METODY IMMUNOENZYMATYCZNE

U podstaw tych metod leżą specyficzne reakcje między antygenem a przeciwciałem, zdeterminowane strukturą obu tych składników.

Podział:

1. metody aglutynacyjne, stosowane najczęściej do analizy antygenów ścian komórkowych, identyfikacji bakterii i pleśni

2. immunoelektroforetyczne

3. radioimmunologiczne (RIA) z zastosowaniem przeciwciał znakowanych radioizotopami ³H, ¹⁴C, charakteryzujące się możliwościami detekcji substancji wielkocząsteczkowych, przy stężeniu ng/ml-mg/ml

4. metody immunoenzymatyczne (EIA), w tym:

• metody immunosorpcji skoniugowanych enzymów (ELISA), w których stosuje się przeciwciała lub antygeny znakowane enzymami

• metody EMIT, technika immunooznaczania ze zwielokrotnioną reakcją enzymatyczną

• metody z zastosowaniem przeciwciał znakowanych chemiluminescencyjnymi i fluoroscencyjnymi znacznikami, stosowane z mikroskopią optyczną w badaniach struktur tkankowych i komórkowych (histopatologia)

• metody immunometryczne, polegające na wykorzystaniu możliwości detekcji metabolitów wytwarzanych w bardzo małych ilościach przez pojedyńcze żywe komórki (ELISPOT)

• metody immunometryczne, polegające na analizie zmian właściwości optycznych biosensorów w wyniku pokrycia ich powierzchni odpowiednimi przeciwciałami

• metody z zastosowaniem przeciwciał znakowanych koloidalnym złotem (najczęściej stosowane w połączeniu z techniką mikroskopii elektronowej do badań struktur komórkowych i subkomórkowych)

Jeżeli reakcja zachodzi w jednej fazie (w roztworze) to określa się ją jako metodę homogenną

Jeżeli jest zastosowane zjawisko wstępnej sorpcji antygenu lub przeciwciała na nośniku stałym (mikropłytkach, probówkach) to tego typu metody określa się jako heterogenne.

Wśród metod heterogennych wyróżnia się:

1. współzawodnicze, stosowane do antygenów, które mają jeden fragment rozpoznawany przez specyficzne przeciwciało

2. niewspółzawodnicze, przeznaczone do określania obecności również większych antygenów wielowartościowych

W zależności od sposobu i rodzaju użytych przeciwciał, wyróżnia się:

1. metody bezpośrednie, w których używa się przeciwciała bezpośrednio skierowanego w stosunku do badanego antygenu, znakowanego enzymem (rzadko stosowana)

2. metody pośrednie: dwu- i trzystopniowe, polegające na użyciu wtórnych przeciwciał skoniugowanych najczęściej ze znacznikiem

Najczęściej stosowanymi metodami są:

1. ELISA bezpośrednia współzawodnicza (Direct Competitive ELISA)

2. ELISA pośrednia współzawodnicza (Indirect Competitive ELISA)

3. test wykrywania specyficznych przeciwciał

4. ELISA kanapkowa

5. metoda podwójnego znakowania

Zestawienie różnic między metodami współzawodniczymi i niewspółzawodniczymi

parametr	Metody współzawodnicze	Metody niewspółzawodnicze
Czułość	Ograniczenie wynikające z powinowactwa przeciwciał; w praktyce długość inkubacji	Ograniczenie wynikające z niespecyficznego wiązania i specyficznej aktywności znacznika
Precyzja	-	Metody zazwyczaj lepsze, głównie w przypadku analiz prowadzonych w warunkach poza optymalnym zakresem
Zakres badań	Wąski: ograniczony małymi różnicami, między śladowym wiązaniem przy zerowej aktywności antygenu, a wiązaniami niespecyficznymi	Szeroki: ograniczony zdolnością wiązania i wystąpieniem wiązań niespecyficznych
Rodzaj oddziaływań	Wiązanie pojedyn. fragmentów	Równoległe wiązania wielokrotne
Wymagania w stosunku do odczynników	Małe stężenie pojedynczego przeciwciała, znaczniki o najwyższym stopniu czystości	Wysoki stopień oczyszczenia odczynników, znaczniki szczególnie wysokiej jakości

Etapy wykonania:

1. Wymieszanie przeciwciał z próbą zawierającą antygen oraz z antygenem znakowanym enzymem; w tej operacji badany antygen konkuruje z dodanym znakowanym antygenem o związanie z przeciwciałem

2. dodatek do mieszaniny reakcyjnej, odpowiedniego do zastosowanego enzymu - znacznika, substratu (ilość powstającego produktu barwnego jest proporcjonalna do ilości antygenu w próbie)

3. odczyt absorbancji

ZALETY:

1. prostota i szybkość wykonania

2. bardzo małe zużycie prób analizowanych i odczynników

3. możliwość stosowania prób nieznacznie tylko oczyszczonych lub nieoczyszczonych - ze względu na specyficzność oddziaływań między antygenem a przeciwciałem

4. możliwość jednoczesnego oznaczania kilku prób, zarówno kontrolnych jak i badanych

5. coraz większa dostępność gotowych zestawów

ZASTOSOWANIE:

1. wykrywanie obecności różnych rodzajów mięsa, dodatków do żywności, m.in. białek roślinnych do wyrobów wędliniarskich i mięsnych

2. enzymów i inhibitorów

3. witamin, hormonów, pestycydów i herbicydów w wodzie i w warzywach

4. antybiotyków

5. drobnoustrojów i produktów ich metabolizmu

6. związków alergennych

---