/v) β-merkaptoetanol

   • 20% (v/v) glicerol

   • 0,005% (w/v) błękit bromofenolowy

3. Roztwór ZnCl₂ o stężeniu 0,1 M

4. Roztwór IPTG o stężeniu 0,5 M

5. Roztwór karbenicyliny o stężeniu 100 mg/ml

Aparatura:

1. Kolby Erlenmajera o pojemności 250 ml

2. Szalki Petriego

3. 3 pipety automatyczne Eppendorf o zakresach objętości 2 µl - 20 µl, 20 µl‑200 µl oraz 200 µl - 1000 µl

4. Spektrofotometr

5. Probówki Eppendorfa

1. WYKONANIE ĆWICZENIA.

   1. Analiza klonów po ligacji i przygotowanie inokulum.

Z płytki po ligacji pobrano kilka koloni i zaszczepiono nimi 3 ml płynnej pożywki LB zawierającej karbenicylinę o stężeniu końcowym 50 μg/ml . Tak przygotowane hodowle inkubowano przez 12 godzin na wytrząsarce rotacyjnej w temperaturze 37 °C przy 182 obr/min. Po tym czasie wyizolowano plazmidowe DNA oraz zidentyfikowano wektor z prawidłowo wklonowanym insertem. W tym celu wykorzystano mikropreparację: trawienie enzymami restrykcyjnymi oraz technikę PCR.

Bakteriami szczepu XL1-Blue posiadającymi prawidłowy wektor zaszczepiono płytkę z medium LB zawierającym karbenicylinę i inkubowano przez 12 godzin w temperaturze 37 °C. Po tym czasie z płytki pobrano jedną kolonię i zaszczepiono nią 10 ml płynnej pożywki LB zawierającej karbenicylinę. Hodowle inkubowano w temperaturze 37 °C przy 182 obr/min. aż do pojawienia się wyraźnego zmętnienia. Podobnie przygotowano hodowle zawierające wyjściowy plazmid pGEX-2T.

1. Indukcja ekspresji EcRDBD

Do czystych kolb Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierających 50 ml płynnej pożywki LB dodano 25 µl roztworu karbenicyliny tak, by rozcieńczyć antybiotyk 2000 razy. Następnie do tych probówek dodano po 6 ml zawiesiny komórek przygotowanych w pierwszej części - do jednej kolby komórki zawierające wektor z wbudowanym insertem, a do drugiej komórki zawierające wektor bez insertu. Kolby umieszczono w wytrząsarce rotacyjnej i inkubowano w temperaturze 37 °C przy 182 obr./min.

Po 50 minutach pobrano próbkę i zmierzono gęstość optyczną hodowli przy długości fali 600 nm. Wynosiła ona 0,865 dla hodowli zawierającej wektor z insertem i 0,906 dla hodowli zawierającej wektor bez insertu. Z obu kolb pobrano po 1 ml hodowli i umieszczono w probówkach Eppendorfa. Probówki umieszczono w wirówce Eppendorafa i wirowano przez 90 sekund przy 13400 rpm. Po tym czasie supernatant odrzucono, a osad bakterii zawieszono w 75 µl buforu 2xSB do nanoszenia próbek na żel poliakrylamidowy. Następnie do kolb dodano po 28 µl roztworu ZnCl₂ i roztworu IPTG i prowadzono dalszą inkubację przy tych samych parametrach.

Obliczenie ilości dodawanych ZnCl₂ oraz IPTG (V_K = 55 ml):

a) ZnCl₂

$$R_{\text{ZnC}l_{2}} = \frac{0,1\ M}{50 \bullet 10^{- 6}M} = 2000$$

$$V_{\text{ZnC}l_{2}} = \frac{55}{2000} = 0,0275\ ml \approx 28\ \mu l$$

b) IPTG

$$R_{\text{IPTG}} = \frac{0,5\ M}{0,25 \bullet 10^{- 3}M} = 2000$$

$$V_{\text{IPTG}} = \frac{55}{2000} = 0,0275\ ml \approx 28\ \mu l$$

Po 15 minutach pobrano próbkę z kolby zawierającej komórki z wektorem posiadającym insert i zmierzono ich gęstość optyczną. Wyniosła ona 1,010. Więc w celu standaryzacji ilości komórek wykonano proste obliczenie:

