Elektroforeza żelowa
W elektroforezie żelowej środowiskiem w którym przemieszczają się badane substancje jest żel elektroforetyczny wykonany z agaru, poliakrylamidów lub skrobi (metoda historyczna), uformowany w płytkę długości kilkunastu centymetrów (rzadziej słupek - elektroforeza dyskowa). Kroplę roztworu analizowanej mieszaniny nanosi się w zagłębienie w żelu (studzienkę) zanurzonym w buforze pH. Wzdłuż krawędzi żelu, zwykle na dwóch przeciwległych bokach płytki, biegną elektrody, do których przykłada się stałe napięcie elektryczne rzędu 50- 2000 V. Ze względu na zróżnicowaną ruchliwość elektroforetyczną, różne cząsteczki w różnym stopniu oddalają się podczas analizy od miejsca naniesienia próby. Stopniowo ulegają więc rozdzieleniu.
Technika ta jest najczęściej stosowana do rozdzielania DNA, RNA lub białek wyekstrahowanych z komórek. Jest też czasami stosowana jako jedna z technik pomiaru masy cząsteczkowej i badania polidyspersji polimerów syntetycznych. Jeśli badaczowi zależy na ograniczeniu wpływu kształtu cząsteczek na szybkość ich elektroforetycznej wędrówki i na ściślejszym powiązaniu ich ruchliwości z masą cząsteczkową, to może badane substancje poddać denaturacji, np. przy pomocy detergentu SDS (w przypadku białek) lub mocznika (w przypadku DNA lub białek).
Elektroforeza - technika stosowana przy rozdziale , analizie i oczyszczaniu kwasów nukleinowych i białek.
DNA i RNA mają ładunek ujemny i zgodnie z tym ładunkiem , nadawanym przez grupy fosforanowe , migrują w polu elektrycznym w kierunku anody. Szybkość migracji zależy od wielkości i kształtu cząsteczki.
Schemat postępowania jest następujący : żel ulega zestaleniu w formie cienkiej płytki na podstawce tzw. saneczkach wraz z zanurzonym specjalnego typu grzebieniem , który następnie wyciąga się. W zastygłym żelu znajduje się szereg dołków , do których wprowadzane są próbki DNA oraz z reguły tzw. standard czyli mieszanina cząsteczek o znanych masach dzięki czemu możliwa będzie później kalibracja żelu. Przed naniesieniem na żel próbki muszą być odpowiednio przygotowane : dodawany jest barwnik , który informuje nas później jak daleko zaszły najszybsze cząsteczki (co jest niezbędne ponieważ DNA w żelu nie widać) oraz związek interkalujący - bromek etydyny , który fluoryzuje w świetle UV co pozwoli nam na zlokalizowanie prążków.
Minimalna ilość DNA , którą widać na żelu w postaci prążka to 20 ng. Ilość DNA w prążku nie powinna przekraczać 200 ng ponieważ obserwuje się przeładowanie kieszonki. Żel umieszczony zostaje w specjalnym aparacie do elektroforezy i zalewany buforem przewodzącym prąd. Podłączony zostaje do zasilacza generującego prąd o stałym i określonym napięciu i natężeniu. Jakość rozdziału fragmentów DNA zmniejsza się w miarę zwiększania napięcia w czasie elektroforezy. Dla otrzymania optymalnej jakości stosuje się napięcie nie większe niż 5V na 1cm długości żelu.
Kalibracja wielkości fragmentów cząsteczek w żelu opiera się na zasadzie , że liniowe cząsteczki DNA migrują w żelu agarozowym z prędkością odwrotnie proporcjonalną do logarytmu dziesiętnego ich masy cząsteczkowej wyrażonej w Daltonach lub w tysiącach par zasad czyli kb. Kalibracja żelu polega na wykreśleniu krzywej zależności odległości przebytej w czasie elektroforezy przez poszczególne fragmenty od logarytmu masy cząsteczkowej.
Elektroforezę można przeprowadzać w żelach natywnych lub denaturujących.
