Spektrofotometryczna metoda oznaczania aktywności peroksydazy.

Reakcje charakterystyczne sacharydów.

Spektrofotometryczna metoda oznaczania aktywności peroksydazy

Wykonanie:

Wykonujemy 3 próby: kontrolną (bez enzymu), materiałową (bez nadtlenku wodoru) oraz pełną. W tym celu dodajemy po 0,15 ml buforu fosforanowego do każdej z probówek, 0,5 ml enzymu do wszystkich poza próbą kontrolną i odpowiednią ilość wody destylowanej do każdej z probówek. Całość inkubujemy przez 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po tym czasie dodajemy 0,5 ml nadtlenku wodoru i 0,15 ml pirogalolu i całość dalej inkubujemy jeszcze przez 10 minut. Później do każdej z probówek dodajemy 0,5 ml kwasu siarkowego, 0,5 ml siarczynu sodowego i 2,5 ml wody destylowanej. Absorbancję uzyskanych roztworów badamy przy długości fali 430 nm.

Wyniki i obliczenia:

Od średnich wartości absorbancji prób pełnych odejmujemy średnią wartość absorbancji prób materiałowych.

L.p. pomiaru	Próba pełna	Próba materiałowa	Różnica
1.	0,094	0,007	0,087
2.	0,148	0,002	0,146

Wartość purpurogaliny odczytana z krzywej wzorcowej: 850 µg

Zawartość w kolbce: 1,5 ml

0,5 ml - 850 µg

25 ml - x x = 42 500 μg

1,5 ml - 42 500 μg

1000 ml - y y = 28 333 333 μg

Masa molowa purpurogaliny: 220 μg/μmol

Liczba moli = 128 787 μmol

Aktywność :

128 787 μmol * 1g / 2,5g = 51 515 μmol

51 515 μmol * 1 min / 10 min = 5151,5 μmol

Reakcje charakterystyczne sacharydów:

Wykonanie:

Do przeprowadzenia poniższych reakcji używamy glukozy (aldoheksoza), fruktozy (ketoheksoza), arabinozy (aldopentoza), sacharozy (disacharyd nieredukujący) i maltozy (disacharyd redukujący). Reakcje przeprowadzane na ćwiczeniach: reakcja Benedicta, hydroliza kwasowa sacharozy i skrobi, reakcja Barfoeda, reakcja Seliwanowa, reakcja Biala, reakcja skrobi i glikogenu z jodem.

Wyniki, które uzyskaliśmy w poszczególnych reakcjach są naszymi próbami kontrolnymi, w stosunku do otrzymanego do identyfikacji sacharydu.

1. Reakcja Benedicta ( charakterystyczna dla cukrów redukujących) - reakcja zachodzi (powstaje ceglasty osad) - wskazuje to na glukozę, fruktozę lub maltozę

2. Reakcja Barfoeda (charakterystyczna dla monosacharydów redukujących) - reakcja zachodzi (powstaje ceglasty osad tlenku miedzi (I)) - wskazuje na glukozę lub fruktozę

3. Reakcja z jodem - brak ciemnego zabarwienia - badanym sacharydem nie jest ani skrobia (brak granatowego zabarwienia) ani glikogen (brak brunatnego zabarwienia)

4. Hydroliza kwasowa - brak charakterystycznych dla skrobi (brak granatowego zabarwienia) czy sacharozy (brak warstwowego ceglastego osadu) wyników reakcji

5. Reakcja Seliwanowa ( charakterystyczna dla ketoz) - reakcja zachodzi - zabarwienie łososiowe

6. Reakcja Biala (charakterystyczna dla pentoz) - reakcja nie zachodzi - brak zielonego zabarwienia

Wnioski:

Powyższe wyniki wskazują na fruktozę.

1

---