Chromatografia w normalnym i odwróconym układzie faz

Na przebieg i efekty rozdzielania chromatograficznego analizowanej mieszaniny wpływają właściwości układu faza stacjonarna-faza ruchoma. W przypadku stosowania polarnych faz stacjonarnych jako fazy ruchome używane są rozpuszczalniki mające mniejszą od nich polarność. Jest to normalny układ faz, w którym jako fazę stacjonarną stosuje się najczęściej żel krzemionkowy. Eluentami w tym układzie faz są np.: heksan, izooktan, chloroform i chlorek metylenu. W praktyce w normalnym układzie faz najczęściej stosuje się n-heksan i jego mieszaniny z rozpuszczalnikami bardziej od niego polarnymiJeżeli faza stacjonarna jest słabo polarna lub niepolarna, to faza ruchoma musi być bardziej polarna. Taki układ jest odwróconym układem faz. W tym układzie faz fazą ruchomą mogą być: tetrahydrofuran, acetonitryl, metanol i woda. W praktyce najczęściej stosuje się mieszaniny metanolu i wody lub acetonitrylu i wody. Chromatografia kolumnowa w odwróconym układzie faz jest obecnie stosowana znacznie częściej niż w normalnym układzie faz. Jest to spowodowane tym, że polarne (hydrofilowe) adsorbenty używane w normalnym układzie faz silnie adsorbują wodę obecną w rozpuszczalnikach nawet w ilościach śladowych; wskutek czego aktywność adsorbentu maleje i kolumna traci swoje początkowe właściwości rozdzielcze.

Wybierając eluent do rozdzielenia mieszaniny o nieznanym składzie w normalnym układzie faz, najpierw stosuje się rozpuszczalnik ze środka szeregu eluotropowego. Następnie obserwując wyniki rozdzielenia, stosuje się rozpuszczalnik albo mieszaninę rozpuszczalników o większej lub mniejszej sile eluowania.

Ogólnie, jeżeli składniki analizowanej mieszaniny są polarne, to na polarnym wypełnieniu kolumny należy stosować fazę ruchomą bardziej polarną, niż wtedy, gdy składniki mieszaniny są słabo polarne lub niepolarne. Natomiast jeżeli składniki analizowanej mieszaniny są niepolarne, to na niepolarnym wypełnieniu kolumny należy stosować fazę ruchomą mniej polarną niż w przypadku składników mieszaniny słabo polarnych lub polarnych.

Czas retencji

Określa ile czasu potrzebuje dany związek chemiczny z analizowanej mieszaniny aby przejść przez całą długość rozdzielczej fazy stacjonarnej używanej w danej metodzie w metodzie chromatograficznej. Faza stacjonarna może być umieszczona w specjalnej kolumnie, na płytce lub może stanowić złoże filtra o specjalnej konstrukcji.

Zredukowany czas retencji

- czas retencji zredukowany substancji chemicznej, t_r' - jest to różnica między całkowitym czasem retencji substancji a martwym czasem retencji, t_r' = t_r - t_m.

Współczynnik podziału

Współczynnik podziału obliczamy w następujący sposób:

K = C_s/C_m , gdzie: C_s to stężenie substancji w fazie stacjonarnej, zaś C_m to stężenie składnika w fazie ruchomej. Współczynnik podziału to wielkość charakterystyczna dla każdej substancji. W głównej mierze zależy od fazy stacjonarnej.

Parametry charakteryzujące sprawność i selektywność kolumn chromatograficznych

Sprawność kolumn decyduje o tym, jaka będzie jakość uzyskanego chromatogramu. Wysoka sprawność objawia się ostrymi, wąskimi pikami substancji chromatografowanych i dobrym rozdzieleniem mieszaniny. Miarą sprawności kolumny jest wysokość równoważna półce teoretycznej (WPRT). Półka teoretyczna- objętość kolumny, w której osiagany jest stan równowagi między stężeniami substancji chromatografowanej w fazie ruchomej i stacjonarnej. Im więcej półek teoretycznych ma kolumna, tym większa jej sprawność L=NH

oraz N=L/H, gdzie L-długość kolumny, H-wysokość równoważna półce teoretycznej (WPRT)

Miarą skuteczności rozdzielania składników mieszaniny jest:

- współczynnik selektywności α dla sygnałów związków A i B wyrażony wzorem

α= t_RB-t_M/t_RA-t_M = k_B/k_A

- zdolność rozdzielenia kolumny R_S= 2(t_RB-t_RA/w_A+w_B)

Wypełnienia stosowane w chromatografii cieczowej

W chromatografii cieczowej stosuje się najczęściej wypełnienia o rozmiarze ziaren 5-10 m. Drobnoziarniste wypełnienia zapewniają krótką drogę dyfuzji cząsteczek substancji chromatografowanych do wnętrza ziaren i dzięki temu przy względnie dużych prędkościach fazy ruchomej uzyskuje się wysokie sprawności kolumn. Właściwości kinetyczne sorbentu są tym lepsze, im cieńsza jest grubość warstwy aktywnej. Można to uzyskać stosując sorbenty o porowatej powierzchni na nieporowatym wnętrzu (np. szklanym). Zaletą ich jest to, że można je łatwo otrzymywać w postaci cząstek o kształtach zbliżonych do kulistego. Rozmiary cząstek takich sorbentów są zwykle większe niż sorbentów objętościowo-porowatych, więc wypełnianie nimi kolumn jest stosunkowo łatwe, a ponadto stawiają one mały opór przepływowi fazy ruchomej. Kolumny napełnione sorbentami powierzchniowo-porowatymi mają jednak małą powierzchnię sorpcyjną i małą sprawność dlatego też obecnie stosowane są rzadko. Powszechnie używane są sorbenty objętościowo-porowate. Wprawdzie stawiają one dość duży opór przepływowi fazy ruchomej, ale przy zastosowaniu odpowiedniej pompy, nie stanowi to problemu. Ciśnienie potrzebne do przetłaczania fazy ruchomej przez kolumnę wynosi 5-15 Mpa (~50-150 atm). Wypełnienie sorbentami objętościowo-porowatymi zapewnia wysoką sprawność i dużą pojemność sorpcyjną kolumny. Stosowane są jako wypełnienia kolumn do rozdzielania preparatywnego.

Fazy ruchome i ich dobór w chromatografii cieczowej

Fazą ruchomą może być gaz, ciecz lub płyn w stanie nadkrytycznym, a fazą nieruchomą (stacjonarną) ciało stałe lub ciecz.

Ze względu na stan skupienia fazy ruchomej, wyróżnić można chromatografię:

 gazową (ang. gas chromatography, GC),

 cieczową (ang. liquid chromatography, LC),

 w fazie nadkrytycznej (ang. supercritical fluid chromatography, SFC).

W celu uzupełnienia zagadnień o fazach ruchomych, aparaturach i metodach kalibracji odsyłam do załączonej prezentacji (pdf)

---