1. Żele agarozowe.
Metoda szybka , prosta , powszechnie stosowana. Zdolność rozdzielcza zależy od wielkości porów w żelu , których rozmiary są zdeterminowane przez stężenie agarozy. Żeli bardziej stężonych tj. 1,4-2,0 % używa się do rozdziału cząsteczek mniejszych (0,5-2,0 kb). Żele mniej stężone 0,5-0,7 % stosuje się do rozdziału cząsteczek większych (10-20 kb i więcej).
Zaletą może być niekiedy fakt , że podczas elektroforezy możliwe jest rozdzielenie cząsteczek o tej samej wielkości ale zróżnicowanych pod względem kształtu. Doskonałym przykładem jest rozdział trzech różnych form plazmidu : CCC (ang. covalently closed circle) , liniowej i OC (ang. open circle). Pierwsza najszybciej wędruje w żelu , druga nieco wolniej , trzecia najwolniej.
2. Żele akrylamidowe.
Powstają przez polimeryzacje monomerów akrylamidu w długie łańcuchy z wytworzeniem wiązań poprzecznych przez bisakrylamid. Można regulować sieciowanie poprzez manipulację proporcjami stężeń akrylamidu do bisakrylamidu. Do zajścia reakcji niezbędna jest obecność odpowiedniego katalizatora (PERS - nadsiarczan potasowy) i związku inicjującego reakcję (TEMED). Żele te stosuje się przy rozdziale fragmentów o wielkości od kilku par zasad (20% poliakrylamid) do tysiąca par zasad (3% poliakrylamid) a także przy rozdziale jednoniciowych cząsteczek DNA np. do sekwencjonowania.
3. Żele denaturujące.
Ponieważ szybkość migracji w żelu jednoniciowych cząsteczek , zależy nie tylko od ich wielkości i ładunku ale także w dużym stopniu od ich struktury przestrzennej (w przypadku dwuniciowych cząsteczek DNA nie ma to większego znaczenia) aby dokładnie określić ich wielkość należy weliminować różnice w szybkości migracji wywołane różną konformacją cząsteczki. Jest to szczególnie ważne w przypadku jednoniciowego RNA , które tworzy miejscowe struktury dwuniciowe. W tym właśnie celu stosuje się żele denaturujące agarozowe lub poliakrylamidowe. Najczęściej używanymi czynnikami denaturującymi są : formaldehyd i glioksal w żelach agarozowych (przy analizie preparatów RNA) lub mocznik w żelach poliakrylamidowych (przy analizie jednoniciowych fragmentów DNA).
4. Elektroforeza w polu pulsacyjnym.
Stosowana do rozdzielenia dużych cząsteczek DNA - od 2.104 do 107 bp czyli od 20 kb do 10 Mb. Można w ten sposób rozdzielić całe chromosomy np. drożdżowe. Pole elektryczne jest włączane i wyłączane w krótkich odstępach czasu. Kiedy pole elektryczne jest włączone cząsteczki migrują zgodnie ze swoją wielkością a gdy zostaje wyłączone mają tendencję do relaksacji i zwijania w przypadkowe pętle. Czas wymagany do relaksacji jest wprost proporcjonalny do długości cząsteczki. Następnie kierunek pola elektrycznego jest zmieniany o 90 lub 180 stopni w stosunku do poprzedniego. Dłuższe cząsteczki zaczynają poruszać się wolniej niż krótsze. Powtarzające się zmiany kierunku pola stopniowo powodują rozdzielenie.
IZOLACJA Z ŻELU CZYLI JAK ODZYSKAĆ DNA.
Izolacja z żelu jest niezbędnym etapem w szeregu doświadczeń. Jest konieczna gdy po rozdziale pragniemy wykorzystać do dalszej pracy pewną określoną frakcję materiału lokującego się w odpowiednim prążku.
Istnieje wiele metod odzyskiwania DNA z żeli jednak żadna z nich nie jest pozbawiona wad.
