MIKROBIOLOGIA - ćwiczenia 10.05.2010

WYKRYWANIE MECHANIZMÓW OPORNOŚCI

• Wrażliwość mikrobiologiczna - oznacza,że szczep należy do najbardziej wrażliwej populacji (szczep dziki) i nie posiada żadnych mechanizmów oporności

• Wrażliwość kliniczna - wrażliwość drobnoustroju na standardowe dawki leków. Def. ta oparta jest na ocenie wrażliwości In vitro na dany antybiotyk, jego właściwości farmakokinetycznych i farmakochemicznych, a zwłaszcza w okreś. . . .do osiągnięcia stężenia . . . w miejscu zakażenia.

• Oporność mikrobiologiczna - oznacza, że organizm posiada mechanizm oporności demonstrowany genotypowo lub fenotypowo. Może być to oporność niskiego lub wysokiego stopnia

• Oporność kliniczna - sukces terapeutyczny jest niemożliwy pomimo stosowania maksymalnych dawek leku

• Oporność krzyżowa - niewrażliwość na wszystkie lub niektóre antybiotyki należące do tej samej grupy chemicznej (np. antybiotyki β-laktamowe,aminoglikozydy,makrolidy) lub czasem niespokrewnionej grupy chemicznej (gdy miejsca uchwytu dla antybiotyków znajdują się blisko siebie - np. oporność na makrolidy i linkozamidy)

• Oporność skojarzona - zjawisko oporności na więcej niż jedną grupę chemiczną antybiotyków, wynikające z braku przepuszczalności bł. kom. lub aktywnego wypompowywania leku z kom. bakteryjnej.

• Tolerancja - brak aktywacji enzymów autolitycznych przez antybiotyk beta-laktamowy i spadek lub brak jego działania bakteriobójczego bez utraty działania hamującego

PODZIAŁ MECHANIZMÓW OPORNOŚCI

a) ze względu na pochodzenie

• Oporność naturalna (gatunkowo specyficzna) - stała cecha gatunku, rodzaju, rodziny, itd. drobnoustroju, przekazywana podczas namnażania się bakterii, wynikająca z:

• braku receptora dla antybiotyku, np. poprzez przejście bakterii w formę L nie posiadającą ściany komórkowej lub jej naturalny brak jak u Mycoplasma pneumoniae

• z niskiego powinowactwa antybiotyku do receptora np. cefalosporyn do białek PBP Enterococcus

• a niedostępności antybiotyku do kom ( duże cząsteczki glikopeptydów i makrolidów nie penetrują przez błoną G(-) bakterii; cząsteczki aminoglikozydów nie penetrują do enterokoków

• z powodu wytwarzania enzymów hydrolizujących antybiotyk, np. karbapenemaz przez Stenotrophomonas maltophilia

• Oporność nabyta „importowana” - nowa cecha szczepu wynikająca ze zmian w materiale genetycznym,przekazywana do innych komórek drobnoustrojów,uzyskiwana w wyniku:

• mutacji chromosomalnych genu - np. dla miejsca wiążącego antybiotyk lub układu transportującego lek przez błoną

• w wyniku transferu informacji genetycznej (DNA) w drodze bezpośredniego kontaktu kom. tego samego lub odległych od siebie gatunków, rodzajów

b) ze względu na miejsce kodowania oporności

• Oporność chromosomalna - umożliwia przekazywanie wertykalne informacji genetycznej potomnym komórkom, częstotliwość mutacji raz na 10⁵ - 10⁸ kom. bakteryjnych

• Oporność plazmidowa - pojawia się u wielu gatunków bakterii, plazmidy mogą być przenoszone wertykalnie lub horyzontalnie na drodze koniugacji, transdukcji, transformacji

• Oporność int….

