4. PRZYGOTOWANIE MATERIAŁU DO BADAŃ W MIKROSKOPIE ELEKTRONOWYM
4.1. Utrwalanie
Wysoka zdolność rozdzielcza mikroskopu elektronowego i znaczne powiększenia uzyskiwane przy jego pomocy stwarzają konieczność szczególnie starannego utrwalenia materiału. Niewidoczne w mikroskopie świetlnym artefakty wynikające z niedoskonałego utrwalenia, np. obkurczenie lub spęcznienie tkanki, komórek lub struktur subkomórkowych, czy też dyskretne zmiany autolityczne, ujawniają się z całą wyrazistością w obrazie z mikroskopu elektronowego. Stąd proces utrwalania materiału do celów mikroskopii elektronowej wymaga ogromnej dbałości nawet o takie warunki, jakie uważa się za nieistotne przy utrwalaniu do mikroskopii optycznej.
Tam, gdzie istnieje taka możliwość, należy utrwalać materiał poprzez perfuzję, a przy utrwalaniu immersyjnym rozmiary utrwalanych próbek powinny być jak najmniejsze.
4.1.1. Rodzaje utrwalaczy
Różnorodność utrwalaczy używanych w mikroskopii elektronowej jest znacznie mniejsza niż w przypadku mikroskopii świetlnej. Najpowszechniej stosowanym utrwalaczem jest aldehyd glutarowy w stężeniach od 0,5% do 6%. Niektóre specjalne techniki przygotowania materiału wymagają określonych utrwalaczy złożonych, np. mieszaniny aldehydu glutarowego i formaldehydu (niektóre metody cytoenzymatyczne) czy aldehydu glutarowego i kwasu taninowego (wykrywanie mikrotubul).
4.1.2. pH utrwalacza
W badaniach ultrastrukturalnych pH utrwalacza powinno być zbliżone do fizjologicznego dla danej tkanki (7,2-7,4 dla tkanek ssaków). W tym celu utrwalacz rozpuszcza się zawsze w buforze, a następnie precyzyjnie dostosowuje się pH roztworu do pożądanej wartości pod kontrolą pH-metru. Najczęściej stosowanym buforem jest bufor kakodylowy (kakodylan sodu/kwas solny), czasami używa się również buforu fosforanowego, Tris/HCl, PIPES/HCl lub HEPES/HCl.
4.1.3. Osmolarność utrwalacza
Szczególnie istotnym warunkiem zachowania prawidłowej ultrastruktury komórek i tkanek jest dostosowanie osmolarności utrwalacza do osmolarności utrwalanej tkanki. Ciśnienie osmotyczne roztworu utrwalacza reguluje się:
• stężeniem utrwalacza,
• stężeniem składników buforu,
• ewentualnym dodaniem do roztworu chemicznie obojętnych, lecz osmotycznie czynnych substancji (sacharoza, polowinylopyrolidon).
Osmolarność utrwalacza dla większości tkanek ssaków powinna się zawierać w granicach 200-500 mOs. Zbyt niskie ciśnienie osmotyczne utrwalacza powoduje pęcznienie organelli komórkowych i całych komórek, natomiast zbyt wysokie do ich obkurczenie. W obu wypadkach struktura komórki jest znacznie zniekształcona w porównaniu do struktury naturalnej
4.1.4. Temperatura utrwalania
Materiał można wprawdzie utrwalać w temperaturze pokojowej, często jednak zalecane jest utrwalanie w stosunkowo niskich temperaturach (1-4°C). Procesy metaboliczne komórek są wtedy zwolnione, wolniej zachodzą również ewentualne zmiany autolityczne, a sam proces utrwalania przebiega w sposób łagodny i płynny. Uważa się, że im wyższa temperatura utrwalania, tym większe możliwości występowania artefaktów.
4.1.5. Wypłukiwanie utrwalacza
Do wypłukiwania utrwalacza używa się przeważnie buforu, w którym utrwalacz był rozpuszczony. Roztwór płuczący powinien mieć identyczne jak utrwalacz pH i ciśnienie osmotyczne.
4.2. Osmowanie (utrwalanie wtórne)
Utrwalanie wtórne przeprowadza się przez zanurzenie wstępnie utrwalonego fragmentu tkanki w 0,5-2,5% czterotlenku osmu na okres 1-2 godz. Czterotlenek osmu może być rozpuszczony w buforze lub w wodzie destylowanej - pH i ciśnienie osmotyczne tego roztworu nie odgrywa większej roli, bowiem tkanka utrwalona wstępnie jest już odporna na deformacje.