Istotne problemy przy izolacji to :
- obecność inhibitorów reakcji enzymatycznych np. obecne w agarozie zanieczyszczenia w postaci polisacharydów , które hamują aktywność enzymów używanych przy dalszej obróbce klonowanego DNA
- niezbyt duża skuteczność odzyskiwania dużych fragmentów DNA ponieważ wydajność izolowania jest funkcją ciężaru cząsteczkowego tych fragmentów , za wielkość graniczną dla dobrej izolacji przyjmuje się długość 5 kb
- im mniejsza ilość DNA na żelu tym mniejsza wydajność jego odzyskiwania , izolacja staje się nieskuteczna przy ilościach mniejszych niż 500 ng
- nie ma możliwości izolacji jednocześnie kilku fragmentów o różnej długości.
Metody :
1. Izolacja DNA z użyciem DEAE-celulozy.
Polega na przyczepieniu się migrującego DNA do umieszczonej w żelu membrany z DEAE-celulozą , którą następnie odpłukuje się z zanieczyszczeń buforem o niskiej sile jonowej a potem eluuje z niej DNA buforem o wysokiej sile jonowej. Należy pamiętać , że z membran nie podlega elucji jednoniciowe DNA oraz fragmenty powyżej 15 kb.
2. Elektroelucja do woreczków dializacyjnych.
Najefektywniejsza do izolacji dużych fragmentów DNA - powyżej 5 kb. Po odpowiednim rozdzieleniu wycina się konkretny prążek DNA , umieszcza w woreczku dializacyjnym , który wkłada się do aparatu do elektroforezy i prowadzi ją przez jakiś czas po czym na krótko odwraca się bieguny i prowadzi elektroforezę przez minutę co pozwala na uwolnienie DNA ze ścian woreczka. Woreczek dializacyjny zostaje przepłukany odpowiednim buforem i po dodaniu kilku specjalnych odczynników i wirowaniu otrzymujemy preparat DNA.
3. Metoda "freeze-sqeeze".
Jest to bardzo szybka metoda izolacji. Tak jak poprzednio po elektroforezie zostaje z żelu wycięty konkretny prążek. Fragment żelu umieszczony w probówce , na dnie której znajduje się niewielka ilość silikonowej szklanej waty , zamraża się w ciekłym azocie (freeze) a następnie wkłada się jedną probówkę w drugą po zrobieniu w tej pierwszej niewielkiego otworku na dnie. Kolejnym etapem jest wirowanie (sqeeze). Uzyskany w ten sposób bufor poddaje się jeszcze kilku zabiegom wytrącania i wirowania , po których otrzymujemy wyizolowane DNA.
Antybiotykowe stymulatory wzrostu
Ojcowie sukcesu
Paul Erlich (1845-1915, 70 lat)-chemioterapeutyki
Gerhard Domagk (1895-1964, Nagroda Nobla,1939)-sulfonamidy
Aleksander Fleming (1888-1951, Nagroda Nobla, 1945)
Selman Waksman (Nagroda Nobla 1952), wprowadział pojęcia antybiotyk. Odkrył-aktynomycenę, streptomycynę i neomycyne
Benjamin Duggar opisuje tetracyklinę, antybiotyk o najszerszym, po chwilę obecną, spektrum przeciwbakteryjnemu.
Antybiotyk to związek chemiczny wytwarzany przez jakikolwiek mikroorganizm, który działa wybiórczo na struktury i procesy biologiczne, hamując wzrost lub podział komórek. Obecnie istnieje duża grupa antybiotyków półsyntetycznych i syntetycznych analogów naturalnych antybiotyków.
