Wykład 10 mikrobiologia

1. MUTACJE PUNKTOWE I ICH EFEKTY

Przyczyną zmienności mogą być mutacje spontaniczne, które zachodzą bez konkretnej przyczyny. Częstość mutacji spontanicznych waha się między 10^-4 a 10^-11, więc średnio mutacje spontaniczne występują z częstotliwością 10^-5 dla jednego genu na komórkę. Częstość mutacji jest podobna jak u eukariota. Częstość mutacji spontanicznych na jedną parę nukleotydów wynosi 10^-8. Mutacje mogą pociągać za sobą zmiany fenotypowe, ale nie koniecznie, bo kod genetyczny jest zdegenerowany.

2. RODZAJE MUTACJI

• Mutacje punktowe:

• Tranzycja - zastąpienie puryny przez inną purynę, lub pirymidyny przez inną pirymidynę

• Transwersja - zamiana puryny na pirymidynę lub pirymidyny na purynę

• (gdy dochodzi do zmiany ramki odczytu - przesunięcia ramki odczytu np. o jedną parę zasad)

• Mutacje wielomiejscowe:

• Delecja - utrata DNA

• Insercja - dodanie

• Inersja - odwrócenie DNA

• Duplikacja - powtórzenie sekwencji DNA

Konsekwencje fenotypowe mutacji punktowych:

• gdy organizm jest protrofem - występowanie u niego auksotrofizmu - to brak zdolności do syntezy niektórych białek. Organizm musi pobierać pokarm egzogennie, czyli z zewnątrz.

• Zmieniona wrażliwość na temperaturę (wrażliwość na wysoką temp.)

• Zdolność do nabycia odporności na antybiotyk co jest związanie z zahamowaniem transportu substancji (więc również antybiotyków) do komórki.

• Utrata zdolności do tworzenia otoczek, co jest bardzo ważne, bo decyduje o chorobotwórczości szczepów

• Utrata urzęsienie, więc brak zdolności ruchy, utrata pigmentu

• Zmiany w syntezie łańcucha oligosacharydowego w lipopolisacharydach bakterii gram (-) (gdy łańcuchy o - swoiste przestają być tworzone, bakterie stają się formami szorstkimi (R) - niechorobotwórczymi)

• Utrata zdolności metabolicznych, np. brak zdolności do fermentacji cukrów

• Zyskanie odporności na wirusy, co związane jest z modyfikacją miejsca receptorowego

Mutacje mogą być spowodowane również czynnikami mutagennymi:

• analogia zasad: 5- bromouracyl i 2- aminopuryna są włączane do DNA podczas normalnej replikacji, ale ulegają tautomerycznym zmianom podobnym jak naturalne zasady w DNA ze znacznie większą częstotliwością, co prowadzi do mutacji. (5 - bromouracyl włączany jest zamiast tyminy i występuje złe parowanie z guaniną AT→ GC; 2 - aminopuryna włączana jest zamiast adeniny AT → GC; GC→ AT

• kwas azotawy - dezaminacja A i C AT→ GC i GC→ AT

• hydroksyloamina - reaguje z C

• związki alkilujące: etyl i pochodne sulfonowe, nitrogen i azot (dział. 2- funkcyjne)

• bromek etydyny

• akrydyna -wiąże się z zasadami azotowymi w DNA niezdegradowanym

• promienie UV - pochłaniane przez pirymidyny (260 nm- max). Najpierw powstają dimery T i C - to powoduje zniekształcenie helisy, tworzenie dimerów nie jest samo w sobie mutagenne, (dopisane: mutacja powstaje dopiero podczas próby naprawy dimerów)

• Promieniowanie jonizujące - rozszczepia lub degraduje DNA

Mutacje można usunąć przez, np.: przez:

• fotoreaktywacje - fotoliaza syntetyzowana przez bakterie przekształca dimery tyminy i cytozyny zaindukowane przez dzianie UV na powrót w wyjściową formę monomeryczną w obecności światła (320 - 390 nm). Wskazane fragmenty są wycinane

• przez endonukleazę restrykcyjną, która wycina uszkodzony fragment DNA, polimeraza dosyntetyzowuje brakujący fragment, a ligaza go włącza do DNA.

