STRONA TYTUŁOWA
Michał Krawczyk1, Marek Zięba2, Iwona Grzelewska-Rzymowska2, Sylwia Kwiatkowska1
Tytuł: Budowa chemiczna prątka gruźlicy. Część II, białka.
1Oddział Kliniczny Pneumonologii Katedry Pielęgniarstwa Klinicznego, UM w Łodzi, kierownik: dr hab. med. S. Kwiatkowska
2Klinika Gruźlicy, Chorób i Nowotworów Płuc UM w Łodzi, kierownik: prof. dr hab. med. I. Grzelewska-Rzymowska
STRESZCZENIA
Budowa chemiczna prątka gruźlicy. Część II, białka.
Krawczyk M., Zięba M., Grzelewska-Rzymowska I., Kwiatkowska S.
Oddział Kliniczny Pneumonologii Katedry Pielęgniarstwa Klinicznego, UM w Łodzi
Klinika Gruźlicy, Chorób i Nowotworów Płuc UM w Łodzi
W pracy przedstawiono budowę komórki prątka gruźlicy poddając analizie rodzaje występujących w nim białek. Omówiono białka cytoplazmatyczne oraz wydzielnicze, ich funkcję oraz rolę w procesach immunologicznych. Przedstawiono wynikające stąd niektóre aspekty diagnostyczne oraz terapeutyczne.
Słowa kluczowe: prątek gruźlicy, gruźlica, białka
Chemical structure of Mycobacterium tuberculosis. Proteins.
Krawczyk M., Zięba M., Grzelewska-Rzymowska I., Kwiatkowska S.
In this paper the structure of M. tuberculosis cell, especially mycobacterial proteins were analized. Cytoplasmatic and secretory proteins were reviewed according to their function and the role in immunological reactions. Some diagnostic and therapeutic aspects were demonstrated.
Key words: Mycobacterium tuberculosis, tuberculosis, proteins
Michał Krawczyk
adres służbowy:
Oddział Kliniczny Pneumonologii Katedry Pielęgniarstwa Klinicznego
Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
w
WZ ZOZ Centrum Leczenia Chorób Płuc i Rehabilitacji
ul. Okólna 181, 91-520 Łódź
adres prywatny:
ul. ks. J. Popiełuszki 39a m. 14, 94-053 Łódź
tel. 042 61 77 295, kom.: 513 085 443
e-mail: mika-el@wp.pl
Budowa chemiczna prątka
Część II, białka
Wstęp
W 1998 roku została opublikowana przez Stewarta T. Cole'a i współpracowników praca, w której po raz pierwszy przedstawiono pełną sekwencję genomu prątka gruźlicy (Mycobacterium tuberculosis, M. tuberculosis) należącego do szczepu H37Rv [6]. Ten patogenny szczep wyizolowany w 1905 roku do dziś jest najpowszechniej wykorzystywany w badaniach mikrobiologicznych i immunologicznych gruźlicy. Cztery lata po pierwszej publikacji ogłoszono uaktualnienie danych dotyczących badań genetycznych [5]. Prace te to „kroki milowe”, które w znacznym stopniu przybliżyły nas do pełniejszego zrozumienia struktury oraz fizjologii komórki M. tuberculosis.
Obecnie zakres badań obejmuje nie tylko poznanie mechanizmów biosyntezy, budowy i funkcji poszczególnych białek prątka oraz ich grup. Najnowsze osiągnięcia genomiki strukturalnej, proteomiki oraz bioinformatyki pozwalają na całościowe badanie proteomu bakteryjnego.
Nukleoid prątka tworzy kolista cząsteczka DNA o masie cząsteczkowej ok. 3×109 Da, zbudowana z 4411532 par zasad. Ok. 91% genomu stanowią geny kodujące różne białka bakteryjne, a także RNA (3995 sekwencji kodujących białka bakteryjne i 50 genów kodujących trwały RNA). Dotychczas przypisano ściśle określone funkcje 2058 poznanym białkom. Kolejne 39% stanowią białka wykazujące pewne podobieństwa z opisanymi dotychczas białkami innych organizmów, natomiast 9% białek to cząsteczki o nie poznanej jak dotąd funkcji [2].