Antybiotyki
są produktami metabolizmu wtórnego, drobnoustrojów, głównie bakterii glebowych oraz niektórych grzybów mikroskopowych,
działają bakteriobójczo lub bakteriostatycznie na wrażliwe mikroorganizmy,
niektóre oddziaływują na komórki pierwotniaków i/lub grzybów,
Klasyfikacja antybiotyków:
Beta-laktamy: penicyliny, cefalosporyny, monobactamy, karbapenemy, inhibitory beta-laktamaz
Aminoglikozydy
Tetracykliny
Antybiotyki makrolidowe
Linkozamidy
Streptograminy
Oksazolidynony
Antybiotyki glikopeptydowe
Sulfonamidy i trimetoprim
Nitroimidazole
Nitrofurany
Chinolony i fluorochinolony
Sposób działania
Bakteriobójczy zależny od:
a) stężenia
b) czasu działania
Wyrażony przez najmniejsze stężenie bakteriobójcze MBC (minimal bactericidal activity
Bakteriostatyczny- zahamowanie wzrostu. Wyrażony przez najmniejsze stężenie hamujące (MIC, minimal inhibitory concentration) w mg/L.
Mechanizm działania antybiotyków na komórkę bakteryjną antybiotyki
A) blokowanie syntezy ściany komórkowej
B) uszkodzenie błony cytoplazmatycznej
C) blokowanie biosyntezy białka
D) blokowanie syntezy DNA
E) konkurencyjne wnikanie w łańcuch metaboliczny
Mechanizmy oporności bakteryjnej
Naturalna oporność/oporność nabyta-odporność
A) Zmiany w budowie ściany komórkowej. Lek nie może dostać się do wnętrza komórki.
B) Wytwarzanie „białek-pomp”, aktywnie usuwających lek z komórki, zanim jeszcze zacznie działać.
C) Produkcja enzymów rozkładających lub dezaktywujących lek.
D) Mutacje likwidujące lub zmieniające cel dal antybiotyku, np.zmiana białka-kanału w ścianie komórki, uniemożliwiająca wnikanie antybiotyku do wnętrza k-ki.
Mechanizmy oporności bakteryjnej
E) Niezwykle skomplikowany mechanizm oporności prezentują enterokoki na wankomycynę, jako wynik licznych zmian wielu genów. Mechanizm ten przez wiele lat uważano za „oporność niemożliwą”. Czas potrzebny bakteriom na jetgo stworzenie to 30 lat.
F) Oporność nabyta drogą wymiany materiału genetycznego zawierającego geny oporności (plazmidy, transpozony).
Wykorzystanie antybiotyków w produkcji zwierzęcej
Nadużywanie stosowania antybiotyków nie dotyczy tylko środowiska medycznego.
Od końca lat 40-tych ubiegłego wieku antybiotyki znalazły ogromne zastosowanie w weterynarii i rolnictwie w hodowli zwierząt, jako stymulatory wzrostu (ASW).
W drugiej połowie lat czterdziestych XX wieku zaczęto dodawać do pasz antybiotyki. Liczne przeprowadzone badania w USA i Wielkiej Brytanii w latach pięćdziesiątych i sześćdziesiątych XX wieku udokumentowały naukowo sens i cel podawania antybiotyków zwierzętom. Zauważono wówczas:
1. lepsze przyrosty masy ciała
2. mniejsze zużycie paszy
3. poprawienie ogólnej zdrowotności zwierząt
4. zapobieganie wielu dokuczliwym chorobom
5. lepsze wykorzystanie paszy podczas opasu i odchowu cieląt, prosiąt i drobiu
W Polsce antybiotyki zaczęto stosować do pasz na większą skalę dopiero w latach 1968-1970.
Do coraz większego i upowszechnienia przyczyniły się niewątpliwie postępy w zakresie technologii produkcji.
Początkowo do pasz wprowadzano substancje antybiotyczne będące produktami ubocznymi (grzybnie z kadzi fermentacyjnych nasycone antybiotykiem), powstającymi podczas produkcji antybiotyków dla ludzi.
Czyste antybiotyki były lekami zbyt drogimi, aby podawano je zwierzętom.