• Reakcja SOS zwiększenie zdolności reperacji DNA. Jest 17 genów odpowiedzialnych za to ( w systemie SOS, w którym polimeraza III DNA wstawia naprzeciw dimeru tyminy jakąkolwiek zasadę, aby tylko replikacja mogła być kontynuowana. System ten jest indukowany przez białko RecA, zaktywowne w wyniku oddziaływania z uszkodzonym DNA, co z kolei inaktywuje represor transkrypcji białko LexA).

• Jeśli uszkodzenie DNA jest bardzo duże to bakteria umiera.

3. Zmiana w aparacie genetycznym może być też związana z horyzontalnym transferem - otrzymaniem obcego DNA przez bakterie w drodze:

1. transformacji - pobrania DNA z otoczenia

2. transdukcji

3. koniugacij

1. transformacja - w naturze podlega jej tylko dwuniciowy DNA o odpowiedniej wielkości (12 tys. pz).(transformacja jest wynikiem pobrania wolnego DNA z otaczającego podłoża i włączenia go do genomu. Wiele bakterii, takich jak Bacillus, Streptococcus jest zdolnych do transformacji naturalej. Zdolność komórki do pobierania DNA zależy od jej szczególnego stanu, który nazywany jest kompetencją. Kompetencja sprowadza się do obecności na powierzchni komórki receptorów dla DNA. U innych bakterii, takich jak E. coli, stan kompetencji może zostać zaindukowany działaniem odpowiednich czynników chemicznych w niskiej temperaturze). Kompetentna komórka ma np.: na zewnątrz białka ze zdolnością do wiązania dwuniciowego DNA, większą aktywność enzymów zewnątrzkomórkowych, a poza tym wytwarza enzymy umożliwiające transport jednej nici do komórki, a nukleaza degraduje drugą nić DNA przyłączonego do czynnika (białka kompetencji). Rekombinacja zachodzi przy udziale białka rekombinazy. W naturze transformacja występuje u bakterii G(-) i G (+). W warunkach laboratoryjnych w roztworze chlorku wapniowego umieszcza się bakterie w temperaturze 0 - 5 ^oC, a potem szybkie podgrzanie, co rozluźnia powierzchniowe warstwy i lepiej pobierany jest DNA. Można też użyć elektroporację czli elektryczność. Transformacja plazmidem kowalencyjnie skręconym CCC. W odpowiednich warunkach cała cząsteczka wnika do komórki i działa jako replikon i nie musi być homologiczny do chromosomu bakteryjnego i nie ma rekombinacji. Utrzymanie plazmidu w komórce wymaga dużo energii, dlatego gdy jest zbędny to jest usuwany. Transformacja plazmidem jest bardzo wygodna dla człowieka. Plazmidy mogą występować w 200 - 300 kopiach w komórce.

2. transdukcja - przeniesienie fragmentu kwasu nukleinowego DNA przez wirusa z jednej komórki do drugiej. Transdukcja fagowa gdy wirus jest wbudowany do chromosomu bakteryjnego i wirus jest w stadium prowirusa (profaga) on może być dziedziczony lub wycięty, ale nie zawsze dokładnie. Wirus zabrał gen z chromosomu bakteryjnego, a część jego genów została w chromosomie bakteryjnym. Wirus atakujący nową komórkę w cyklu litycznym może się namnażać lub integrować się z DNA gospodarza lub przez crossing - over dojdzie do krzyżowej wymiany, co zmieni fenotyp komórki bakterii. Jeśli chodzi o transdukcję to wykryto ją u wielu bakterii, ale może ona przenieść tylko 1-2% chromosomu bakteryjnego E. coli. Bacillus subtilis może przenieść 8%. Horyzontalny transfer to przyczyna zmienności.

