Mikrobiologia przemysłowa

Ćwiczenie nr 3- Dezintegracja komórek mikroorganizmów- metody niemechaniczne

Metody mechaniczne nie znajdują zastosowania we wszystkich przypadkach, ponieważ w czasie procesu rozrywania ścian komórkowych wzrasta temperatura i niszczona jest struktura molekularna substratu biologicznego. Natomiast podczas wydzielania metabolitów wewnątrzkomórkowych metodami niemechanicznymi rozrywanie błon komórkowych odbywa się w najłagodniejszych warunkach. Przykładem tych metod może być liza enzymatyczna i chemiczna oraz szok osmotyczny. Stosuje się je najczęściej do:

- preparowania protoplastów,

- produkcji enzymów wewnątrzkomórkowych lub związanych z membranami,

- otrzymywania rozpuszczalnych wielocukrów,

-wstępnego przygotowania komórek przed dezintegracją mechaniczną,

- ekstrakcji barwników,

- ekstrakcji specyficznych lipidów,

- odzysku etanolu z odpadowych drożdży piwowarskich,

- wydzielania składników komórek po rekombinacji DNA.

Metody chemiczne- traktowanie biomasy roztworami kwasów, zasad, detergentów, soli żółciowych, rozpuszczalników- skutecznie niszczy lipoproteidy ze ścian komórkowych, ale substancje te inaktywują również składniki wewnątrzkomórkowe. Dlatego też stosuje się je jedynie wówczas, gdy ekstrahowane składniki są dostatecznie stabilne.

Metody fizyczne- komórki mogą być rozrywane przez naprężenia fizyczne wywołane na przykład nagłym obniżeniem ciśnienia, szokiem osmotycznym lub kryształkami lodu. Niestety metody te jako powolne i mało efektywne nie znajdują większego zastosowania w przemyśle.

Metody enzymatyczne (biologiczne)- polegają m.in. na zastosowaniu enzymów zdolnych do hydrolizy ścian komórkowych (glikozydazy, acetyl- muramyloamidazy, polipeptydazy, zymolazy, lizozymu, muramidazy i innych). Najczęściej są to enzymy pochodzenia mikrobiologicznego o bardzo dużej specyficzności, a efekty enzymatycznej lizy ścian komórkowych zależą od wartości pH środowiska reakcji oraz temperatury ( pH 6-11 ; temp. 30-60° C). W pewnych przypadkach stosuje się również lizę bakteriofagami. Enzymatyczna hydroliza ścian komórkowych w porównaniu z metodami mechanicznymi jest bardzo specyficzna, a upowszechnienie metod produkcji enzymów litycznych, szczególnie ich immobilizacji, daje duże szanse selektywnej izolacji wartościowych składników wewnątrzkomórkowych.

Metody kombinowane- w metodach tych stosuje się kilka metod. Przykładem może być zastosowanie prasy Hughes'a, Frenche'a lub „X”, w których wykorzystuje się jednocześnie metody fizyczne i mechaniczne. Niszczenie struktury komórek następuje prawdopodobnie wskutek deformacji drobnoustrojów tkwiących w lodzie. Wadą tych urządzeń jest brak możliwości powiększenia skali. Z tego też powodu stosowane są wyłącznie w badaniach laboratoryjnych do preparacji błon komórkowych lub nietrwałych preparatów.

Metoda chemiczna

Zadanie 1.2. Otrzymywanie ekstraktów bezkomórkowych przy użyciu detergentu - Tween 80.

Materiały: drożdże piekarskie , bufor tris 50mM pH 7.0.

1. Porcję drożdży piekarskich (10g) zawiesić w 50 ml wody destylowanej, dokładnie wymieszać i odwirować (5 min w 4000 rpm) w temperaturze 4^oC.

2. Osad zawiesić w 50 ml buforu i umieścić w kolbce.

3. Dodać odpowiednią ilość czynnika dezintegrującego -Tween 80, tak by stężenie końcowe detergentu w kolbce wynosiło 1%.

4. Kolbki inkubować przez 20 minut na wytrząsarce w temperaturze 30°C.

5. Po tym czasie, w dwóch probówkach wirówkowych zawierających po 5 ml ekstraktu, odwirować fragmenty komórek przez 5 min w 5000 rpm i w powstałym roztworze sprawdzić stężenie białka metodą Bradford'a.

Metoda fizyczna

Zadanie 1.3. Otrzymywanie ekstraktów bezkomórkowych poprzez zastosowanie szoku temperaturowego.

Materiały: drożdże piekarskie, bufor tris 50mM pH 7.0,

1. Porcję drożdży piekarskich (10g) zawiesić w 50 ml wody destylowanej, dokładnie wymieszać i odwirować (5 min w 4000 rpm) w temperaturze 4^oC.

2. Komórki drożdży zawiesić w 10 ml buforu Tris i przenieść do plastikowego pojemnika.

3. Zawiesinę mikroorganizmów wstawić do zamrażarki na ok. 15 min.

4. Po tym czasie zawiesinę szybko rozmrozić w łaźni wodnej (50˚C).

5. Następnie roztwór, schłodzony do temperatury pokojowej, ponownie zamrozić.

6. Po całkowitym zamrożeniu, ponownie przeprowadzić procedurę rozmrażania.

7. Odwirować, w dwóch probówkach wirówkowych zawierających po 5 ml ekstraktu, fragmenty komórek przez 5 min w 6000 rpm i w powstałym ekstrakcie bezkomórkowym sprawdzić stężenie białka.

Wyniki Ćwiczenia 2 i 3 przedstawić w formie sprawozdania

---