Wykaz najważniejszych antybiotyków dodawanych do pasz w ciągu ostatnich 58 latach:
Nazwa antybiotyku
1. Awilamycyna 11. Nowobiocyna
2. Bacytracyna 12. Nystatyna
3. chlorotetracyklina 13. Tetracykliny
4. Erytromycyna 14. Penicylina
5. Flawomycyna 15. Spiramycyna
6. Griseofulwina 16. Wirginiamycyna
7. Hygromycyna 17. Monenzyna
8. Kormogrizyna 18. Awiamycyna
9. Linkomycyna 19. Salinomycyna
10. Neomycyna 20. Tiamulina
Mechanizm działania Antybiotykowych Stymulatorów Wzrostu ASW
1. Działanie układowe (systemowe) antybiotyków-wpływ antybiotyków na procesy biochemiczne w komórkach somatycznych oraz w gruczołach dokrewnych. Antybiotyki mogą wpływać na układ hormonalny, indukując lub nasilając znane reakcje biochemiczne, które w rezultacie pobudzają procesy anaboliczne.
2. Działanie miejscowe, w obrębie układu pokarmowego.
Antybiotyki dzięki właściwościom bakteriostatycznym i (lub) bakteriobójczym wpływają na stosunki ilościowe oraz skład jakościowy mikroflory przewodu pokarmowego, przez co modyfikują procesy trawienia i wchłaniania składników pokarmowych.
3. Zmniejszają grubość ścian jelit. Pogląd ten nigdy nie został dostatecznie udowodniony.
4. Modyfikują czynności układu immunologicznego. Działają immunosupresjnie na układ immunologiczny prowadzi do zwiększonego ryzyka wystąpienia infekcji i w rezultacie do spadu produkcyjności zwierząt. Układ immunologiczny jest, np. osłabiany przez tylozynę, linkomycynę i tetracykliny.
- Uważano, że antybiotyki zwiększają stopień wykorzystania witamin i zapobiegają ich rozkładowi przez mikroflorę. Stwierdzono, np. że tetracykliny nie mają wpływu na wchłanianie witaminy B12, soli mineralnych i cukrów (pogląd okazał się fałszywy. Przeprowadzone badania w wielu ośrodkach nie wykazały wpływu antybiotyków na stopień przyswajania witamin przez organizm zwierzęcy)
Brak logicznego i naukowego wytłumaczenia mechanizmu działania antybiotyku jako stymulatora wzrostu.
- Inaktywowano antybiotyki w wysokiej temperaturze, traciły one aktywność hamowania wzrostu i rozwoju bakterii, a pomimo to wyniki produkcyjne były takie same jak przed inaktywacją antybiotyku.
- W wielu badaniach nie widziano różnicy w efektywności produkcyjnej między grupą kontrolną a grupą otrzymującą antybiotykowy stymulator wzrostu.
- Tłumaczenie wpływu modyfikującego skład jakościowy i ilościowy mikroflory bakteryjnej przewodu pokarmowego jest mało przekonujące i mało racjonalne dla specjalisty farmakologa i biochemika.
- Istnieje wiele innych substancji, którymi można wpływać na mikroflorę układu pokarmowego, a mimo to nie zostały one wypromowane jako stymulatory wzrostu.
- W historii medycyny nie potwierdzono naukowo, aby antybiotyk stymulował wzrost i rozwój człowieka lub miał wpływ zwiększający przyrost mięśni szkieletowych.
Procesy fizjologiczne w tkankach różnych zwierząt ssących jak i człowieka na poziomie molekularnym są podobne, więc tłumaczenie, że u zwierząt działa jest fałszem.
3. Brak powtarzalności wyników badań naukowych nad stymulującym wzrost wpływem antybiotyków. Wiele badań wykazujących stymulujący wpływ antybiotyków na wzrost mięśni nie spełniało ogólnie przyjętych w nauce standardów i wymogów i raczej można je było zaliczyć do obserwacji, na które wpływało wiele czynników środowiskowych i endogennych. Upłynęło wiele lat zanim wycofano z pasz nitrofurazon, sulfametazynę czy bacytracynę. Dopiero po ok. 20 latach zrozumiano, że te substancje na prawdę nie dawały większych przyrostów masy ciała.
