Wykład 11 mikrobiologia
1) klonowanie
Najpierw wykorzystywano plazmidy naturalne, a później sztuczne wektory, umożliwia wprowadzenie obcego DNA do DNA organizmu i transkrypcje.
- w przypadku eukariota do wektorów nie można wprowadzić fragmentów DNA eukariotycznego, bo zawiera introny (które nie zostaną usunięta w DNA gospodarza prokariotycznego), dlatego do wektorów wstawia się cDNA syntetyzowane na matrycy mRNA (które nie ma intronów)
- wektor plazmidowy ma miejsce polilinkierowe rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne rozcinające kwasy nukleinowe. Potem wprowadza się obcy DNA do wektora i się go wtransformowuje do kom.
- wektor plazmidowy ma sekwencje warunkujące autonomiczną replikację, by szybko się namnażał i przez to będzie efekt. Ma mieć marker selekcyjny by można go było wizolować szybko (np. gen odporności na antybiotyki). Miejsce polilinkierowe nie może być przypadkowe by podczas wstawiania genu nie uszkodzić innego ważnego, musi zawierać silny promotor, sekwencję liderową, kodon inicjacji syntezy białka, coś by powstało białko hydrofobowe, czyli białko naturalne przyłączone i czasami geny kodujące transport poza komórkę.
Zostało to użyte (to klonowanie :) w lecznictwie do produkcji protein, peptydów np. Insulina (51AA, 2 łańcuchy połączone wiązaniem dwusiarczkowym) leczącą cukrzycę. Wcześniej stosowano ekstrakty z trzustek świńskich, które się oczyszczało ale czasem wywołały alergie. Somatostatyna produkowana przez przysadkę mózgową.
2) klonowanie z udziałem bakteriofaga
- DNA faga tniemy endonukleazą restrykcyjną
- pomiędzy pocięte fragmenty fagowego dna wprowadza się sekwencje danego DNA (insert) końce fagowego DNA i insertu łączy się ligaza fragment insercyjny może mieć wielkość 35 do 40 kpz.
- to insercyjne DNA prowadza się do kosmidu (wektor z regulacją replikacji, gen oporny na antybiotyki i sekwencja cos - upakują DNA w kapsyd faga.
Uzyskiwanie roślin transgenicznych - technika z AGROBACTERIUM TUMEPHACIENS- w naturze atakuje roślinę i wprowadza do jej genomu tzw. T-DNA= fragment plazmidu. Do tego plazmidu w miejsce w rejonie T-DNA można wprowadzić dany gen (np. tak zrobiono z pomidorami - doprowadzono do zmniejszenia syntezy glukuronidazy =enzym rozkładający ścianę kom.)
PRZEGLĄD MIKROORGANIZMÓW:
DOMENA: archea
PHYLUM: crenarcheota(termofilne i hipertermofilne org. metabolizujace siarkę
PHYLUM: euryarcheota(obejmuje archeony metanogenne i halofile oraz termofile, redukujące siarkę)
*metanogeny są bezwzg. beztlenowcami, utleniają wodór, mrówczan, metanol, redukują siarkę i inne, produkują co2 i metan.
*halofile są chemoorganotrofami, wymagają do wzrostu 1,5M NaCl, optymalnie 3-4M, (Halobacterium saliniarum wykorzystują energię słoneczną -mają bacteriorodopsynę)
DOMENA: bacteriae
PHYLUM: aquificae
Autotrofy, wykorzystują H2 jako źródło energii, najstarsza grupa, niektóre termofilne. Aquifex, Hydrogenobacter.
PHYLUM: deihococcus-termus
Są odporne na wysokie promieniowanie , ma dwa duże chlorofile i mega plazmid i mniejsze plazmidy, są mezofilnymi tlenowcami G(+), duże ilości karotenoidów, mają unikatowe lipidy. Po naświetleniu chromosomy rozpadają się i po 12-14h ponownie się łączą- bardzo efektywny mechanizm replikacji
PHYLUM: temotogae
Metabolizm C na drodze fermentacji, w lipidach występują wiązania eterowe (podobnie jak u arche), beztlenowe, G(-)
PHYLUM: chloroflexi
G(-), zielone bezsiarkowe, Chaloflexus i Hepetosiphoues- ruch ślizgowy, brak LPS w błonach zew. ściany kom.
PHYLUM: cjanobakterie
Prowadzą fotosyntezę z wydzieleniem tlenu. Mają 2 fotosystemy, chlorofil a i prawie wszystkie fikobiliny, wiążą CO2 w cyklu Celvina, mogą być jednokom. Rozgałęzione lub nie, wykazują tolerancje na różne czynniki
sinice jednokom. o kształcie pałeczek lub ziarniaków, prawie wszystkie nieurzesione, rozmnażają się przez podział równomierny na 2 lub przez pączkowanie
jednokom., ale kilka kom. może się utrzymać razem w agregatach, dzielą się na wiele małych kom. reprodukcyjnych, tzw. beocyty - uwalniane po przerwaniu ściany kom.
Nitkowate, nierozgałęzione, często otoczone śluzami - tylko kom wegetatywne (….)
(…)
(……)
(VI)
PHYLUM: chlorowi
b. zielone siarkowe ,fotosynteza anooksygenowa(?), asymilują CO2 odwrotnym szlakiem kwasów 3c, utleniają siarczki do siarki, którą odkładają na zewnątrz kom.
