ĆWICZENIE 7

Metabolizm drobnoustrojów

Zad. 1. Oznaczanie aktywności dehydrogenazowej drobnoustrojów testem TTC.

W procesie utleniania związków organicznych zużycie każdego atomu tlenu wiąże się
z pobraniem od substratu dwóch atomów wodoru. Pomiar ilości wodoru może być miarą pobranego tlenu, w związku z czym skorzystano z możliwości oznaczania aktywności dehydrogenaz za pomocą sztucznego akceptora atomów wodoru, który zmienia swoje zabarwienie na skutek redukcji. Substancją taką jest chlorek trójfenylotetrazolowy - TTC, który jest akceptorem atomów wodoru bezpośrednio ze zredukowanych układów flawinowych. Bezbarwny TTC ulega redukcji do czerwonego formazanu (trójfenylofurazonu - TF).

Badanie aktywności dehydrogenazowej

Do czterech probówek wlać pipetą po 1 cm³ buforu Tris o pH 8,4 i po 1 cm³ zawiesiny drobnoustrojów. Następnie do jednej probówki dodać 0,5 ml 1% roztworu glukozy, do drugiej 0,5 ml 2% sacharozy, do trzeciej 0,5 ml 0,1% roztworu skrobi, a do czwartej 0,5 ml 0,9% roztworu NaCl (czwartą probówkę „K” włożyć do 100⁰C na 5 minut po czym schłodzić w strumieniu wody z kranu do temp. pokojowej). Następnie do wszystkich 4 probówek wprowadzić pipetą 0,4 cm³ roztworu TTC i umieścić probówki w termostacie o temp. 37°C. Próby pozostawić na 30 min. Po 30 min. inkubacji określić aktywność dehydrogenazową drobnoustrojów.

Zad. 2. Wykrywanie aktywności katalazowej drobnoustrojów

Katalaza, podobnie jak dehydrogenaza, należy do oksydoreduktaz. Jest to enzym powszechnie występujący w komórkach organizmów tlenowych i jest jednym z najszybciej działających enzymów (rozkłada truciznę - H₂O₂.). Mechanizm działania katalazy polega na oderwaniu tlenu od jednej cząsteczki H₂O₂ i przeniesieniu go na drugą cząsteczkę H₂O₂.
W efekcie dochodzi do rozpadu obu cząsteczek nadtlenku wodoru i wytworzenia dwóch cząsteczek H₂O oraz wydzielenia tlenu. Reakcja przebiega więc następująco:

H₂O₂ + H₂O₂ ^KATALAZA 2 H₂O + O₂

Badanie aktywności katalazowej

Do 2 probówek wprowadzić po 1 cm³ badanych drobnoustrojów. Jedną probówkę, opisaną „K”, włożyć na 5 min. do łaźni wodnej o temp. 100°C, po czym schłodzić w strumieniu wody
z kranu do temp. pokojowej. Następnie do obu probówek wprowadzić po 0,5 cm³ roztworu H₂O₂ i obserwować pojawiające się zmiany.

Zad. 3. Wykrywanie aktywności oksydazowej drobnoustrojów

Oksydazy są również enzymami z grupy oksydoreduktaz. Enzymy te przenoszą elektrony
z utlenianego substratu bezpośrednio na tlen cząsteczkowy. Oksydazay (wraz
z dehydrogenazami) tworzą w mitochondriach tzw. łańcuch oddechowy i katalizują procesy oddychania komórkowego. W omawianym ćwiczeniu będzie wykrywana pewna specyficzna grupa oksydaz nie biorących udziału w łańcuchu oddechowym. Przenoszą one elektrony
i protony ze związków fenolowych na tlen, dlatego są określane jako oksydazy fenolowe. Związki fenolowe (np.pirokatechina) w wyniku utlenienia przechodzą w chinony, które ulegają spontanicznej polimeryzacji z wytworzeniem ciemno zabarwionych barwników melaninowych.

Badanie aktywności katalazowej

Do 2 probówek wlać po 2 cm³ osadu czynnego. Jedną probówkę wstawić do łaźni
z wrzącą wodą na 5 min., a następnie schłodzić do temp. pokojowej. Do obu probówek wlać po 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny. Próby inkubować w temp. 40°C przez 30 min. Pojawienie się brunatnej barwy świadczy o aktywności oksydazowej próby.

---