• Oporność transpozonowa

c) ze względu na ekspozycję fenotypową

• Oporność indukcyjna - inicjowana obecnością antybiotyków w środowisku związana z ciągłą ekspresją odpowiednich genów

• Konstytutywna - niezwiązana z obecnością antybiotyków w środowisku

d) ze względu na zasadę działania

• Inaktywacja cząsteczki leku przez enzymy hydrolizujące lub modyfikujące antybiotyk

• Zmiana miejsca docelowego wiązania antybiotyku z komórką

• Obniżenie stężenia leku w komórce bakteryjnej przez zablokowanie jego transportu do komórki

• Obniżenie przepuszczalnośći ściany komórkowej dla leku

• Aktywne wypompowywanie leku - efflux pomp

• Wytworzenie alternatywnych szlaków metabolicznych omijających etap hamowania przez lek

METODY WYKRYWANIA MECHANIZMÓW OPORNOŚCI NA ANTYBIOTYKI

β-LAKTAMOWE

Interpretacja mechanizmów oporności

Oporność plazmidowa nabyta oporność chromosomalna naturalna

β-laktamazy

• Enzymy hydrolizujące pierścień beta-laktamowy

• Bakterie Gram-dodatnie (zwłaszcza gronkowce)

• Pałeczki Enterobacteriaceae

• Pałeczki niefermentujące z rodzajów Pseudomonas, Acinetobacter

Podział :

• Ze względu na zdolność do hydrolizy antybiotyków beta-laktamowych oraz na działanie inhibitorów beta-laktamaz [4 klasy :1,2,3,4 -Bush, Jacoby, Medeiros]

• Ze względu na strukturę - sekwencje. . .

• klasy A, C, D - seryna w centrum aktywnym

• klasa B - 4 atomy cynku

• najbardziej rozpowszechnione są β-laktamazy A i C

Oporność:

• Synteza beta-laktamaz (pałeczki Gram-ujemne i gronkowce)

• Zmniejszone powinowactwo białek PBP oraz synteza nowego białka PBP2' (gronkowce)

• Zmiana struktury białka PBP (S.pneumoniae)

Penicylinazy

• 80% klinicznych izolatów gronkowców - beta-laktamazy o wąskim spektrum substratowym

• Geny bla Z, bla I, bla R1 zlokalizowane na plazmidach i transpozonach

• Hydrolizują : penicyliny naturalne, amino- oraz ureidopenicyliny

• Aktywne antybiotyki : penicyliny oporne na penicylinazy - metacylina, ksacylina oraz cefalosporyny, karbapenemy

• Wytwarzanie penicylinaz jest indukowane przez antybiotyki β-laktamowe

Klasyczne penicylinazy typu TEM,SHV

• Enzymy TEM-1, TEM-2, SHV-1 syntetyzowane przez szczepy Enterobacteriaceae

• Aktywne antybiotyki : cefalosporyny II,III,IV generacji,karbapenemy,monobaktamy oraz inhibitory beta-laktamaz (tazobaktam, sulbaktam, kwas klawulanowy)

β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym - ESBL

• Hydrolizują : penicyliny i cefalosporyny wszystkich generacji

• Pod względem pochodzenia : TEM, SHV, CTX-M,OXA,VER,PER

• K.pneumoniae, E.coli, Proteus spp., Providencia spp., Salmonella spp. oraz pałeczek niefermentujących - Pseudomonas spp., Acinobacter spp.

• Hamowanie przez inhibitory β-laktamaz, nadają nabytą oporność na:

- penicyliny ( z wyjątkiem temocyliny),

- cefalosporyny (w tym III i IV generacji)

- i aztreonam

- a przy wysokim poziomie ekspresji oporności, także na połączenia penicylin z inhibitorami

Cefalosporynazy AmpC

• Poziom β-laktamaz w komórce bakteryjnej może mieć charakter stały (ekspresja konstytutywna) lub regulowany (ekspresja indukowana)

• Ekspresja indukowana - komórka zaczyna produkować większą ilość β-laktamazy, wówczas gdy w środowisku bakterii pojawi się induktor

• Ekspresja konstytutywna - dotyczy enzymów wtórnych, których geny są zlokalizowane na plazmidach

(szczepy - wzrost poziomu ekspresji konstytutywnego enzymu AmpC - oporne lub średnio wrażliwe na beta-laktamy)

• Nie są hamowane przez inhibitory β-laktamaz

• Gatunkowo specyficzne

• O ekspresji indukowanej lub konstytutywnej na niskim poziomie (Enterobacter spp,C. freundii, Serratia spp., M.morganii, Providencia stuartii)

• Derepresorowe na wysokim poziomie (Pseudomonas spp.,Enterobacter spp.)