PHYLUM: proteobakteria:
Fototrofy, chemoorganotrofy, chemolitotrofy, na podstawie różnic w rRNA dzieli się je na 5 klas :
(a) Alphaproteobacteria- oligotrofy (zdolne do wzrostu przy niewielkim stęż substancji pokarmowych. Rodospirillum sp. (Fototrofy purpurowe bezsiarkowe), metylotrofy- Methylobacterium sp., chemotrofy- Nitrobacter, bakterie wiążące azot -Rhizobium, chorobotwórcze- Riketsje, Brucela. część bakterii tej klasy wykazuje charakterystyczną morfologie. Caulobacter sp. (b. stylikowe), Hyphomirabium- specyficznie paczkują.
*Riketsje =małe pałeczki G(-) 0,3-0,5/0,2-0,8mikrom, pasożyty wewnatrzkom. w erytrocytach, makrofagach. Po sfagocytowaniu uciekają z fagosomu i dzielą się w cytoplazmie. Nie mają szlaku glikolitycznego i nie wykorzystują glukozy jako źródła C i energii. Utleniają glutaminian kwasy 3c w cyklu Krebsa. Błonach mają system transportu składników odżywczych i koenzymów z kom. gospodarza .(>>)
* Caulobacter sp. - cykl życiowy , dzieli się forma osiadła .
*hypomikrobium:dzieli się przez pączkowanie, na jednym biegunie wyrasta „wyrostek” na końcu tego wyrostka powstaje kom. potomna . replikacja chromosomu, który przez wyrostek dostaje się do kom. potomnej .
(?) PHYLUM: proteobakteria:
Klasa: Betoproteobacria -oligotroficzne-wykorzystują zw. Odżywcze dyfundujące ze strefy rozkładu beztlenowego. Niektóre wykorzystują N2(Alcaligens sp.) lub amoniak(Nitrosomonas), metan (Methylobacillus) .
Klasa: gramnaproteobacteria.
Klasa: deltaproteacteria : zróżnicowane ,drapieżne- Bdellovibrio sp., b. tworzące ciała owocowe- myxococcus, beztlenowe- Desulfovibrio sp.- wykorzystują związki siarki jako ostateczne akceptory elektronów - produkują H2S.
Klasa: epislonproteabacteria : małe chorobotwórcze g(-)
*bellovibrio- przecinkowce biegunowo umieszczoną rzęską. Dostaje się do przestrzeni cytoplazmatycznej i tam żyje na koszt zaatakowanej BAKTERI(!). następuje przyrost na długość i podziały. Formy potomne uwalniają się i poszukują nowej ofiary.
*mycobactrie :wydzielają substancją lizujące inne bakterie, mogą wydzielać nawet antybiotyki. Są tlenowymi chemoorganotrofami. Cykl życiowy: agregują tworząc CIAŁO OWOCOWE (50-500mikrom, do 1000kom). Niektóre kom. Przekształcają się w mykospory (cysty)- odporne na działanie suszy. Powszechnie występują w glebie.
PHYLUM: firmicutes: G(+), bakterie o niskiej zawartości C+G w DNA. Są zróżnicowane, od ziarniaków do cylindrycznych. Niektóre wytwarzają endospory. Zaliczane są tu mikoplazmy(bakterie bez ściany kom. G(-)).
Klasa: clostridiae- beztlenowce, Clostridium.
Klasa: mollicutes: mykoplasmy , nie urzęsione , kształt pleomorficzny , wymagają do wzrostu steroli, niektóre są chorobotwórcze; Mycoplazma sp. Spiroplasma sp.
Klasa: bacilli- G(+) , tlenowe i względnie beztlenowe, niektóre tworzą endospory. Są dwa rzędy: Bacillales i Lactobacillales ( Panibacillus, Sporolactobacillus.
PHYLUM: acitnobactreia: promieniowce- zróżnicowane: ziarniaki i pałeczki(?); G+C >50-55%. Streptomyces sp. Actinomyces sp. Corynebacterium, Micrococcus, Mycobacterium sp. Propionebacterium sp.
PHYLUM: chlamydiae- wewnątrzkom. pasożyty-reprodukcja tylko w kom. , występują jako dwie formy-ciałka elementarne i retikularne, są G(-), nie urzęsione, nie wytwarzają ATP= pasożyty energetyczne. Do kom. gospodarza przyłączają się ciałka elementarne- są fagocytowane i hamują fuzję fagocytu z lizosomem, w fagocyccie przekształcają się do ciałka retikularnego i się namarzają
Ciałka elementarne : # odporne na infradźwięki,
# RNA:DNA 1:1,
# toksyczne dla myszy.
Ciałka retikularne: #większe wymiary
#wrażliwe na infradźwięki
#nie są toksyczne dla myszy.
PHYLUM: spiro(?)aetes- G(-), urzęsione, charakterystyczny mechanizm ruchu: na zewnątrz mają specjalną błonę, która otacza protoplazmatyczny cylinder, który zawiera cytoplazmę i chromosom. Mają periplazmatyczne 2 do więcej niż 100 rzęsek =fibryli położonych miedzy cylindrem a błoną zew. Treponema i Bonelia
PHYLUM: bacteroides- Bacteroides sp. Flavobacterium, Fexibacter, Cytophaga(2 ostatnie mają zdolność do ruchu ślizgowego).
Klasa: bactrroides-G(-) nie sporulujące pałeczki o różnych kształtach. Przeprowadzają fermentacje, chemoorganotrofy. Żyją w jamie ustnej i drogach jelitowych człowieka, niektóre są chorobotwórcze.
*Cytophaga sp. zdolna do rozkładu polisacharydów. Glebowe cytofagi hydrolizują celulozę, rozkładają chitynę, pektynę, keratynę.