$$\frac{0,865}{1,010} \times 1000\mu l = 856\mu l$$

-0,865 - gęstość optyczna po czasie 0

-1,010 - gęstość optyczna próbki po 15 minutach

-1000 µl - objętość próbki po czasie 0

Tak więc do probówki Eppendorfa dodano 856 µl, odwirowano przez 90 sekund przy obrotach 13400 rpm, supernatant odrzucono, a do osadu dodano 75 µl buforu do nanoszenia próbek na żel poliakrylamidowy.

Kolejne próbki pobrano po 30 minutach, 1 godzinie i po 2 godzinach. Po 2 godzinach pobrano dodatkowo próbkę z hodowli posiadającej wektor bez insertu. Zmierzono gęstość optyczną i wynosiła ona kolejno: 1,060; 1,144; 1,215; 1,257 (dla kontroli). Na podstawie zmierzonej gęstość optycznej obliczono objętość jaką należy przenieść do probówki Eppendorfa i wynosiła ona odpowiednio: 813 µl, 756 µl, 712 µl, 716 µl. Po odwirowaniu postępowano tak samo jak z wcześniejszymi próbkami.

Po przygotowaniu wszystkich próbek zamrożono je w -20 °C.

1. KOMENTARZ I WNIOSKI.

Tabela 1 – Gęstości próbek inkubowanych w czasie .

Czas inkubacji [min]	OD600 pGEX − 2T/EcRDBD	OD600 pGEX − 2T
0	0,865	0,900
15	1,010
30	1,060
60	1,144
120	1,215	1,257

Tabela 2 - Objętości próbek inkubowanych w czasie do standaryzacji.

Czas inkubacji [min]	V pGEX − 2T/EcRDBD [μl]	V pGEX − 2T [μl]
0	1000	1000
15	856
30	813
60	756
120	712	716

• W wektorze pGEX-2T ma miejsce konstytutywna ekspresja lac represora, która obsadza miejsca operatorowe genu. Inicjacja transkrypcji zachodzi, gdy IPTG wysyci obecne represory laktozowe.­ – Jest to kontrola indukcji ekspresji rekombinowanego białka wykorzystująca elementy natywnego wektora prokariotycznego [2].

• Chlorek cynku odpowiedzialny jest za tworzenie modułów palców cynkowych, które w domenie wiążącej DNA receptorów jądrowych utrzymywane są przez cztery reszty cysteinylowe [2].

• Ekspresjonowane białko na końcu aminowym ma sekwencję enzymu - glutationo-S-transferazy (GST), która to jest białkiem hybrydowym.

• Bufor Tris-HCl zapewnia optymalne pH mieszaniny i odpowiada za jej stabilizację [2].

• Glicerol jest często stosowanym zagęszczaczem próbek, czasami można też używać 10-20% sacharozy [2].

• Błękit bromofenolowy zastosowany został jako indykator postępu elektroforezy, natomiast beta-merkaptoetanol w celu redukcji mostków disiarczkowych (aby nie zaburzać warunków elektroforezy, a także nie umożliwiać tworzenia potencjalnych nowych mostków cysteinowych w warunkach utleniających, dlatego też w białkach, w których znajdują się reszty cysteinylowe nie tworzące mostków, powinno się raczej prowadzić procedurę z czynnikiem redukującym). Inne reduktory to DTT (ditiotreitol) [2].

• Sprawdzano, czy zaszła liza komórek poprzez obserwowanie tzw. efektu gluta, czyli zwiększonej lepkości roztworu z mikroorganizmami po ich lizie [2].

LITERATURA.

Piśmiennictwo

[1] – Instrukcja do ćwiczenia nr 6 laboratorium z inżynierii genetycznej –

http://eportal-ch.pwr.wroc.pl/file.php/133/INSTRUKCJE_2012_2013_zima/Inzynieria_Genetyczna_-_Instrukcja_6.pdf

data skorzystania: 20.04.2013

Inne

[2] – notatki z zajęć