Porównanie składu białek M. tuberculosis z białkami innych mikroorganizmów dowiodło, że statystycznie częściej do ich budowy wykorzystywane są aminokwasy takie jak: alanina, glicyna, prolina, arginina i tryptofan, które w sekwencji DNA są kodowane przez kodony bogate w guaninę i cytozynę. Rzadziej natomiast wykorzystywane są aminokwasy kodowane przez kodony bogate w adeninę i tyminę (asparagina, izoleucyna, lizyna, fenyloalanina, tyrozyna). Wszystkie te białka można podzielić ze względu na ich lokalizację i miejsce działania na trzy grupy: białka cytoplazmatyczne, białka związane ze ścianą komórkową i białka wydzielane do otaczającego komórkę środowiska [1].
Białka cytoplazmatyczne
Poznanie genomu najlepiej scharakteryzowanego szczepu M. tuberculosis, H37Rv, pozwoliło na wnioskowanie o ilości i budowie syntetyzowanych białek, z których większość stanowią białka enzymatyczne, katalizujące różnorodne reakcje chemiczne. W odróżnieniu od innych bakterii, znaczną część pojemności kodującej genomu zajmują geny, których białkowe produkty uczestniczą w syntezie i rozkładzie związków tłuszczowych. Zidentyfikowano ok. 250 różnych enzymów biorących udział w metabolizmie związków lipidowych [6]. Kolejną charakterystyczną cechę proteomu prątka gruźlicy stanowią dwie rodziny białek bogatych w glicynę, o kwaśnym odczynie: PE i PPE. Nazwy PE i PPE pochodzą od motywów Pro-Glu (PE) i Pro-Pro-Glu (PPE) zlokalizowanych w większości przypadków blisko N-końca cząsteczki białka. Geny kodujące odpowiednie sekwencje aminokwasowe zajmują ok. 10% pojemności kodującej całego genomu. Są one zgrupowane i zawierają dwa rodzaje sekwencji repetatywnych: polimorficzne, bogatych w guanozynę i cytozynę sekwencje powtarzające się (polymorphic GC-rich repetitive sequences, PGRSs) oraz główne, polimorficzne powtórki tandemowe (major polymorphic tandem repeats, MPTRs). Do rodziny PE należy 99 białek, a do rodziny PPE - 68. Każda z grup dzieli się dodatkowo na podrodziny. Komórkowa lokalizacja, jak i funkcja białek PE i PPE jest jak dotąd słabo poznana. Postuluje się, że geny tych protein mogą być źródłem różnorodności antygenowej prątków gruźlicy [30].
Wśród białek cytoplazmatycznych, które jako pierwsze zostały zidentyfikowane przy pomocy przeciwciał monoklonalnych, znajdują się białka wykazujące znaczną homologię z tzw. białkami szoku cieplnego (heat shock protein, Hsp). Występujące zarówno w eukariotycznych, jak i prokariotycznych komórkach, Hsp charakteryzują się podobieństwem budowy i pełnią rozmaite funkcje. Jedną z nich jest ułatwianie mikroorganizmom przystosowania się do zmian zachodzących w środowisku. W podwyższonej temperaturze, w obecności rodników tlenowych, jonów metali lub etanolu dochodzi do znacznego nasilenia procesów transkrypcji i translacji tych białek. Poza tym uczestniczą one także w procesach zwijania i składania nowo syntetyzowanych białek i peptydów.
U M. tuberculosis występuje m. in. białko o m. cz. 71 kDa, homologiczne z eukariotycznym Hsp 70 i DnaK E. coli, białko o m. cz. 65kDa, przypominające w dużym stopniu Hsp 60 występujące u Eucaryota i GroEL E. coli oraz białko o m. cz. 16 kDa (Hsp 16.3, Acr). Analogicznie do DnaK E. coli, mykobakteryjne białko 71 kDa posiada aktywność ATPazy i autofosforylazy, która może być modulowana poprzez jego wiązanie z białkami i peptydami. Natomiast białko homologiczne z GroEL wraz z innym białkiem (odpowiednikiem GroES) uczestniczy w procesie potranslacyjnej modyfikacji białek.