Czterotlenek osmu wywiera na materiał biologiczny podwójny wpływ: jest równocześnie utrwalaczem i "barwnikiem", czyli środkiem kontrastującym. Z jednej strony utrwala tkankę wiążąc się przede wszystkim z lipidami, z drugiej zaś jako metal ciężki jest dobrze widoczny w mikroskopie elektronowym, przez co kontrastuje zwłaszcza błony biologiczne (błonę komórkową i błony organelli wewnątrzkomórkowych) z uwagi na ich wysoką zawartość fosfolipidów.
4.3. Odwadnianie
Analogicznie do technik mikroskopii optycznej, odwadniania dokonuje się w roztworach alkoholu lub acetonu o wzrastających stężeniach.
4.4. Zatapianie
Bardzo mała grubość skrawków używanych w mikroskopii elektronowej stwarza konieczność zatapiania materiału w substancjach o wysokiej twardości. Warunki te spełniają wyłącznie polimeryzujące tworzywa sztuczne: żywice epoksydowe lub akrylowe.
4.4.1. Zatapianie w żywicach epoksydowych
W rutynowych badaniach ultrastrukturalnych stosuje się żywice epoksydowe (najpopularniejszy - Epon 812 i pokrewne: Polybed 812, SPI-Pon 812, ponadto Araldite, Durcupan, Spurr).
Po odwodnieniu materiał przepaja się płynem pośrednim - jest to zazwyczaj tlenek propylenu, a następnie kilkoma zmianami przygotowywanych na bieżąco mieszanin żywicy, utwardzacza i tzw. akceleratora (katalizator przyspieszający polimeryzację). Proces przepajania trwa kilkanaście godzin, po czym materiał przenosi się do niewielkich kapsułek żelatynowych lub specjalnych foremek. Polimeryzacja żywicy odbywa się w podwyższonej temperaturze (60-80°C) przez 24-48 godz. Jej efektem są bardzo twarde bloczki zawierające zatopiony materiał.
4.4.2. Zatapianie w żywicach akrylowych
Zatapianie w polarnych żywicach akrylowych stosuje się przede wszystkim wówczas, gdy skrawki mają być później poddane procedurom immunocytochemicznym. Spośród dostępnych komercyjnie żywic największą popularność zyskały Lowicryl K4M, LR Gold i LR White. Po odwodnieniu materiał przepaja się mieszaniną odwadniacza i żywicy, a następnie kilkoma zmianami monomeru żywicy z dodatkiem inicjatora polimeryzacji. W przypadku Lowicrylu i LR Gold cała procedura odbywa się w temperaturze -20 - -35°C, a polimeryzacja następuje pod wpływem trwającego co najmniej 24 godz. naświetlania promieniami UV. LR White jest żywicą ulegającą chemicznej polimeryzacji w podwyższonej temperaturze (50°C), natomiast proces odwadniania i wstępne przepajanie może się odbywać w temperaturze 4°C.
4.5. Krojenie skrawków
4.5.1. Przygotowanie bloczka do krojenia (trymowanie)
Skrawki do celów mikroskopii elektronowej odznaczają się nie tylko minimalną grubością (stąd nazwa: skrawki ultracienkie), ale także bardzo niewielkimi rozmiarami: długość większego boku nie przekracza zazwyczaj 0,3 mm. Należy zatem przed procesem krojenia wstępnie przygotować płaszczyznę skrawania o takich właśnie rozmiarach. Wymiary krojonego materiału są przeważnie kilkakrotnie większe. Trzeba więc wstępnie wykonać kilka tzw. skrawków półcienkich (o grubości 0,5-1,0 μm) obejmujących całą powierzchnię zatopionego materiału i obejrzeć je w mikroskopie świetlnym w celu wybrania tego rejonu bloczka, z którego będzie się następnie kroić właściwe skrawki ultracienkie. Skrawki półcienkie z żywic epoksydowych dają się bez trudności zabarwić jedynie niektórymi barwnikami (błękit metylenowy, blękit toluidynowy, azur II) przy zastosowaniu podwyższonej temperatury (nawet do ok. 100°C). Skrawki z żywic akrylowych można barwić większością barwników.
Po obejrzeniu i ocenie skrawków półcienkich, pod kontrolą lupy stereoskopowej wycina się na płaszczyźnie czołowej bloczka (ręcznie, przy użyciu żyletki, lub w ultramikrotomie, gdy umożliwia to jego konstrukcja) niewielką piramidkę (ostrosłup ścięty), której górna płaszczyzna będzie odpowiadać wybranej lokalizacji i wielkości skrawków ultracienkich. Przy trymowaniu ręcznym należy dołożyć starań, aby piramidka posiadała regularne obrysy, a płaszczyzna skrawania stanowiła idealny prostokąt.
