Monika Wrońska

Daria Świerczyńska

Dawid Piątkowski

LABORATORIUM Z BIOCHEMII.

ĆWICZENIE 2

BIAŁKA

Data wykonania ćwiczenia: 16.03.2011r.

Data oddania sprawozdania:23.03.2011 r.

Semestr IV

Grupa V

Środa 14¹⁵- 18⁰⁰

1. Wstęp teoretyczny:

Białka to wielkocząsteczkowe (masa cząsteczkowa od ok. 10 000 do kilku mln Daltonów) biopolimery, a właściwie biologiczne polikondensaty, zbudowane z reszt aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi -CONH-. Występują we wszystkich żywych organizmach oraz wirusach. Synteza białek odbywa się przy udziale specjalnych organelli komórkowych zwanych rybosomami.

Zazwyczaj liczba reszt aminokwasowych pojedynczego łańcucha polipeptydowego jest większa niż 100, a cała cząsteczka może być zbudowana z wielu łańcuchów polipeptydowych (podjednostek).

Głównymi pierwiastkami wchodzącymi w skład białek są C, O, H, N, S, także P oraz niekiedy kationy metali Mn²⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, Fe²⁺, Cu²⁺, Co²⁺ i inne.

Ze względu na skalę przestrzenną pełną strukturę białka można opisać na czterech poziomach:

• Struktura pierwszorzędowa białka (sekwencja aminokwasów, struktura pierwotna białka) - kolejność aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym

• Struktura drugorzędowa białka - przestrzenne ułożenie fragmentów łańcuchów polipeptydowych. Do struktur drugorzędowych zaliczana jest:

• helisa alfa (ang. α helix)

• harmonijka beta (ang. β sheet)

• beta skręt (pętle omega) (ang. β hairpin)

• Struktura trzeciorzędowa białka - wzajemne położenie elementów struktury drugorzędowej.

• Struktura czwartorzędowa białka - wzajemne położenie łańcuchów polipeptydowych oraz ewentualnie struktur niebiałkowych (grupa prostetyczna):

• cukrów w glikoproteidach

• lipidów w lipoproteidach

• kwasów nukleinowych w nukleoproteidach

• barwników w chromoproteidach

• resztę kwasu fosforowego w fosfoproteidach.

Białka nie posiadają charakterystycznej dla siebie temperatury topnienia. Przy ogrzewaniu w roztworze, a tym bardziej w stanie stałym, ulegają, powyżej pewnej temperatury, nieodwracalnej denaturacji (ścinanie się włókien białka) - zmianie struktury, która czyni białko nieaktywnym biologicznie (codziennym przykładem takiej denaturacji jest smażenie lub gotowanie jajka). Jest to spowodowane nieodwracalną utratą drugo-, trzeciorzędowej lub czwartorzędowej budowy białka. Denaturacja białek może również zachodzić pod wpływem soli metali ciężkich, mocnych kwasów i zasad, niskocząsteczkowych alkoholi, aldehydów oraz napromieniowania. Niewielka część białek ulega trwałej denaturacji pod wpływem zwiększonego stężenia soli w roztworze, jednak proces wysalania jest w większości przypadków w pełni odwracalny, dzięki czemu umożliwia izolowanie lub rozdzielanie białek. Wysalanie białek to strącanie białek z roztworów poprzez dodanie stężonego roztworu soli. Proces jest wynikiem zaburzenia otoczki solwatacyjnej i agregacji cząsteczek białek w wyniku łatwiejszego kontaktu pomiędzy polarnymi grupami sąsiadujących cząsteczek. Do wysalania stosuje się sole metalu lekkiego (np. KCl) lub amonu, np. siarczanu amonu^. Proces ten jest przejściem zolu w żel (koagulacja), nie narusza struktury białka i jest odwracalny (nie powoduje denaturacji). Białko najłatwiej wysolić w pH odpowiadającym jego punktowi izoelektrycznemu.

Białka są na ogół rozpuszczalne w wodzie. Do białek nierozpuszczalnych w wodzie należą tzw. białka fibrylarne, występujące w skórze, ścięgnach, włosach (kolagen, keratyna) lub mięśniach (miozyna). Niektóre z białek mogą rozpuszczać się w rozcieńczonych kwasach lub zasadach, jeszcze inne w rozpuszczalnikach organicznych. Na rozpuszczalność białek ma wpływ stężenie soli nieorganicznych w roztworze, przy czym małe stężenie soli wpływa dodatnio na rozpuszczalność białek. Jednak przy większym stężeniu następuje uszkodzenie otoczki solwatacyjnej, co powoduje wypadanie białek z roztworu. Proces ten nie narusza struktury białka, więc jest odwracalny i nosi nazwę wysalania białek. Białka posiadają zdolność wiązania cząsteczek wody. Efekt ten nazywamy hydratacją. Nawet po otrzymaniu próbki suchego białka zawiera ona związane cząsteczki wody.