• Nadają oporność naturalną na aminopenicylinazy, cefalosporyny I i II generacji lub oporność nabytą (mutanty „zderepresowane”), penicyliny ( i połączone z inhibitorem β-laktamaz), cefalosporyny ( w tym III generacji), aztreonam

Metalo-β-laktamazy (MBL) (pałeczki niefermentujące)

• Gatunkowo specyficzne (kodowane chromosomalnie, np. u Stenotrophomonas maltophilia) lub nabyte (kodowane chromosomalnie lub plazmidowo,np. u Pseudomonas aeruginosa)

• Są enzymami zależnymi od jonów cynku, w swoim spektrum zawierają karbapenemy, nie są inaktywowane przez inhibitory β-laktamaz, ale są hamowane EDTA, kw. merkaptoprioponowy

MODYFIKACJA LUB SYNTEZA NOWEGU PUNKTU UCHWYTU (PBP)

- OPORNOŚĆ CHROMOSOMALNA - NABYTA

• Oporność gronkowców na meticylinę (MRSA,MRCNS)

• Synteza nowego białka PBP - PBP-2' lub PBP-2a pod wpływem genu mecA

• Skutkuje opornością na wszystkie antybiotyki β-laktamowe

• Oporność Enterococcus faecium na wszystkie antybiotyki β-laktamowe

• Zmiany w białkach PBP-5

• Oporność H.influenzae na penicyliny i penicyliny z inhibitorem β-laktamaz, cefalosporyny I i II generacji (szczepy BLNAR)

• Zmiany w białkach PBP-3

ZMIANA STRUKTURY BIAŁEK PBP (S.pneumoniae)

• Mutacja punktowa lub nabycie nowych genów kodujących zmienione białka PBP (geny mozaikowe)

• Różne fenotypy oporności na β-laktamy w zależności od mierzonego białka

• Zmiana w PBP 1a, 2b i 2x - oznacza oporność na penicyliny

• Zmiana w PBP 1a, 2b, 2a i 2x - oznacza wysoką oporność na penicyliny

Ten typ dotyczy ok. 14% szczepów izolowanych w Polsce

Zmiana przepuszczalności ściany komórkowej i błony zewnętrznej

METODY OZNACZANIA

Oporność na metycylinę - Staphylococcus spp.

Szczepy o tym fenotypie oporności:

MRSA - S. aureus oporny na meticylinę

MRCNS - gronkowce koagulozo-ujemne oporne na meticylinę

Szczepy bez tego mech. oporności

MSSA

MSCNS (Methicilin Sensitive Coagulase - Negative Staphylococcus)

( CN - koagulozo-ujemny )

Oznaczanie wrażliwości na beta-laktamy

• Test cefinazowy (w przypadku oznaczenia wytwarzania penicylinaz należy stosować krążek z nitrocefiną)

• Z punktu klinicznego istotna jest oporność gronkowców na meticylinę (MRSA,MRCNS)

• Szczepy oporne na meticylinę są oporne in vivo na wszystkie beta-laktamy

• Gronkowce oporne na metacylinę są wielooporne i mogą być oporne na tetracykliny, aminoglikozydy, makrolidy, , linkozamidy, często też na fluorochinolony, chloramfenikol, kotrimoksazol

Metoda dyfuzyjno-krążkowa z oksacyliną lub cefoksytyną

• Na podłoże MHA posiać wymazówką zawiesinę o gęstości 0,05⁰McF

• Nanieść krążek z oksacyliną 1μg lub cefoksytyną 30μg

• Inkubacja w atmosferze tlenowej w 35⁰C/24h

• Odczyt: wykonanie pomiaru strefy zahamowania wzrostu w świetle przechodzącym. Interpretacja według zaleceń CLSI

• Wykazano, że cefoksytyna może być lepszym wskaźnikiem oporności na meticylinę ( można w ten sposób identyfikować oporność na metacylinę wszystkich gronkowców)

Metoda przeglądowa z oksacyliną dla S.aureus (nie jest zalecana dla CNS)

• Podłoże MHA z oksacyliną w stężeniu 6 mikrogramów/l i dodatkiem 94% NaCl<?>

• . . .

• Inkubacja 24h w temp. 35⁰C w atm. Tlenowej

• Odczyt: wzrost więcej niż jednej kolonii oznacza oporność na metacylinę

Testy wykrywające białka PBP2a (PBP2' ), nowego białka, produkt genu Meca, oznacza oporność na metacylinę

• MRSA

• Slidex - MRSA

• Oxoid PBP2' - DR300M (Oxoid)

Wykrywanie oporności S.pneumoniae na beta-laktamy

• Podłoże MHA z 5% krwi baraniej

• Zawiesina 0,5⁰McF

• Inkubacja 20-24h w 35⁰C w atm. 5% CO₂

• Krążek oksacyliny - 1mikrogram/ml

• ….

