0105; 23.03.2009, ćwiczenia nr 5., - Jąderko, budowa, funkcja, upakowanie DNA w chromosomy, metody badan cytogenetycznych .

Jąderko

• najlepiej widoczne w interfazie

• odkryte już dawno

• chromatyna jąderkowa jest elementem najbardziej stałym (jedyny stały element jąderka)

• kuliste, owalne, rozpłaszczone, nieregularne

• w ludzkiej komórce można znaleźć do 10 jąderek

• jest wysoce wyspecjalizowaną wewnątrzkomórkową organellą

• jedna z najmniej stabilnych struktur komórki

• liczba jąderek determinowana jest przez liczbę chromosomów z NOR (nuclear organisacion regions) (może być od niej mniejsza zmienia się znacznie, zależnie od organizmu, typu komórki oraz jej stanu fizjologicznego)

• wielkość jąderek zależy od aktywności metabolicznej komórki

• jeśli komórka jest aktywna metabolicznie to i wielkość jąderka będzie większa

• co jakiś czas dochodzi do eksportu tych „ziarenek” czyli prekursorów z jąderka

• miejsce syntezy rybosomowych prekursorów pre-rRNA oraz montażu prerybosomowych cząstek RNP(pre-RNP)

Składniki ultrastrukturalne jąderka:

• centra fibrylarne, inaczej włókniste (FC, fibrillar centers)

• gęsty składnik fibrylarny, inaczej: włóknisty (DFC, dense fibrillar component)

• składnik granularny, inaczej: ziarnisty (GC, granular component)

• wakuole jąderkowe (NI, nucleolar interstices)

• chromatyna zasocjowana z jąderkiem (NAC, nucleolus assiociated chromatin)

• nukleolonema

• organizator jąderkowy (NOR)

• macierz jąderkowa

Charakterystyka niektórych struktur jąderkowych:

Element strukturalny	Lokalizacja	Funkcje
FC DFC GC RNM NAC	strefa centralna jąderek zanurzona w DFC otoczenie FC strefa korowa jąderka warstwa korowa i nukleoplazma strefa peryferyjna i śródjąderkowa	montowanie i rozmontowywanie chromatyny zawierającej rDNA transkrypcja rDNA i produkowanie włókien pre-rRNP zawierających pre-rRNA przetwarzanie prerybosomów w duże i małe cząstki rRNP konstrukcja strukturalnej podpory oddziaływanie z otaczającą chromatyną

Chromatyna jąderkowa:

• zdekondensowana forma chromosomów 13,14, 15, 21,22 pary, a ściślej ich satelitów i przewężeń wtórnych, któe są regionami organizuyjaącymi jąderko - NOR

Postaci Chromatyny jąderkowej:

• chromatyna okołojąderkowa (odpowiedzialna za przepływ informacji)

• chromatyna wewnątrzjąderkowa (tkz. przegrodowa - żeby w poszczególnych częściach jąderka mogły zachodzić rożne procesy; tworzy przedziały w jąderku)

• chromatyna transkrypcyjna (duży potencjał transkrypcyjny)

Centra fibrylarne:

• przestrzenie wypełnione mniej lub bardziej skondensowanymi fibrylami chromatynowymi

• zawierają rDNA i wykazują aktywność polimerazy RNA I

• są obszarami nieaktywnymi transkrypcyjnie ponieważ nie wykazano w nich obecności RNA ani włączenie radioaktywnych prekursorów RNA

Gęsty składnik fibrylarny:

• zawiera RNA i stanowi miejsce intensywnej transkrypcji rRNA

• otacza w formie muszli centra fibrylarne

• występuje w postaci pasm lub zajmuje centralną część (w jąderkach tkz. Zwartych)

Składnik granularny:

• ziarnistości o średnicy ok. 15-20 nm

• zbudowane z rybonukloprotein

• są prekursorami rybosomów cytoplazmatycznych

• zawierają one rRNA i białka rybosomowe

Wakuola jąderkowa:

• występuje w jąderkach, w których nastąpił gwałtowny eksport składnika granularnego, nie zrekompensowany przez odpowiednio szybką syntezę nowych prekursorów rybosomów

• stanowi jasną przestrzeń o kształcie zbliżonym do kulistego

• znajdują się tam luźno rozmieszczone fibryle i ziarenka

Macierz (matriks) jąderkowa:

• materiał budulcowy, podporowy

• składa się z białek szkieletowych

• zanurzone są tam wymienione wyżej składniki jąderka

Białka jąderka:

• jąderko jest zbudowane głównie z białek, które stanowi 80-90% jego masy, 3-13% RNA i 3-18% DNA

• białka swoiste i nieswoiste, te pierwsze związane są z wytwarzaniem rybosomów: polimeraza RNA I, nukleolina, białko B23 (numatryna), fibrylarna, białka Ag-NOR

Najważniejsze białka jąderkowe.

