Łódź, 20.10.2009r.

LABORATORIUM Z TECHNOLOGII REMEDIACJI

Ćwiczenie nr.3

Immobilizowane biokatalizatory

Kierunek: Ochrona środowiska

Rok: IV

Grupa: I

Wtorek 10¹⁵-14

Małgorzata Pawluczuk

Justyna Arndt

1. Wstęp teoretyczny

Biokatalizatorami nazywamy enzymy, kompleksy enzymów, organelle komórkowe i całe komórki (żywe, zdolne lub niezdolne do rozmnażania się oraz nieżywe) bądź ich różne kombinacje. Źródłem pozyskiwania biokatalizatorów są drobnoustroje, rośliny i organizmy zwierzęce. Natomiast immobilizowane biokatalizatory są to biokatalizatory posiadające formę zapewniającą ich wielokrotne stosowanie.

Immobilizacja (łac. immobilis - nieruchomy) to zjawisko powszechnie występujące w przyrodzie. Wiele procesów enzymatycznych i mikrobiologicznych przebiega przy udziale enzymów i komórek związanych w naturalny sposób z rozpuszczalnymi lub nierozpuszczalnymi matrycami oraz nośnikami mechanicznymi.

Pierwszą technologią, w której zastosowano złoże unieruchomionego biokatalizatora jest produkcja kwasu octowego przez komórki bakterii Acetobacter aceti zaadsorbowane na wiórach bukowych. Złoża biologiczne z unieruchomioną biomasą wykorzystuje się również w technologii oczyszczania ścieków. Unieruchomione enzymy i komórki są obecnie coraz częściej stosowane w przemyśle chemicznym, farmaceutycznym i spożywczym. Immobilizowane biokatalizatory stosowane są również w ochronie środowiska naturalnego, do degradacji zanieczyszczeń (utylizacji pochodnych ropy naftowej, metali ciężkich, biodegradacji toksycznych lub trudno degradowanych składników ścieków przemysłowych).

Otrzymywanie immobilizowanych biokatalizatorów, zawierających całe komórki drobnoustrojów jako źródło enzymów daje możliwość pominięcia kosztownych i pracochłonnych procesów izolacji i oczyszczania białek enzymatycznych.

Klasyczne metody unieruchamiania biokatalizatorów polegają na ich wiązaniu wewnątrz lub na powierzchni nośników nierozpuszczalnych.

Klasyczne metody unieruchamiania biokatalizatorów dzielimy następująco:

1. Wiązanie na powierzchni nośnika

• Adsorpcja, adhezja na nośnikach: nieorganicznych (szkła porowate, tlenki metali, piasek, węgiel aktywny) i organicznych (pochodne celulozy, chityny, polimery). Metoda najprostsza i najtańsza, ale nie zapewniająca trwałego związania enzymu, gdyż zmiana siły jonowej lub pH środowiska reakcji może powodować desorpcję biokatalizatora z nośnika.

• Wiązanie kowalencyjne biokatalizatora z powierzchnią nośnika przez utworzenie wiązań peptydowych, estrowych, diazoniowych przy zastosowaniu różnych odczynników aktywujących i wiążących np. diamin, izomocznika. Nośnikami w tej metodzie są m.in.: szkło porowate, ceramika, chityna, kolagen, nylon, polistyren.

1. Wiązanie w matrycy nośnika

Pułapkowanie w żelach naturalnych (alginian, celuloza, agar, agaroza, żelatyna, kolagen) lub syntetycznych (poliuretan, żywice epoksydowe). Metoda polega na zmieszaniu biokatalizatora z monomerem lub rozpuszczalnym polimerem i przeprowadzeniu procesu polimeryzacji lub usieciowienia w celu utwardzenia żelu w postaci membran, kuleczek lub włókien.

2. Zamykanie wewnątrz membran półprzepuszczalnych (nylonowych, celulozowych, liposomalnych) przez:

kapsułkowanie lub mikrokapsułkowanie, pomiędzy membranami lub w wężach półprzepuszczalnych z odpowiednich polimerów syntetycznych.

3. Unieruchamianie bez makroskopowego nośnika mechanicznego, przez:

kopolimeryzację enzymów lub komórek drobnoustrojów z nośnikiem rozpuszczalnym, wymuszoną flokulację komórek lub samoagregację drobnoustrojów.

2. Cele ćwiczenia

• Poznanie metody immobilizacji drobnoustrojów w alginianie wapnia.

• Sprawdzenie stabilności matrycy alginianowej w różnych środowiskach.

• Określenie efektywności działania immobilizowanej β-fruktofuranozydazy (w żelu alkohol poliwinylowy (PVA) - alginian) w reakcji hydrolizy sacharozy.