Skutki wykorzystywania antybiotyków w hodowli zwierząt
- Antybiotyki o szerokim zakresie działania hamują rozwój wielu drobnoustrojów, także saprofitycznych, składających się na fizjologiczną mikroflorę organizmu zwierząt i ludzi.
- Szkodliwy wpływ antybiotyków na symbiotyczną mikroflorę określono mianem dysbakteriozy. Dysbakterioza prowadzi do zmian patologicznych błon śluzowych, nadkażeń i hipowitaminoz
- W związku z wprowadzeniem i powszechnym stosowaniem coraz większego asortymentu antybiotyków w sposób nieprawidłowy nastąpił u ludzi i zwierząt wzrost zakażeń grzybami patogennymi, wirusami i chlamydiami.
- Kolejnym następstwem dodawania antybiotyków do pasz i stosowaniem ich w przypadkach nieuzasadnionych (np. profilaktycznie przy chorobach wirusowych) jest pojawienie się enzymów bakteryjnych inaktywujących antybiotyki. Medycyna wzmaga się obecnie z problemem beta-laktamazy, dehydropeptydazy oraz enzymami unieczynniającymi antybiotyki aminoglikozydowe
Pomimo że antybiotyki podaje się w małych ilościach, duża skala hodowli prowadzi do ogromnego ich zużycia. Jako dodatki do paszy stosuje się ponad 100 razy więcej antybiotyków niż w leczeniu ludzi! Zagrożenie jest tym poważniejsze, że flora bakteryjna towarzysząca zwierzętom jest bardzo zbliżona do ludzkiej. Na efekty nie trzeba było długo czekać. Już w latach sześćdziesiątych doszło do licznych zgonów ludzi, którzy, jedząc mięso zwierząt karmionych antybiotykami, zakazili się opornymi na wiele leków szczepami Salmonella.
- W 1987 roku w Monachium powstało Europejskie Towarzystwo BICON, które postawiło sobie za cel - zwrócić uwagę lekarzy i farmakologów na immunosupresyjne działanie antybiotyków oraz na konieczność kojarzenia antybiotykoterapii z immunostymulacją za pomocą odpowiednich bioimmunomodulatorów.
- W 1998 roku wprowadzono w Unii Europejskiej zakaz dodawania do pasz antybiotyków, wykorzystywanych w leczeniu ludzi.
- W 2006roku Komisja Europejska podjęła decyzję o wycofaniu w pozostałych antybiotyków (monenzyna, flawomycyna, awilamycyna i salinomycyna), wprowadzanych do pasz jako stymulatory wzrostu dla zwierząt.
- W Polsce powstał Narodowy Program Ochrony Antybiotyków, pod kierunkiem prof,. Dr ha. Walerii Hryniewicz
TECHNIKI FINGERPRINTING
Konwencjonalne metody różnicowania w obrębie gatunku mimo utrwalonych zalet obarczone są licznymi ograniczeniami, związanymi z niską siłą dyskryminacyjną, czy brakiem powtarzalności.
Zaletą technik molekularnych jest:
skrócenie czasu wykonywanych analiz, zmniejszenie kosztów,
pracochłonności,
a także uniwersalność stosowanej aparatury i odczynników w porównaniu z metodami klasycznymi.
Jednak decydujące znaczenie dla wiarygodności badań ma wybór odpowiedniej metody genotypowania i interpretacja wyników
Podstawą technik typowania wewnątrzgatunkowego=fingerprinting jest ujawnienie polimorfizmu
-Polimorfizm objawia się charakterystycznym dla każdego izolatu obrazem produktów
amplifikacji lub też obrazem wzorów restrykcyjnych.