Białka te oddziałują z układem odpornościowym zwierząt i człowieka. Wykazano między innymi związek pomiędzy zaburzeniami autoimmunologicznymi a białkami szoku cieplnego, co spowodowało znaczne zmniejszenie zainteresowania tymi związkami jako antygenami szczepionkowymi [20, 23].
Białka wydzielane poza przestrzeń cytoplazmatyczną
Niektóre białka wytwarzane w cytoplazmie działają poza przestrzenią cytoplazmatyczną: w połączeniu z samą błoną cytoplazmatyczną albo w otaczającym komórkę środowisku. Choć nie wykazano, aby M. tuberculosis wydzielały jakiekolwiek egzotoksyny, to wiadomo, że produkują one i uwalniają do otaczającego środowiska szereg białek, które charakteryzują się wysoką skutecznością w wywoływaniu komórkowej odpowiedzi immunologicznej.
Badania przesączów hodowli M. tuberculosis dowiodły, że bakterie te wydzielają do otoczenia co najmniej 200 różnych białek (białka przesączu hodowlanego; culture filtrate proteins, CFPs), z których ponad 30 zostało scharakteryzowanych [11, 26].
Dotychczas poznano kilka układów aktywnego transportu białek poza komórkę bakteryjną. Szczególne zainteresowanie tymi procesami wynika z faktu, że wśród wydzielanych białek znajdują się czynniki chorobotwórczości jak i antygeny ochronne, a w związku z tym procesy transportu białek są ważne nie tylko z punktu widzenia fizjologii komórki prątka, lecz także patogenezy gruźlicy. Transport niektórych białek wymaga obecności w ich strukturze tzw. sekwencji sygnałowej (signal sequence), dzięki której rozpoznawane są przez białka układów transporujących. Do najlepiej poznanych systemów przenoszących białka poza obręb komórki należą: Sec, Tat (Twin-Arginine Translocation) oraz system transportujący wczesne wydzielnicze białko o masie cząsteczkowej 6 kDa (6 kDa early secretory antigenic target, ESAT-6) [7, 24].
Jednym z białek wydzielanych przez M. tuberculosis jest dysmutaza ponadtlenkowa (SOD; superoxide dismutase). Jest to enzym inaktywujący wolne rodniki tlenowe, produkowane i uwalniane do środowiska przez aktywowane makrofagi. Katalizuje w reakcji dysproporcjonacji przejście anionorodnika ponadtlenkowego w nadtlenek wodoru. Postuluje się, iż może dzięki temu ułatwiać przeżycie prątków w fagosomach tych komórek. Enzym ten transportowany jest poza cytoplazmę w sposób niezależny od sekwencji sygnałowej, którego mechanizm jak dotąd nie jest wyjaśniony [9].
Innym białkiem enzymatycznym wydzielanym poza komórkę jest dehydrogenaza L-alaniny. Uważa się, że ten działający zewnątrzkomórkowo enzym uczestniczy w syntezie ściany komórkowej, ponieważ L-alanina jest jednym z czterech aminokwasów tworzących wiązania peptydowe w warstwie peptydoglikanu [13].
W omawianej grupie protein znajduje się również kompleks białkowy o masie cząsteczkowej 30-32 kDa, w skład którego wchodzą 3 białka. Białka te tworzące tzw. kompleks antygenu 85 (Ag85 complex) to: 85A, 85B i 85C (inne nazwy to: MP44, MP59, MP45; FbpA, FbpB, FbpC2) o masach cząsteczkowych: 31, 30 i 30,5 kDa. Stanowią one 20-30% białek stwierdzanych w supernatancie hodowli komórkowych. Białka kompleksu Ag85 pełnią funkcję transferaz mikolowych, katalizujących przenoszenie długołańcuchowych kwasów mikolowych na pochodne trehalozy [27]. W 1987 r. Ratliff wykazał, że prątki mogą wiązać się z powierzchniami pokrytymi fibronektyną. Dalsze badania dowiodły, że właściwość ta jest związana z działaniem kompleksu Ag85. Choć białka te posiadają sekwencje sygnałowe, które są odłączane przed wydzieleniem z komórki, to pewna frakcja zostaje przynajmniej czasowo związana z powierzchnią komórki bakteryjnej. Postuluje się, że frakcja ta odgrywa rolę w przyleganiu prątków do komórek i w następstwie ich zakażania [25].