Nazwa	Funkcja
polimeraza RNA I B23; NO38 numatryna C23 fibrylaryna rybocharyna	transkrypcja rDNA dojrzewanie rRNP regulacja komórkowej mitogenezy aktywacja transkrypcji rDNA, pakowanie pre-rRNA, montowanie rybosomów dojrzewanie pre-rRNA dojrzewanie podjednostek 60S i transport jądrowo-cytoplazmatyczny

Funkcja jąderka:

• miejsce syntezy rybosomowych prekursorów pre-rRNA jego dojrzewania oraz montażu, rRNA syntetyzowany jest na matrycy DNA (rDNA)chromatyny jąderek

• zawiera ono maszynerię wymaganą do transkrypcji wielokrotnych kopii prekursorów genów rybosomowych (ok,. 45S u ssaków 40S u płazów)

• ponadto posiada molekularne wyposażone niezbędne do przetworzenia tych prekursorów w ostateczne cząsteczki 18S; 5,8S i 28S rRNA

• zawiera również białka, które łączą się z pre-rRNA i rRNA, w tym 5SrRNA tworząc RNPs będące prekursorami mniejszej większej podjednostki dojrzałego rybosomu

Typy morfologiczne jąderek:

• jąderka zwarte

• jąderka siateczkowate (występują w większości komórek nowotworowych)

• jąderka spoczynkowe (zahamowanie aktywności transkrypcyjnej)

• jąderka segregowane (zahamowanie aktywności transkrypcyjnej)

W formowaniu się jąderka uczestniczą pętla chromatyny, zawierające geny rRNA, a pochodzące z 10 różnych chromosomów interfazowych.

Chromosomy

Budowa chromosomu:

• ramiona chromosomu

• przewężenie pierwotne

• przewężenie wtórne

• satelita

• chromatydy

• chromomery

• telomery

Podział chromosomów ze względu na występowanie przewężenie pierwotnego (centromeru):

• metacentryczne

• submetacentryczne

• akrocentryczne

• telocentryczne (nie występują u ludzi)

Grupy chromosomów:

• Grupa A - duże, metacentryczne (pary 1-3)

• Grupa B - duże, submetacentryczne (pary 4 i 5)

• Grupa C - średnie, submetacentryczne (pary 6-12 oraz chromosom X)

• Grupa D - średnie, akrocentryczne (pary 13-15)

• Grupa E - małe, submetacentryczne (pary 16-18)

• Grupa F - małe, metacentryczne (pary 19-20)

• Grupa G - małe, akrocentryczne (pary 21-22 oraz chromosom Y)

Metody prążkowe:

• GTG (z udziałem barwnika Giemsy)

• RHG (z udziałem barwnika Giemsy)

• CBG (z udziałem barwnika Giemsy)

• THG (z udziałem barwnika Giemsy)

• NOR (wysrebrzanie; wybarwiają się białka Ag-NOR)

Metody prążkowe posiadają pewną niedogodność - jest zbyt małą rozdzielczość żeby rozstrzygnąć niektóre sytuację jak na przykład mikrodelecje.

Inne rodzaje chromosomów:

• chromosomy olbrzymie, genetyczne chromosomy powstające w wyniku wielu kolejnych replikacji zespołu chromosomów bez rozejścia się replik do nowych komórek (jak to odbywa się w mitozie). Zob. też politeniczne chromosomy.

• chromosomy politeniczne (ang. polytene chromosomes) - chromosomy, które powstają w wyniku kilkakrotnej replikacji chromosomowego DNA, po której nie następują zwyczajowe podziały komórkowe. Powstałe w ten sposób chromatydy nie rozchodzą się (nie ulegają dekondensacji). Chromosomy politeniczne zostały pierwotnie zaobserwowane przez Balbianiego w 1881 roku w gruczołach ślinowych ochotek Chironomus ale ich prawdziwa natura została odkryta dopiero w latach 30. podczas badań nad genetyką drozofili. Tkz. Pierścienie Balbianiego czy „puffy Balbianiego”

• chromosomy szczoteczkowe - duże chromosomy zawierające liczne pętle boczne, będące miejscem intensywnej syntezy RNA, pętle nadają chromosomom wygląd "szczoteczki", występują podczas rozwoju oocytów niektórych zwierząt (ryb, płazów, gadów, ptaków).

Metoda Feulgena:

• wynaleziona przez Roberta Feulgena

• pozwala na selektywne barwienie DNA lub materiału chromosomowego

• oparta na kwasowej hydrolizie DNA, które barwi się na czerwono.

• wykorzystywana do półilościowego lub ilościowego oznaczania DNA w tkankach

• reakcja przebiega w dwóch etapach

• najpierw badaną próbkę poddaje się działaniu HCl przez 8-10 min. w podwyższonej temperaturze. następnie natychmiast traktuje się ją odczynnikiem Schiffa w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 min

• do momentu gdy tkanka nabierze purpurowego zabarwienia

• dalej materiał jest ugniatany w obecności acetoorceiny

Kolchicyna

• organiczny związek chemiczny z grupy alkaloidów o silnie trującym działaniu

• dawka śmiertelna to ok. 1 mg/kg masy ciała.

• w dawkach terapeutycznych wykazuje działanie przeciwzapalne, antymikrotubularne

• zatrzymując podział komórki na etapie metafazy poprzez uniemożliwienie wytworzenia mikrotubul wrzeciona kariokinetycznego i zmniejszające wytwarzanie kwasu moczowego

• oddziaływanie na cytoszkielet

• upośledzanie segregacji chromosomów podczas podziału komórki co doprowadza do powstania komórek o zduplikowanym garniturze chromosomów

W ten sposób daje się stosunkowo łatwo uzyskać rośliny poliploidalne, interesujące zarówno ze względów użytkowych jak i teoretycznych. Kolchicyna jest stosowana w leczeniu napadów zapalenia stawów w przebiegu dny moczanowej oraz w leczeniu rodzinnej gorączki śródziemnomorskiej