3. Wykonanie ćwiczenia

3.1. Zastosowanie immobilizowanej β-fruktofuranozydazy do hydrolizy sacharozy

Do 10 ml substratu, którym był 3% roztwór sacharozy dodano 4 kulki immobilizowanej w żelu PVA-alginian β-fruktofuranozydazy. Całość umieszczono w szczelnie zamkniętej buteleczce i poddano inkubacji w temperaturze 40^oC w czasie 30 min. w termoastatowanej wytrząsarce. Następnie zlano znad kuleczek część cieczy (ok. 2 ml), która posłużyła nam do oznaczenia stężenia cukrów redukujących w hydrolizatach skrobiowych. Stosowaną metodą była metoda Samogoy-Nelsona:

Po uprzednim rozcieńczeniu 10-krotnym próbki, pobrano 1 ml do probówki i dodano 1 ml odczynnika miedziowego, równolegle wykonano próbę odczynnikową zawierającą 1 ml wody zamiast próbki. Następnie wstawiono te dwie probówki na dokładnie 10 min. do wrzącej łaźni wodnej. Następnie wyjęto je, schłodzono i dodano do każdej po 1 ml odczynnika Nelsona. Po wymieszaniu i odgazowaniu (ok. 10 min.) oznaczono absorbancję wobec próby odczynnikowej przy długości fali 520 nm.

Tabela wyników

Nr biokatalizatora	Masa biokatalizatora mB[mg]	Stężenie inwert. Ci [μg/gB]	R	E520
1	54	40	5	0,11
								0,099
								0,085
				2	130	52	10	0,125
								0,21
								0,175
Próba materiałowa (3% sacharoza)				1	0,32
								0,22

3.2. Obliczenia

Stężenie cukrów redukujących





Gdzie :

C_w - stężenie cukrów redukujących


K - współczynnik obliczeniowy wyznaczony z krzywej wzorcowej



- zmierzona absorbancja

R - rozcieńczenie próby

Stała K=0,5


Stad:



Obliczenie aktywności preparatu na 1g immobilizowanego biokatalizatora ze wzoru:






Gdzie:

ΔC - róznica stężeń cukrów redukujących w próbie właściwej i w próbie materiałowej


m_B - masa biokatalizatora [g]

V - objętość próby [ml]

T - czas reakcji [min]

Stężenie cukrów redukujących w próbie materiałowej:

C_M = 0,5*0,27*1 = 0,135


Stąd:









Obliczenie aktywności preparatów na 1g białka zawartego w immobilizowanym preparacie inwertazy

C_inwertazy w 1g żelu-52 µg

Stosowane na zajęciach immobilizowane preparaty zawierają inwertazę drożdżową (β-fruktofuranozydazę). Zawiera ona w 1g handlowego preparatu rozpuszczalnej inwertazy 0,264g białka:

0,264_białka - 1g _inwertazy

X - 52 µg

X = 0,264 x 52 x 10^-6 = 1,373 x 10^-5 g_białka

Aktywność preparatu w przeliczeniu na 1g białka







3.2. Immobilizacja drobnoustrojów metodą pułapkowania w alginianie wapnia

10 ml zawiesiny zawierającej komórki drożdży przeniesiono do zlewki zawierającej taką samą ilość 3% roztworu alginianu wapnia. Po starannym wymieszaniu, unikając spienienia, wkroplono ten roztwór strzykawką, zaopatrzoną w cienką igłę, do zlewki zawierającej zimny roztwór CaCL₂, mieszając podczas całego procesu wkraplania. Następnie pozostawiono w ten sposób utworzone „kulki” w środowisku zimnego chlorku wapnia na 30 min. Po tym czasie przepłukano je wodą destylowaną o temperaturze pokojowej i umieszczono po 6 kulek w czterech różnych środowiskach na 20 minut od czasu do czasu intensywnie mieszając. Po tym czasie oceniono wygląd roztworów i po wyjęciu z nich kulek poddano je testowi na wytrzymałość.

Cytrynian sodu

Obserwacje makroskopowe roztworu: Zmętnienie cieczy, kulki prawie rozpuściły się.

Wnioski: Opalizujące zmętnienie to komórki drożdży, które immobilizowaliśmy. Kwasy organiczne powodują rozpuszczanie alginianu wapnia. Stąd też metoda ta jest stosowana do badania kondycji immobilizatora.

Sól fizjologiczna

Obserwacje: Nie zaobserwowano żadnych zmian.

Wnioski:, Ponieważ w czasie trwania eksperymentu nie zaszły żadne zmiany to możemy podejrzewać, iż jest to potencjalnie dobre środowisko do przechowywania enzymu immobilizowanego na alginianie wapnia. Jest to spowodowane tym, iż w środowisku występują jony wapnia utrudniające rozpuszczanie się matrycy.

EDTA

Obserwacje: Nie zaobserwowano zmian makroskopowych. Po wykonaniu testu na wytrzymałość kulki są miękkie.

Wnioski: Kulki są miękkie, ponieważ EDTA chce utworzyć kompleks z wapniem.

Fosforan potasu

Obserwacje: Kulki rozpuściły się, pojawiło się opalizujące zmętnienie, kłaczki.

Wnioski: Pojawiający się gruboziarnisty osad to powstający trudno rozpuszczalny fosforan wapnia.

4. Wnioski

Po przeprowadzeniu powyższych badań można stwierdzić, że alginianu wapnia nie można stosować, jako immobilizowany biokatalizator, gdy środowisko zawiera:

- jony fosforanowe

- związki kompleksujące

- gdy w środowisku mogą występować kwasy organiczne

Natomiast do środowiska, w którym stosujemy alginian wapnia jako immobilizowany biokatalizator należy dodawać jonów wapnia.

6

---