Kolejne wydzielnicze białko M. tuberculosis posiada masę cząsteczkową 24 kDa. Początkowo było ono wyizolowane z przesączów hodowli szczepu M. bovis BCG Tokyo i nazwane MPB64. Odpowiednik M. tuberculosis to MPT64. Zaobserwowano, że białko to posiada zdolność wywoływania nasilonej reakcji nadreaktywności typu opóźnionego u świnek morskich immunizowanych prątkami należącymi do „M. tuberculosis complex”. Ze względu na immunogenne właściwości i pobudzanie odpowiedzi limfocytów T, podjęto próby wykorzystania tego białka pojedynczo oraz łącznie z 85AgB w celu stworzenia szczepionek DNA, których skuteczność oceniano dotychczas jedynie na modelach zwierzęcych. W badaniach nad zwierzętami myszy), Tian i wsp. wykazali zdolność dwuwalentnej szczepionki DNA (Ag85B i MPT64) do wywoływania silnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko M. tuberculosis, ocenianej na podstawie miana swoistych przeciwciał, poziomu cytokin uwalnianych przez limfocyty T pomocnicze (Th1) oraz zmian histopatologicznych w miąższu płuc [14, 28].
Białko o masie cząsteczkowej 38 kDa.
Wykorzystując przeciwciała monoklonalne regujące z antygenami mykobakterii (TB71, TB72, HYT28) zidentyfikowano białko o masie cząsteczkowej 38 kDa, określane również jako antygen 5. Jego obecność stwierdzono u M. tuberculosis i w mniejszych ilościach u M. bovis BCG, a także u M. intracellulare. Analogiczne białka występują również u innych prątków. Białko to wykazuje ok. 30% homologię z sekwencją aminokwasów białka PstS E. coli. Gen PstS jest częścią trzech operonów fosforanowych. Przez zewnętrzną warstwę otoczki komórkowej fosforany są transportowane poprzez swoiste dla nich pory, w przestrzeni periplazmatycznej wychwytywane przez białko PstS, które z kolei uwalnia je do cytoplazmy drogą swoistych kanałów fosforanowych przechodzących przez błonę cytoplazmatyczną [18].
Lipoproteina 19 kDa
Innym białkiem wydzielanym do otoczenia przez prątki gruźlicy jest lipoproteina o masie cząsteczkowej 19 kDa (LP 19 kDa). Należy ona do rodziny prokariotycznych lipoprotein występujących zarówno w bakteriach Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych. Wytwarzana jest przez Mycobacterium tuberculosis i niektóre, wolnorosnące, patogenne prątki (M. bovis BCG, M. avium-intracellulare). Gen LP 19 kDa (Rv3763, lpqH) koduje białko złożone ze 159 aminokwasów, ale w trakcie potranslacyjnej obróbki usuwany jest złożony z 21 aminokwasów peptyd, a w części N-końcowej pozostaje cystyna, przekształcana z kolei w N-acylo-S-diacyloglicerolocysteinę, kluczową dla immunologicznych właściwości białka 19 kDa.
