Łoś Monika Poniedziałek, 12.15-16.00

Kowalczyk Katarzyna

Ryder Marta

Ćwiczenie 4

Hodowla w stałym podłożu

I. Wstęp teoretyczny

Solid state fermentation (hodowla w podłożu stałym) to metoda hodowli drobnoustrojów prowadzona na lub w pobliżu powierzchni wilgotnego, stałego substratu, stanowiącego pożywkę i miejsce bytowania mikroorganizmów.

Podłoże SSF składa się z odpowiednio przygotowanych składników naturalnych. Wielkość cząstek powinna wahać się w przedziale 1-8 mm. Jest to bardzo istotny parametr, ze względu na umożliwienie odpowiedniej wymiany ciepła. Podczas hodowli w stałym podłożu szczególnej uwagi wymagają takie parametry jak: temperatura i pH, napowietrzanie i mieszanie oraz aktywność wodna środowiska. Woda w hodowlach stałych tworzy filtr wokół cząsteczek, zapewniając drobnoustrojom kontakt z substancjami odżywczymi oraz fazą gazową. Podczas trwania procesu zawartość wody się zmienia na skutek aktywności metabolicznej drobnoustrojów oraz parowania. Zbyt niski poziom wilgotności powoduje ograniczenie wzrostu i stopnia pęcznienia substratu. Natomiast zbyt wysoki do zmniejszenia porowatości, przez co następuje ograniczenie dyfuzji tlenu i spadek tempa wymiany gazowej. W związku z tym powietrze doprowadzane do hodowli powinno być odpowiedniej wilgotności.

Hodowle SFF polecane są dla drobnoustrojów tlenowych nie wytwarzających śluzów oraz nie wymagających dużej zawartości wody w złożu - pleśni, promieniowców oraz niektórych gatunków drożdży i bakterii.

Hodowle w podłożu stałym wykazują szereg zalet:

• wzrost drobnoustrojów przebiega w warunkach zbliżonych do ich naturalnego środowiska,

• mała wilgotność zmniejsza niebezpieczeństwo zakażenia hodowli,

• możliwe zwiększenie wydajności otrzymanego produktu,

• możliwość stosowania form przetrwanych do szczepienia hodowli pozwala to na wyeliminowanie hodowli inokularnych w fermentorach,

• produkt może być ekstrahowany ze stałego podłoża natychmiast po hodowli lub może być przechowywany w zamrożonym stanie,

• pozostałość po hodowli może być użyta jako pasza dla zwierząt,

• odpady pofermentacyjne nie stanowią zanieczyszczenia środowiska.

Metoda ta nie jest wolna od wad, wśród których można wymienić:

• obróbka wstępna pewnych substratów może być niekiedy skomplikowana (np. odtłuszczanie),

• zraszanie w początkowej fazie fermentacji może powodować zakażenia,

• utrudnione powiększanie skali,

• utrudniona kontrola parametrów procesu: pH, temperatury, natlenienia, wilgotności.

II. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest poznanie metody hodowli drobnoustrojów w stałym podłożu oraz aparatury służącej do prowadzenia tego procesu.

III. Wykonanie ćwiczenia:

Jako materiału biologicznego do hodowli w podłożu stałym użyto szczepów bakterii Bacillus licheniformis. Fermentację prowadzono przez dwie doby w temperaturze 36^oC.

Skład podłoża użytego w hodowli:

substraty stałe - 20g

otręby pszenne 17g

wytłoki sojowe 3g

roztwór soli - 10ml

Kolejne kolby różniły się zawartością wody dodanej dla zwiększenia wilgotności. Jej zawartość wynosiła 0, 5, 10 oraz 25 ml.

Następnie, w celu ekstrakcji enzymu, do kolb dodano po 100ml wody destylowanej i wstawiono je na wytrząsarkę na 30 minut. Po ekstrakcji odwirowano części stałe zawiesiny, pobrano 0,5 ml supernatantu i rozcieńczono go odpowiednio(100x oraz 200x) w celu oznaczenia aktywności α-amylazy.

Aktywność α-amylazy oznaczano metodą Fishera-Steina:

Do 0,5ml rozcieńczonego enzymu dodano 0,5ml 1% roztworu skrobi rozpuszczalnej. Inkubowano w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, a następnie dodawano 1ml kwasu 3,5-dinitrosalicylowego, w celu zatrzymania reakcji. Mieszaninę inkubowano przez 5 minut we wrzącej łaźni, wystudzono i dodano 8 ml wody destylowanej. Próbę kontrolną wykonano w taki sam sposób stosując wodę destylowaną zamiast roztworu enzymu. Absorbancję mierzono na spektrofotokolorymetrze przy długości fali 540nm.

Aktywność obliczano ze wzoru:

,

gdzie:

ΔA - różnica absorbancji,

R - rozcieńczenie,

N = 4,

100 - objętość ekstrahenta,

1000 - przeliczenie na μmol,

3 - czas reakcji,

m₂ - masa złoża po fermentacji,

360 - masa molowa maltozy.

Tak obliczona aktywność wyrażona jest w międzynarodowej jednostce aktywności - jest to taka ilość enzymu, która uwalnia z substratu 1 μmol produktu na minutę. Wyraża się ją na gram wilgotnego złoża.

Nasza grupa wykonywała pomiary dla kolby nie zawierającej dodatkowej wody. Uzyskane pomiary absorbancji:

rozcieńczenie 100-krotne: 0,7

rozcieńczenie 200-krotne: 0,32

Przykładowe obliczenie:

Zestawienie wyników:

Ilość wody [ml]	Wilgotność [%]	pH	m1 [g]	m2 [g]	m1-m2 [g]	Aktywności α-amylazy [J/1g wilgotnego złoża]	Średnia aktywność α-amylazy [J/1g wilgotnego złoża]
0	33	7,54	30	28,6	1,4	907 829 479 635	790
5	43	7,46	35	32,9	2,1	1180 1214 719 1012	1135
10	50	7,38	40	37,5	2,5	533 810 494 790	711
25	64	6,94	55	51,5	3,5	366 445 234 126	348

Wykres zależności aktywności α-amylazy od wilgotności złoża:

IV. Wnioski

Z wykonanych przez nas oznaczeń wynika, że największa aktywność
α-amylazy przypada na objętość wody dodanej do złoża wynoszącą 5ml, co odpowiada wilgotności równej 43%. Możemy zaobserwować spadek pH wraz ze wzrostem wilgotności. pH w naszych hodowlach wahało się w zakresie od 7,54 do 6,94. Wzrost wilgotności związany był również ze wzrostem ubytku masy hodowli. Dla hodowli o wilgotności 33% wynosił on 1,4 g, natomiast dla hodowli o zawartości wilgoci 64% był on równy już 3,5g.

---