Białka, ze względu na obecność zasadowych grup NH₂ oraz kwasowych COOH mają charakter obojnaczy - w zależności od pH roztworu będą zachowywały się jak kwasy (w roztworze zasadowym) lub jak zasady (w roztworze kwaśnym). Dzięki temu białka mogą pełnić rolę bufora stabilizującego pH, np. krwi. Różnica pH nie może być jednak znaczna, gdyż białko może ulec denaturacji. Wypadkowy ładunek białka zależy od ilości aminokwasów kwaśnych i zasadowych w cząsteczce. Wartość pH, w której ładunki dodatnie i ujemne aminokwasów równoważą się nazywany jest punktem izoelektrycznym białka.

Białka odgrywają zasadniczą rolę we wszystkich procesach biologicznych. Biorą udział w katalizowaniu wielu przemian w układach biologicznych (enzymy są białkami), uczestniczą w transporcie wielu małych cząsteczek i jonów (np. 1 cząsteczka hemoglobiny przenosząca 4 cząsteczki tlenu), służą jako przeciwciała oraz biorą udział w przekazywaniu impulsów nerwowych jako białka receptorowe. Białka pełnią także funkcję mechaniczno-strukturalną. Wszystkie białka zbudowane są z aminokwasów. Niektóre białka zawierają nietypowe, rzadko spotykane aminokwasy, które uzupełniają ich podstawowy zestaw. Wiele aminokwasów (zazwyczaj ponad 100) połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi tworzy łańcuch polipeptydowy, w którym można wyróżnić dwa odmienne końce. Na jednym końcu łańcucha znajduje się niezablokowana grupa aminowa (tzw. N-koniec), na drugim niezablokowana grupa karboksylowa (C-koniec).

Istnieje wiele kryteriów podziału białek.

Ze względu na budowę i skład, dzielimy białka na proste i złożone.
Białka proste (holoproteiny) zbudowane są wyłącznie z aminokwasów. Dzielimy je na następujące grupy:

1. protaminy - są silnie zasadowe, charakteryzują się dużą zawartością argininy oraz brakiem aminokwasów zawierających siarkę. Są dobrze rozpuszczalne w wodzie. Najbardziej znanymi protaminami są: klupeina, salmina, cyprynina, ezocyna, gallina.

2. histony - podobnie jak protaminy są silnie zasadowe i dobrze rozpuszczają się w wodzie; składniki jąder komórkowych (w połączeniu z kwasem deoksyrybonukleinowym), czyli są obecne także w erytroblastach. W ich skład wchodzi duża ilość takich aminokwasów jak lizyna i arginina.

3. albuminy - białka obojętne, spełniające szereg ważnych funkcji biologicznych: są enzymami, hormonami i innymi biologicznie czynnymi związkami. Dobrze rozpuszczają się w wodzie i rozcieńczonych roztworach soli, łatwo ulegają koagulacji. Znajdują się w tkance mięśniowej, osoczu krwi i mleku.

4. globuliny -w ich skład wchodzą wszystkie aminokwasy białkowe, z tym że kwas asparaginowy i kwas glutaminowy w większych ilościach; w odróżnieniu od albumin są źle rozpuszczalne w wodzie, natomiast dobrze w rozcieńczonych roztworach soli; posiadają podobne właściwości do nich. Występują w dużych ilościach w płynach ustrojowych i tkance mięśniowej.

5. prolaminy - są to typowe białka roślinne, występują w nasionach. Charakterystyczną właściwością jest zdolność rozpuszczania się w 70% etanolu.

6. gluteiny- podobnie jak prolaminy - to typowe białka roślinne; posiadają zdolność rozpuszczania się w rozcieńczonych kwasach i zasadach.

7. skleroproteiny - białka charakteryzujące się dużą zawartością cysteiny i aminokwasów zasadowych oraz kolagenu i elastyny, a także proliny i hydroksyproliny, nierozpuszczalne w wodzie i rozcieńczonych roztworach soli. Są to typowe białka o budowie włóknistej, dzięki temu pełnią funkcje podporowe. Do tej grupy białek należy keratyna.

Białka złożone (heteroproteiny):

1. chromoproteiny - złożone z białek prostych i grupy prostetycznej - barwnika. Należą tu hemoproteidy (hemoglobina, mioglobina, cytochromy, katalaza, peroksydaza) zawierające układ hemowy oraz flawoproteiny.

