Mikrobiologia przemysłowa
Ćwiczenie nr 3- Dezintegracja komórek mikroorganizmów- metody niemechaniczne
Metody mechaniczne nie znajdują zastosowania we wszystkich przypadkach, ponieważ w czasie procesu rozrywania ścian komórkowych wzrasta temperatura i niszczona jest struktura molekularna substratu biologicznego. Natomiast podczas wydzielania metabolitów wewnątrzkomórkowych metodami niemechanicznymi rozrywanie błon komórkowych odbywa się w najłagodniejszych warunkach. Przykładem tych metod może być liza enzymatyczna i chemiczna oraz szok osmotyczny. Stosuje się je najczęściej do:
- preparowania protoplastów,
- produkcji enzymów wewnątrzkomórkowych lub związanych z membranami,
- otrzymywania rozpuszczalnych wielocukrów,
-wstępnego przygotowania komórek przed dezintegracją mechaniczną,
- ekstrakcji barwników,
- ekstrakcji specyficznych lipidów,
- odzysku etanolu z odpadowych drożdży piwowarskich,
- wydzielania składników komórek po rekombinacji DNA.
Metody chemiczne- traktowanie biomasy roztworami kwasów, zasad, detergentów, soli żółciowych, rozpuszczalników- skutecznie niszczy lipoproteidy ze ścian komórkowych, ale substancje te inaktywują również składniki wewnątrzkomórkowe. Dlatego też stosuje się je jedynie wówczas, gdy ekstrahowane składniki są dostatecznie stabilne.
Metody fizyczne- komórki mogą być rozrywane przez naprężenia fizyczne wywołane na przykład nagłym obniżeniem ciśnienia, szokiem osmotycznym lub kryształkami lodu. Niestety metody te jako powolne i mało efektywne nie znajdują większego zastosowania w przemyśle.
Metody enzymatyczne (biologiczne)- polegają m.in. na zastosowaniu enzymów zdolnych do hydrolizy ścian komórkowych (glikozydazy, acetyl- muramyloamidazy, polipeptydazy, zymolazy, lizozymu, muramidazy i innych). Najczęściej są to enzymy pochodzenia mikrobiologicznego o bardzo dużej specyficzności, a efekty enzymatycznej lizy ścian komórkowych zależą od wartości pH środowiska reakcji oraz temperatury ( pH 6-11 ; temp. 30-60° C). W pewnych przypadkach stosuje się również lizę bakteriofagami. Enzymatyczna hydroliza ścian komórkowych w porównaniu z metodami mechanicznymi jest bardzo specyficzna, a upowszechnienie metod produkcji enzymów litycznych, szczególnie ich immobilizacji, daje duże szanse selektywnej izolacji wartościowych składników wewnątrzkomórkowych.
Metody kombinowane- w metodach tych stosuje się kilka metod. Przykładem może być zastosowanie prasy Hughes'a, Frenche'a lub „X”, w których wykorzystuje się jednocześnie metody fizyczne i mechaniczne. Niszczenie struktury komórek następuje prawdopodobnie wskutek deformacji drobnoustrojów tkwiących w lodzie. Wadą tych urządzeń jest brak możliwości powiększenia skali. Z tego też powodu stosowane są wyłącznie w badaniach laboratoryjnych do preparacji błon komórkowych lub nietrwałych preparatów.
Metoda chemiczna
Zadanie 1.2. Otrzymywanie ekstraktów bezkomórkowych przy użyciu detergentu - Tween 80.
Materiały: drożdże piekarskie , bufor tris 50mM pH 7.0.
Porcję drożdży piekarskich (10g) zawiesić w 50 ml wody destylowanej, dokładnie wymieszać i odwirować (5 min w 4000 rpm) w temperaturze 4oC.
Osad zawiesić w 50 ml buforu i umieścić w kolbce.
Dodać odpowiednią ilość czynnika dezintegrującego -Tween 80, tak by stężenie końcowe detergentu w kolbce wynosiło 1%.
Kolbki inkubować przez 20 minut na wytrząsarce w temperaturze 30°C.
Po tym czasie, w dwóch probówkach wirówkowych zawierających po 5 ml ekstraktu, odwirować fragmenty komórek przez 5 min w 5000 rpm i w powstałym roztworze sprawdzić stężenie białka metodą Bradford'a.
Metoda fizyczna
Zadanie 1.3. Otrzymywanie ekstraktów bezkomórkowych poprzez zastosowanie szoku temperaturowego.
Materiały: drożdże piekarskie, bufor tris 50mM pH 7.0,
Porcję drożdży piekarskich (10g) zawiesić w 50 ml wody destylowanej, dokładnie wymieszać i odwirować (5 min w 4000 rpm) w temperaturze 4oC.
Komórki drożdży zawiesić w 10 ml buforu Tris i przenieść do plastikowego pojemnika.
Zawiesinę mikroorganizmów wstawić do zamrażarki na ok. 15 min.
Po tym czasie zawiesinę szybko rozmrozić w łaźni wodnej (50˚C).
Następnie roztwór, schłodzony do temperatury pokojowej, ponownie zamrozić.
Po całkowitym zamrożeniu, ponownie przeprowadzić procedurę rozmrażania.
Odwirować, w dwóch probówkach wirówkowych zawierających po 5 ml ekstraktu, fragmenty komórek przez 5 min w 6000 rpm i w powstałym ekstrakcie bezkomórkowym sprawdzić stężenie białka.
Wyniki Ćwiczenia 2 i 3 przedstawić w formie sprawozdania