• …..

• Szczepy oporne na penicylinę są oporne na cefalosporyny I i II generacji, a niekiedy też III; oporności tej zazwyczaj towarzyszy oporność na tetracykliny, makrolidy, kotrimoksazol i chloramfenikol

( * oznaczanie wartości MIC - E-Testy lub w bulionie)

Wykrywanie beta-laktamaz o szeroki spektrum substratowym typu TEM i SHV

• Enzymy wykrywane są za pomocą krążka z nitrocefiną (test cefinazowy)

• Kiedy średnica strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z ampicyliną ≤ 17mm to wtedy mamy szczep oporny

Wykrywanie beta-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym typu ESBL

1. Oznaczanie ESBL metodą dwóch krążków (dla oznaczania ESBL wszystkich gatunków Enterobacteriaceae,a także u pałeczek niefermentujących)

- Używa się w niej 3 antybiotyków : ceftazidim _CAZ, cefotaksym i cefpodoksym lub aztreonam, ułożonych w odległości 2cm (pomiędzy środkami) od krążka z inhibitorem beta-laktamaz (amoksycylina z kwasem klawulonowym)

- wynik dodatni testu - powstanie lub powiększenie strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z ceftazidimem _CAZ lub cefotaksymem ( i lub wokół krążka z cefpodoksymem) od strony krążka z amoksycyliną z kwasem klawulonowym)

2. Oznaczanie ESBL za pomocą E-testów: CAZ,CLA,CTX I CTX/CLA oraz FEP i FEP/CLA

• Wynik ESBL dodatni gdy iloraz MIC_CAZ/CLA : MIC_CAZ ≥ 4

( CAZ - ceftazydym; CTX - cefotaksym, CLA - kwas klawulonowy; FEP - cefepim)

Wykrywanie chromosomalnych beta-laktamaz typu AmpC

• Obecność chromosomalnych indukowanych beta-laktamaz typu AmpC można wykrywać wg metody dwóch krążków

• Jako substraty wykorzystuje się np. CAZ, CRO, CTX, FEP, jako induktor cefoksytyna lub imipenem. Odległość między brzegami krążków z substratami a krążkiem z induktorem powinna wynosić 8mm

• Inkubacja w takich samych warunkach jak w przypadku wykrywania ESBL

• Zmniejszenie strefy zahamowania wzrostu szczepu wokół krążków z ceftazydymem i ceftriaksonem od strony krążka z induktorem świadczy o wytworzeniu chromosomalnych beta-laktamaz AmpC

Metody wykrywania oporność MBL

• Porównanie średnic stref zahamowania wzrostu

• Stosuje się krążki z imipenemem _IPM oraz imipenem + 10 mikrolitrów 0,5M EDTA _IPI

• Interpretacja : różnica IPI - IPM ≥ 7 ← wynik dodatni

• Wysoka czułość i doskonała swoistość w przypadku szczepów P.aeruginosa

E-test MBL

• Pasek zawiera gradient stężenia imipenemu w zakresie od 4-256 mikrogramów oraz 1-64 w obecności 320mikrogramów EDTA

• Interpretacja : 8-krotny spadek wartości MIC imipenem w obecności EDTA lub pojawienie się strefy fantomowej wynik dodatni `+'

KPC - K.pneumoniae oporne na karbapenemy

• Oporność na wszystkie beta-laktamy

• Problem epidemiczny (wyjątkowa rozsiewalność,groźniejszy od ESBL - plazmid oporności przekazany od Salmonella spp.)

• Oporność plazmidowa

• Antybiotyki wrażliwe : tygecyklina,gentamycyna (łatwe nabywanie oporności),kolistyna (wycofana z użycia)

• Wykrywanie:

• na krążkach IMP nanieść 20mikrolitrów kw. borowego(boronowego?)

• ocena wyniku: różnica strefy zahamowania wzrostu IMP i IMP z kwasem boronowym ≥ 5-7mm mechanizm KPC

(zamiast krążka z IMP można używać ertapenem lub meropenem)

---