2. fosfoproteiny - zawierają około 1% fosforu w postaci reszt kwasu fosforowego. Do tych białek należą: kazeina mleka, witelina żółtka jaj, ichtulina ikry ryb.

3. nukleoproteiny - składają się z białek zasadowych i kwasów nukleinowych. Rybonukleoproteiny są zlokalizowane przede wszystkim w cytoplazmie: w rybosomach, mikrosomach i mitochondriach, w niewielkich ilościach także w jądrach komórkowych, a poza jądrem tylko w mitochondriach. Wirusy są zbudowane prawie wyłącznie z nukleoprotein.

4. lipidoproteiny - połączenia białek z tłuszczami prostymi lub złożonymi, np. sterydami, kwasami tłuszczowymi. Lipoproteiny są nośnikami cholesterolu (LDL, HDL, VLDL). Wchodzą na przykład w skład błony komórkowej.

5. glikoproteiny - ich grupę prostetyczną stanowią cukry, należą tu m.in. mukopolisacharydy (ślina). Glikoproteiny występują też w substancji ocznej i płynie torebek stawowych.

6. metaloproteiny - zawierają jako grupę prostetyczną atomy metalu (miedź, cynk, żelazo, wapń, magnez, molibden, kobalt). Atomy metalu stanowią grupę czynną wielu enzymów.

Białka dzielimy również ze względu na właściwości odżywcze - wyróżnia się białka doborowe i niedoborowe.

• BIAŁKA DOBOROWE (Pełnowartościowe) - te, które w swoim składzie zawierają wszystkie aminokwasy egzogenne. Do takich białek zaliczamy np. albuminę, białko jaja kurzego, białko mleka i mięsa.

• BIAŁKA NIEDOBOROWE (Niepełnowartościowe) - te w których brakuje choćby jednego aminokwasu egzogennego. Przykładem takiego białka jest kolagen, żelatyna.

2. Część doświadczalna:

IZOLOWANIE BIAŁEK ROŚLINNYCH

I. A Ekstrahowanie albumin i globulin

Cel ćwiczenia: Stwierdzenie obecności albumin i globulin w mączce grochowej.

Materiały: 1g mączki grochowej, 25ml 0,5M roztwór KCl, roztwór białka kurzego, 10% roztwór NaOH, 1%roztwór CuSO₄.

Przebieg doświadczenia i obserwacje: W kolbie erlenmeyrce ekstrahowaliśmy 1g mączki grochowej w 25ml roztworu KCl przez około 15 min, co jakiś czas wstrząsając zlewką. Po czym całość odwirowaliśmy, a uzyskaną ciecz nadosadową analizowaliśmy w następujący sposób:

a) przeprowadziliśmy reakcję biuretową dla roztworu białka kurzego, wody i wcześniej przygotowanego roztworu z mączki grochowej, tzn. odmierzyliśmy po 2ml każdej z substancji i dodaliśmy do nich po 2ml 10% roztworu NaOH oraz kilka kropli 1% roztworu CuSO₄ . W probówce z wodą zaobserwowaliśmy niebieski osad, w probówce z roztworem jaja kurzego fioletowo-niebieski osad, a w ekstrakcie mączki grochowej zauważyliśmy fioletowe zabarwienie.

b) do dwóch probówek wlaliśmy po 1ml ekstraktu mączki, następnie do jednej dodaliśmy 8ml wody, a do drugiej 8ml 0,5M roztworu KCl. W probówce z wodą zaobserwowaliśmy osad, który po dodaniu KCl uległ rozpuszczeniu, natomiast w drugiej probówce nie znajdował się osad.

Wnioski: Dzięki przeprowadzeniu reakcji biuretowej w pierwszej części doświadczenia udowodniliśmy obecność białek w mączce grochowej. Reakcje z wodą i jajkiem kurzym stanowiły próby kontrolne. Druga część doświadczenia pozwala nam udowodnić, że globuliny są nierozpuszczalne w wodzie (powstanie osadu), natomiast są rozpuszczalne w roztworze soli (KCl). Z kolei albuminy są rozpuszczalne zarówno w wodzie, jak i w roztworach soli.

I. B Wydzielanie glutenu

Cel ćwiczenia: Wydzielenie glutenu z mąki pszennej.

Materiały: 30g mąki pszennej, woda, 30ml 0,2M roztwór NaOH, roztwór białka kurzego, 10% roztwór NaOH, 1%roztwór CuSO₄.