Dodatkowo cząsteczka ulega glikozylacji, co prowadzi do powstania natywnej postaci białka. Specyficzna struktura N-końca cząsteczki z 3 resztami acylowymi pozwala na oddziaływanie z receptorami podobnymi do Toll 2 typu (Toll-like receptor 2, TLR-2) na powierzchni różnych komórek uczestniczących w reakcjach związanych z zakażeniem M. tuberculosis. LP 19 kDa jest głównym czynnikiem indukującym wytwarzanie IL-12 przez ludzkie makrofagi (IL-12 odgrywa ważną rolę w stymulacji proliferacji i aktywacji limocytów T pomocniczych oraz ukierunkowuje odpowiedź immunologiczną w stronę odpowiedzi komórkowej), a także nasila transkrypcję genu indukowanej syntazy tlenku azotu (inducible nitric oxide synthase; iNOS) oraz produkcję tlenku azotu w makrofagach i monocytach (jedyny efektywny mechanizm przeciwprątkowy udowodniony w badaniach in vitro i in vivo) [4]. Ponadto LP 19 kDa obniża zależną od IFN-γ ekspresję cząsteczek MHC klasy II na powierzchni ludzkich makrofagów, co prowadzi do zmniejszenia prezentacji rozpuszczalnych antygenów M. tuberculosis limfocytom T CD4+. Hamuje również zależną od IFN-γ ekspresję FcγRI. W ten sposób białko to może utrudniać wzajemne oddziaływania pomiędzy makrofagami i limfocytami pomocniczymi, a tym samym ułatwiać przeżycie prątków w zakażonych makrofagach [10]. Podobnie jak inne lipoproteiny bakteryjne wywołuje apoptozę ludzkich makrofagów; aktywacja TLR-2 jako swoistego „receptora śmierci” prowadzi do następczego pobudzenia kaspaz: 8 i 3, pełniących rolę proteaz cysteinylowych, uczestniczących w proteolizie białek komórkowych [19]. Wykazano również, iż LP 19 kDa wpływa aktywująco na leukocyty obojetnochłonne, nasilając wybuch oddechowy [21].
Białko ESAT-6
Ważną rolę w grupie białek wydzielniczych odgrywa małe wydzielnicze białko o masie cząsteczkowej 6 kDa - ESAT-6. Zbudowane z 95 aminokwasów jest ważne dla zjadliwości M. tuberculosis, a jednocześnie dla pobudzania mechanizmów odpornościowych. Białko to jest kodowane przez gen csxA stanowiący jeden z 9 genów tzw. rejonu delecji 1 (region of deletion 1, RD-1). Występuje ono u wszystkich zjadliwych szczepów M. tuberculosis i u M. bovis, brak go natomiast u M. bovis BCG [12]. W przypadku szczepu BCG w przebiegu procesu atenuacji prowadzącego do jego powstania, doszło właśnie do utraty tej grupy 9 genów. Choć funkcja białka jest nieznana, zaobserwowano, że bardzo silnie aktywuje ono odpowiedź limfocytów T. Białko to wydzielane jest wraz z innym (10 kDa culture filtrate protein, CFP-10) w ściśle określonych proporcjach, na drodze specjalnego transportu [31]. Nieobecność ESAT-6 u M. bovis BCG sprawia, że próbuje się wykorzystać to białko do odróżnienia zakażenia prątkiem gruźlicy od odpowiedzi poszczepiennej [29]. Pathan i wsp. oceniali ex vivo liczbę limfocytów T wytwarzających interferon γ (IFN-γ) po stymulacji ESAT-6. Porównując częstość występowania swoistych dla ESAT-6 limfocytów Th wykazali, że ich liczba była większa u osób zdrowych zakażonych prątkiem gruźlicy (dodatni odczyn tuberkulinowy) oraz chorych z gruźliczym zapaleniem węzłów chłonnych, w porównaniu z chorymi na gruźlicę płuc potwierdzoną dodatnim wynikiem posiewu. Jednocześnie u osób zdrowych, bez kontaku z prątkami gruźlicy nie stwierdzono obecności ESAT-6-swoistych limfocytów Th [22]. Powyższe właściwości ESAT-6 sprawiają, że może być ono wykorzystywane zarówno w procech diagnostycznych, a także stać się atrakcyjnym kandydatem do utworzenia nowej podjednostkowej szczepionki przeciwko gruźlicy.
Niektóre komponenty komórki prątka gruźlicy posiadające właściwości antygenowe oddziałują głównie z limfocytami B, stymulując je do produkcji swoistych przeciwciał. Oznaczanie zarówno antygenów, jak i swoistych dla nich immunoglobulin próbuje się wykorzystywać w serodiagnostyce gruźlicy, przy zastosowaniu metody immunoenzymatycznej (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA). Obecnie w celu wykluczenia reakcji krzyżowych pomiędzy przeciwciałami przeciwko innym gatunkom prątków (np. saprofitycznych) a antygenem stosowanym w diagnostyce, wykorzystuje się tzw. antygeny oczyszczone (zawierające epitopy swoiste dla prątka gruźlicy). Dotychczas podjęto próby wykorzystania wielu antygenów prątka. m. in.: antygen 5, antygen 6, antygen P32 (białko 30 kDa), antygen o m. cz. 10 kDa, 14 kDa, 16 kDa, 17 kDa, 19 kDa, 38 kDa, 65 kDa, lipoarabinomannan, glikolipidy A1, B1 i C, czynnik wiązkowy.