3. Koniugacja - przekazanie informacji genetycznej z komórki dawcy do biorcy w drodze bezpośredniego kontaktu. Jest to proces jednokierunkowy. Gdy w komórce dawcy jest plazmid koniugacyjny i on odnajduje receptory w komórce biorcy to w drodze transferu kopia jest przeciskana do komórki biorcy. Zarówno dawca jak i biorca mają kopię tego samego plazmidu.

Np. z udziałem pili u bakterii G

lub dochodzi do mobilizacji plazmidu

retrotransfer - gdy występuje koniugacja między komórką z plazmidem samoprzekazywalnym z komórką biorcy z plazmidem mobilizowalnym ale nie chorobotwórczym

plazmid koniugacyjny przechodzi z D do B

plazmid koniugacyjny mobilizuje plazmidy mobilizowalny

Koniugacja z udziałem plazmidu F #

Komórka HFR ma zdolność do transferu genów chromosomalnych.

Mapa genetyczna chromosomowa pokazuje ułożenie chromosomów w stosunku do siebie i powstałe przez koniugację przerywaną. Tak utworzono mapę genetyczną. Transfer całego chromosomu zachodzi bardzo wolno i łatwo go przerwać. Transfer łatwiej zachodzi między przedstawicielami tego samego gatunku lub spokrewnionymi, bo inaczej nie można utworzyć mostka koniugacyjnego. Mapa genetyczna jest 100 minutowa, koniugacja przerywana jest co 1 minutę. Mapa chromosomowa E. coli jest punktem wyjścia do badań organizacji i struktury chromosomów bakteryjnych. (nakłada się mapę fizyczną - obrazującą miejsca restrykcyjne i konwencjonalną na mapę chromosomową.)

4. udział fragmentów labilnych takich jak sekwencje insercyjne (odcinki proste powtarzalne odwrócone CGATT======= TTAGC te fragmetnty i transpozony

↓

to gen transpozazy

pozwalają odszukiwać miejsce.

Geny kodujące transpozazę, która pozwala się jej wyciąć a następnie włączyć w dowolne miejsce DNA. Sekwencje insercyjne mają też na końcach promotory skierowane na zewnątrz. Sekwencje mogą się wbudować w pobliżu genu → to może mieć wpływ na ekspresję tego genu. Transpozon jest flankowany przez dwie sekwencje insercyjne, a pomiędzy nimi znajduje się DNA zawierające geny kodujące geny odporności na antybiotyki lub inne cechy. Cały transpozon przenosi się jako jeden element. Skutki insercji IS lub transpozonów:

- nowy promotor P' zastępuje promotor P

- przerywanie ciągłości genu a skutkiem jest brak produkcji białka.

Czasami może dojść do insercji bardzo dużego fragmentu, są to wyspy genowe, które mają inny skład nukleotydów w porównaniu z resztą genomu.

Wyspy patogenność to geny warunkujące chorobotwórczość np. synteza jakiejś toksyny. Np. pałeczki dżumy HPI - bakterie bez wyspy HPI (High pathogen island) są niechorobotwórcze.

Transpozony koniugacyjne są zintegrowane z chromosomem, ale czasami się wycinają, przyjmują formę (kolistą) podobną do plazmidów tylko są mniejsze. Mają geny kodujące syntezę pili płuciowych, które mogą być przenoszone jako kopia do komórki biorcy.

Struktura inegronu - to takie sekwencje, które zdolne są do włączania zgrupowań genów. Integron ma gen kodujący integrazę - białko biorące udział we włączaniu się kaset genowych w miejsca docelowe w integronie. Wszystkie kasety włączone w to miejsce są transkrybowane w tym samym kierunku. Promotor przyłącza się do miejsca wstawienia się kasety...

---