Przebieg doświadczenia i obserwacje: Z 30g mąki pszennej i wody przygotowaliśmy (w porcelanowym moździerzu) twarde ciasto, odstawiliśmy je na 15min celem uwodnienia i spęcznienia białka. Następnie wypłukiwaliśmy z ciasta skrobię, wygniatając je w strumieniu zimnej, bieżącej wody. Otrzymaną pozostałość rozpuściliśmy w 30ml 0,2M roztworze NaOH. Przeprowadziliśmy reakcję biuretową roztworu znad osadu, wody i jajka kurzego. W probówkach z roztworem jajka kurzego i mąki pszennej zaobserwowaliśmy fioletowe zabarwienie, w probówce z wodą niebieskie zabarwienie.

Wnioski: Gluten znajdujący się w mące pszennej to mieszanina glutein i prolamin, które charakteryzują się znaczną zawartością reszt kwasu glutaminowego, rozpuszcza się w rozcieńczonych roztworach zasad, dlatego też zaobserwowaliśmy pozytywny wynik reakcji biuretowej w probówce z ciastem po rozpuszczeniu go w roztworze NaOH. Roztwór białka kurzego i woda stanowiły próby kontrolne.

II. Wysalanie białek

Cel ćwiczenia: Wysolenie białka jaja kurzego.

Materiały: 1% roztwór białka jaja kurzego, stały (NH₄)SO₄, 0,5M KCl, 5% kwas trójchlorooctowy CCl₃COOH (TCA), 10% roztwór NaOH, 1%roztwór CuSO₄.

Przebieg doświadczenia i obserwacje: Do 10ml roztworu jaja kurzego dodawaliśmy porcjami stały preparat siarczanu amonu aż do nasycenia roztworu soli. Osad wysolonego białka oddzieliliśmy na sączku i rozpuściliśmy (bezpośrednio na sączku) roztworem KCl. W roztworze uzyskanym w ten sposób przeprowadziliśmy reakcję biuretową, która dała pozytywny wynik, czyli czerwono-fioletowe zabarwienie. Do przesączu, otrzymanego po oddzieleniu osadu białka dodaliśmy 3 krople kwasu TCA i zaobserwowaliśmy powstanie delikatnego osadu.

Wnioski: Poprzez dodawanie do roztworu białka jaja kurzego (NH₄)SO₄ spowodowaliśmy jego wysolenie, ponieważ jest to zjawisko odwracalne to po dodaniu do osadu wysolonego białka roztworu KCl, otrzymaliśmy ponownie roztwór białka jaja kurzego co udowodniliśmy poprzez przeprowadzenie reakcji biuretowej, która dała pozytywny wynik. Natomiast obecność niewielkiej ilości białka w przesączu świadczy o niecałkowitym jego wysoleniu. Sprawdziliśmy to dodając TCA do przesączu, otrzymanego po oddzieleniu osadu białka.

III. Amfoteryczność białek

Cel ćwiczenia: Strącanie białek za pomocą kationów i anionów.

Materiały: 10% siarczan miedzi CuSO₄, 10% octan ołowiu (CH₃COO)₂Pb, 10% wolframian sodu NaWO₄, 1% roztwór białka jaja kurzego o pH: 8,0 ; 4,7 ; 3,0.

Przebieg doświadczenia i obserwacje: Do trzech probówek odmierzyliśmy po 2ml roztworu białka jaja kurzego o odpowiednim pH. Do poszczególnych probówek dodawaliśmy kroplami wymienione roztwory soli. Obserwacje przedstawiliśmy w poniżej tabelce.

+ oznacza powstanie białczanu; - oznacza, że nie pojawił się osad soli;

Tabela1. Obserwacje w doświadczeniu badającym amfoteryczność białek.

Odczynnik	1%roztwór białka jaja kurzego
		pH 8,0	pH 4,7	pH 3,0
10% siarczan miedziowy	+	-	-
10% octan ołowiu (II)	+	-	-
10% wolframian sodowy	-	-	+

Wnioski: Na podstawie obserwacji można wywnioskować, iż punkt izoelektryczny białka jaja kurzego występuje przy pH=4,7, jest to stan zobojętnienia cząsteczek białka (tzn. ilość grup zjonizowanych dodatnio i ujemnie jest jednakowa) i nie reagują one z żadnymi jonami. Zatem przy pH=8,0 cząsteczki białka (owoalbuminy) mają charakter wieloanionowej zasady (znak ujemny) i mogą wiązać kationy metali, np. Cu²⁺,Pb²⁺ oraz Na⁺, natomiast owoalbuminy przy pH=3,0 są wielokationowymi kwasami reagującymi z anionami, np. SO₄^2-.