- Do zmian sekwencji matrycy DNA może dojść wskutek wielu zdarzeń genetycznych,
takich jak: mutacje punktowe, inwersje, delecje, czy inne reorganizacje nabyte w
ciągu życia osobniczego
POLIMORFIZM DNA
W obrębie DNA można wyróżnić rozrzucone w całym genomie, powtarzające się wiele razy sekwencje nukleotydów, które zależnie od długości powtarzającego się docinka i częstości jego powtórzeń nazywamy:
- Minisatelitarnym DNA zawierającym sekwencje tandemowych VNTR
(ang.variable number oftandem repeats=liczba powtorzen tandemowych)
- Mikrosatelitarnym DNA, zawierającym sekwencjami STR (ang. short tandem
repeats= sekwencj e mikro satelitarne) to sekwencj e zawieraj ące od 10 - 5O powtórzeń motywu o długości do 6 par zasad.
Na podstawie różnic występujących w tych obszarach oparte są wszystkie metody fingerprinting. Techniki fingerprinting sprowadzają się do dwóch podstawowych strategii:
>- Pierwsza z nich opiera się na analizie polimorfizmu długości fragmentów
restrykcyjnych DNA (RFLP, PFGE)
>- Druga dotyczy analizy produktów łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR - Polimerase
Chain Reaction).
Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych może dotyczyć:
- chromosomalnego DNA (REA - Restriction Endonucleasis Analysis),
- Genomowego DNA (RFLP - Restriction Fragment Lenght Polymorphism,
polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych),
- analizy makrorestrykcyjnej (PFGE - Pulse-Field Gel Electrophoresis, elektroforeza w zmiennym polu elektrycznym),
- plazmidowego DNA (REAP - Restriction Endonuclease Analysis ofPlasmid DNA),
- czy poszczególnych genów (PCR-RFLP, polimorfizm długości fragmentów
restrykcyjnych produktów PCR).
PCR - fingerprinting
Strategia tych metod opiera się na amplifikacji nieznanych sekwencji, polimorficznych DNA . z użyciem "przypadkowych"starterów.
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) najczęściej stosowana, wykorzystywana do wykrywania polimorfizmu pomiędzy blisko spokrewnionymi izolatami/szczepami/osobnikami wśród różnych populacji tego samego gatunku. Wzory amplifikacji powstają przy zastosowaniu pojedynczego starteru o wielkości ok. 10 p.z. oraz niskiej temperatury wiązania starterów. Wielkość otrzymywanych fragmentów waha się od kilkuset do ok. 2-2,5 tys. p.Z. Najczęściej uzyskiwany jest niski stopień skomplikowania profilu amplifikacji (ok. 10 produktów).
AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR) stosowane są dwa dłuższe, różne startery (ok. 20 p.z.), a profil amplifikacji jest bardziej złożony niż w reakcji RAPD (średnio od 10-ciu do kilkunastu produktów)
DAF (DNA Amplification Fingerprinting
Stosowany jest krótki primer (5-8 p.z.) w stężeniach lO-krotnie wyższych niż w technikach AP-PCR i RAPD, a stopień skomplikowania profilu jest bardzo wysoki.
FINGERPRINTING
Zalety:
- uniwersalność,
- nie jest konieczna wiedza o budowie badanych genomów,
- spełnia wymagane kryteria typowalności,
- możliwości dyskryminacyjne określane jako nieograniczone,
- niskie koszty analiz
PROBLEMY:
- można stwierdzić, że dwa różne wzory produktów PCR - fingerprinting
reprezentują różne szczepy (organizmy),
- nie można stwierdzić, że dwa iednakowe wzory reprezentuią ten sam szczep
( organizm),
- im więcej prążków we wzorze, tym pewniejsza diagnoza,
- im więcej przebadanych przypadków, tym pewniejsza diagnoza
ZASADY PRACY TECHNIKAMI FINGERPRINTING:
:; Optymalizacja!
- zastosowanie identycznej metody i warunków izolacji matrycowego DNA,
- używanie jednakowej ilości (stężenia) matrycy DNA w każdej reakcji,
- używanie tych samych odczynników w całej serii doświadczeń,
- używanie tego samego sprzętu (np. termocyklera) w całej serii doświadczeń.