Niestety pomimo dobrej powtarzalności oraz prostoty wykonania, metoda ta charakteryzuje się niską czułością. Może ją zwiększyć przez jednoczesne oznaczenie miana kilku swoistych przeciwciał. Bothamley i wsp. wykazali, że u chorych na gruźlicę płuc przy ujemnym wyniku badania w kierunku prątków metodą bakterioskopii, oznaczanie przeciwciał przeciwko trzem antygenom prątka gruźlicy (LP 19 kDa, lipoarabinomannan i Hsp 65 kDa) charakteryzowało się 64% czułością i 95% swoistością. Ponadto badacze ci stwierdzili, że zastosowane testy serologiczne są tak czułe jak próba tuberkulinowa, ale bardziej swoiste, a dodatkowo mogą służyć do różnicowania pomiędzy gruźlicą i mykobakteriozami (na podstawie obecności przeciwciał przeciwko antygenowi 38 kDa oraz innym swoistym epitopom) [3]. Badania serologiczne znajdują swoje zastosowanie głównie w diagnostyce gruźlicy pozapłucnej. Kashyap i wsp. wykazali w płynie mózgowo-rdzeniowym u chorych na gruźlicze zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych obecność przeciwciał klasy IgG przeciwko białku wydzielniczemu M. tuberculosis o masie cząsteczkowej 30 kDa (czułość 80%, przy swoistości 91%) [16]. Natomiast w warunkach polskich Demkow i wsp. przy ocenie przeciwciał klasy IgG przeciw antygenom prątka 38 i 16 kDa u chorych na gruźlicze zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych wykazali jedynie 42% czułość i 96% swoistość stosowanej metody [8]. Z kolei Landowski i wsp. stwierdzili, że u chorych na gruźlicę płuc występuje znacznie wyższy poziom Ag 85. W zależności od rodzaju zastosowanych swoistych przeciwciał (mysie przeciwciała monoklonalne, kurze przeciwciała przeciwbiałkowe) czułość diagnostyczna wynosiła 60 i 55% oraz 77% przy jednoczesnym ich zastosowaniu, a swoistość odpowiednio 95, 85 i 80% [17]. Ostatnio udało się obecność kompleksu Ag85 w płynie mózgowo-rdzeniowym chorych na gruźlicze zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych postulując, by służył on jako marker czynnej choroby [15].
Podsumowanie
Kompletna charakterystyka genomu szczepu H37Rv prątka gruźlicy umożliwiła znacznie lepsze poznanie całego proteomu bakteryjnego. Białka komórki prątka, w całej swej różnorodności, są obiektem szczególnego zainteresowania badaczy, w związku z ich powszechnym udziałem w procesach immunologicznych towarzyszących zakażeniu ustroju tym patogennym drobnoustrojem. Ich lepsze poznanie umożliwia zarówno udoskonalenie metod diagnostyki zakażenia oraz czynnej choroby, jak i postęp w zakresie badań nad skuteczniejszą szczepionką przeciwko gruźlicy.
Łódź, 06. 06. 2006 r.
Wyrażam zgodę na publikację artykułu pt. „Budowa chemiczna prątka gruźlicy. Część II, białka.” w ”Polskim Merkuriuszu Lekarskim”.
Łódź 06. 06. 2006 r.
Niniejszym oświadczamy, że artykuł pt. „ Budowa chemiczna prątka gruźlicy. Część II, białka.” nie narusza praw autorskich ani innych praw własności stron trzecich. Nie jest złożony do publikacji w innym czasopiśmie i nie był uprzednio publikowany. Równocześnie podpisani autorzy artykułu przekazują wszystkie prawa autorskie wydawnictwu Medpress.
1