Powstałe w wyniku powyższych reakcji produkty-osady, mają charakter soli i nazywane są białczanami. Zaobserwowaliśmy, iż kationy metali ciężkich, czyli Cu²⁺ oraz Pb²⁺ denaturują białka i tworzą z ich anionową formą trudno rozpuszczalne sole, natomiast białczany metali alkalicznych są dobrze rozpuszczalne w wodzie.

DENATURACJA

IV. Denaturacja cieplna

Cel ćwiczenia: Sprawdzenie czy denaturacja białka zależy od pH.

Materiały: 1% roztwór białka jaja kurzego o pH 8,0 ; 4,7; 3,0; 0,1M roztwór buforu octanowego o pH 4,7.

Przebieg doświadczenia i obserwacje: Do trzech probówek odmierzyliśmy po 2ml roztworu białka o odpowiednim pH. Próbki umieściliśmy na 15min we wrzącej łaźni wodnej, po wyjęciu z łaźni wodnej zaobserwowaliśmy, że roztwór o pH 3,0 jest przezroczysty, roztwór o pH 8,0 mętnieje i wytrącają się małe ilości osadu , a w probówce z roztworem o pH 4,7 zaobserwowaliśmy mocne zmętnienie, wytrąciło się dużo skoagulowanego osadu. Po schłodzeniu probówek dodaliśmy po 5ml buforu octowego (o pH 4,7) do prób zawierających roztwór białka o pH 3,0 oraz 8,0. Po doprowadzeniu pH obu roztworów do punktu izoelektrycznego zaobserwowaliśmy w probówce, w której znajdował się roztwór o pH 3,0 zmętnienie, natomiast w tej w której miał pH 8,0 zmętnienie narastało, nastąpiła koagulacja i po chwili osad opad na dno.

Wnioski: W każdym z badanych w doświadczeniu białek zachodzi denaturacja wywołana wysoką temperaturą. Największe zmętnienie obserwujemy po ogrzaniu białka o pH równym 4,7 ponieważ jest to pI punktu izoelektryczny białka, a więc zachodzi koagulacja, czyli daleko posunięta, nieodwracalna agregacja rozwiniętych łańcuchów peptydowych, powstałe zlepy są całkowicie nierozpuszczalne co objawia się zaobserwowanym zmętnieniem. Denaturacja nie zależy od pH, lecz od czynników fizycznych oraz chemicznych. Po dodaniu do probówek zawierających białka jaja kurzego o pH=3,0 oraz pH=8,0 buforu octanowego o pH=4,7 wytrąca się osad, tzn. białko koaguluje. Związane jest to z tym, iż pH białek zbliżyło się do wartości punktu izoelektrycznego białka, czyli pH=4,7. Osad ten intensywniejszy jest w probówce z białkiem o pH=8,0. Na podstawie powyższych obserwacji można jednoznacznie stwierdzić, iż koagulacja przeciwieństwie do denaturacji zależy od pH.

V. Denaturacja chemiczna

Cel ćwiczenia: Sprawdzenie wpływu kwasów organicznych na białka.

Materiały: 1% roztwór białka jaja kurzego, 6% kwas sulfosalicylowy C₇H₆O₆S, 10% kwas trójchlorooctowy CCl₃COOH (TCA), 5% kwas octowy CH₃COOH.

Przebieg doświadczenia i obserwacje: Do trzech probówek odmierzyliśmy po 1ml roztworu białka jaja kurzego, po czym dodaliśmy po 1ml odpowiednich roztworów kwasów organicznych. Obserwacje zestawiliśmy w poniższej tabeli:

Tabela2. Obserwacje w doświadczeniu badającym wpływ kwasów organicznych na białka.

KWAS	OBSERWACJE
6% kwas sulfosalicylowy	Zmętnienie i koagulacja białka
10% kwas trójchlorooctowy	Zmętnienie i koagulacja białka
5% kwas octowy	Brak zmętnienia i osadu, rozpuszczenie białka

Wnioski: W każdej probówce, zawierającej roztwór białka jaja kurzego zachodzi denaturacja, jest ona jednak niewidoczna w przypadku działania kwasem octowym. Jest to przykład denaturacji chemicznej, gdyż wykorzystujemy stężone roztwory kwasów. Czynniki chemiczne, jak np. jony metali ciężkich , detergenty, rozpuszczalniki organiczne czy też wykorzystane w naszym zadaniu stężone roztwory kwasów powodują rozpad wiązań stabilizujących pierwotną, przestrzenną budowę cząsteczki białka. Powstałe w powyższych reakcjach produkty, tj. osady są trwałymi i nierozpuszczalnymi połączeniami kwasów organicznych z białkami.

---