Pulsed Field Gel Electrophoreasis- PFGE
:; elektroforeza w zmiennym polu elektrycznym
:; "złoty środek"
:; trudna
:; praco- i czasochłonna
:; droga
W doświadczeniach mających na celu typowanie mikroorganizmów bardzo cenne okazuje się zastosowanie analizy restrykcyjnej. Technika ta polega na poddaniu nienaruszonego totalnego DNA genomowego trawieniu enzymatycznemu z zastosowaniem restryktaz. Liczba i wielkość otrzymywanych fragmentów DNA determinowana jest przez ilość i rozmieszczenie sekwencji rozpoznawanych przez enzym restrykcyjny. Rozdział dokonuje się wagarozowej elektroforezie pulsowej (PFGE - pulsed field gel electrophoresis)
Jest to odmiana elektroforezy w żelu agarozowym pozwalająca na rozdział i analizę DNA wielkocząsteczkowego (20kb-2Mb). Ocenę stopnia podobieństwa izolatów wykonuje się
rozdzielając strawione DNA chromosomalne w zmiennym polu elektrycznym. DNA chromosomalne izolowane jest po zatopieniu komórek mikroorganizmu w bloczkach agarozowych (aby zapobiec mechanicznemu pofragmentowaniu) i w tej formie poddawane trawieniu restrykcyjnemu a następnie rozdziałowi elektroforetycznemu. Enzymy restrykcyjne do trawienia DNA chromosomalnego dobiera się z grupy tzw. restryktaz rzadkotnących, rozpoznających długie sekwencje nukleotydowe i generujących 17-30 fragmentów DNA. Warunki elektroforezy zależą przede wszystkim od wielkości oczekiwanych fragmentów DNA oraz ich ilości
PFGE pozwala na powtarzalne uzyskiwanie profili restrykcyjnych odzwierciedlających całość chromosomu bakteryjnego. Ponieważ pojedyncze mutacje/ rearanżacje mogą występować w genomach poszczególnych izolatów tego samego klonu, przyjęto iż za szczepy podobne uznaje się izolaty, których wzory restrykcyjne nie są identyczne. Prace porównawcze ujawniły konieczność unifikacji systemu interpretacji uzyskiwanych wzorów restrykcyjnych. Najpopularniejszy jest system zaproponowany przez Tenovera i wsp. (1995), zgodnie z którym wyróżniono:
szczepy nierozróżnialne - brak różnic we wzorze,
szczepy blisko spokrewnione - 3 różnice lub mniej,
szczepy potencjalnie spokrewnione - 4-6 różnic,
szczepy niespokrewnione - powyżej 6 różnic.
Technika ta stosowana jest m.in. w typowaniu szczepów pochodzących z zakażeń szpitalnych. Wydaje się, że jest techniką najlepszą z dostępnych; zapewnia uzyskiwanie łatwych do porównania wzorów DNA w sposób powtarzalny niezależnie od rodzaju mikroorganizmu (co czyni ją przydatną do analizy wszystkich mikroorganizmów, z których możliwe jest wyizolowanie DNA odpowiedniej jakości). Wszystkie szczepy są dzięki niej typowalne. Liczne badania porównawcze wykazały wyższość tej metody w zestawieniu
z innymi technikami molekularnymi i klasycznymi.
Za wady PFGE należy uznać pracochłonność i czasochłonność (minimalny czas oznaczenia to 7 dni), konieczność posiadania dobrze wykwalifikowanego personelu oraz dobrego zaplecza molekularnego, kosztowność odczynników i sprzętu. Dodatkowo, w każdym przypadku konieczna jest optymalizacja techniki przy typowaniu nowych gatunków mikroorganizmów, a część z nich (np. Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori) wymaga nietypowych procedur izolacji DNA. Wadą metody jest również częste zachodzenie i pokrywanie się fragmentów DNA o zbliżonej wielkości, co powoduje, iż otrzymany obraz elektroforetyczny staje się trudny w interpretacji. Otrzymane wzory restrykcyjne mogą także zostać zafałszowane przez fragmenty pochodzące z plazmidowego DNA, izolującego się łącznie z DNA chromosomalnym