4.5.2. Ultramikrotomy
Mikrotomy służące do krojenia ultracienkich skrawków do celów mikroskopii elektronowej noszą nazwę ultramikrotomów. Są to mikrotomy o specjalnej konstrukcji, posiadające własny napęd.
Stolik przedmiotowy, do którego mocuje się bloczek, wykonuje podczas skrawania ruch po obwodzie zbliżonym do elipsy, przy czym faza skrawania (w dół) odbywa się zazwyczaj jedynie siłą ciężkości stolika, aby uniknąć nierównomierności ruchu wynikającej z mechanicznego przenoszenia napędu, która mogłaby się odbić niekorzystnie na jakości skrawków.
Regulacja grubości skrawków może być bądź mechaniczna, bądź termoelektryczna. W tym pierwszym przypadku stopniowe przybliżanie stolika do noża podczas skrawania dokonuje się za pośrednictwem niezwykle precyzyjnej - zważywszy na minimalną grubość skrawków - przekładni mechanicznej. Regulacja termoelektryczna polega na tym, że stolik przedmiotowy umocowany jest na ramieniu wykonanym ze stopu metalowego o ściśle określonej rozszerzalności cieplnej. Ramię to jest podgrzewane elektrycznie podczas krojenia i jego wydłużanie przysuwa bloczek do noża z odpowiednią szybkością. Zmieniając natężenie prądu przepływającego przez element grzewczy, regulujemy szybkość wydłużania się ramienia, a tym samym grubość krojonych skrawków.
Nóż ultramikrotomu musi charakteryzować się szczególną twardością i idealnym wręcz ostrzem, bowiem grubość skrawków ultracienkich waha się pomiędzy 20 a 60 nm. Warunków tych nie spełnia nawet najlepszy nóż stalowy, w związku z czym w ultramikrotomach stosuje się noże szklane lub diamentowe.
W przypadku noża diamentowego, ostrzem jest odpowiednio zeszlifowany diament syntetyczny. Jego zaletą jest ogromna twardość i wynikająca z niej trwałość noża oraz wysoka jakość krojonych skrawków. Nóż taki jest jednak bardzo kosztowny, i dlatego w pracowniach mikroskopii elektronowej noży szklanych powszechnie używa się do prac przygotowawczych (wstępne oglądanie materiału pod mikroskopem, sprawdzenie jakości zachowania struktury materiału, wybór bloczków przeznaczonych do dalszych badań, itp.), natomiast noży diamentowych do krojenia skrawków z uprzednio wyselekcjonowanego materiału, które mają służyć do właściwych badań i z których ma zostać wykonana dokumentacja fotograficzna.
4.5.3. Przygotowanie noża szklanego
Noże szklane uzyskuje się przez odpowiednie przełamanie płyt szklanych wysokiej jakości, o grubości 4-7 mm. Produkowane fabrycznie szkło do noży ultramikrotomowych dostarczane jest w postaci pasków o szerokości 25 mm. Paski te najpierw łamie się na kwadraty, a potem na trójkąty, których kąt przy krawędzi krojącej wynosi 50-60° (ryc. 4.1). Łamanie szkła przeprowadza się albo w specjalnych urządzeniach (ang. knife-maker), albo przy użyciu rysika diamentowego i pary płaskich kleszczy. Jest rzeczą istotną, aby wykonana na szkle rysa wyznaczająca linię przełomu nie dochodziła do krawędzi szkła, ponieważ dobra krawędź krojąca powstaje jedynie wówczas, gdy w jej okolicy szkło łamie się wzdłuż naturalnie istniejących linii zmniejszonej oporności.
Po przełamaniu kontroluje się jakość krawędzi tnącej pod lupą stereoskopową. Krawędź powinna być idealnie równa, bez najmniejszych nawet wyszczerbień czy zafalowań. Obserwując najdłuższy bok szklanego trójkąta w odbitym świetle, można dostrzec łukowatą linię dochodzącą do jednego z brzegów ostrza (ryc. 4.2). Około połowy długości ostrza z tej strony noża nadaje się do krojenia skrawków ultracienkich, w obrębie drugiej połowy ostrze staje się stopniowo coraz bardziej "tępe" i można go używać jedynie do krojenia skrawków półcienkich przeznaczonych do mikroskopu optycznego.
Do wyselekcjonowanych noży szklanych montuje się wanienki z tworzywa sztucznego lub folii metalowej i uszczelnia płynną parafiną lub szybkoschnącym lakierem (ryc. 4.3).
Szklane paski w odpowiedni sposób przełamane w poprzek dają bardzo długą krawędź tnącą (o długości równej szerokości paska). Są to tzw. noże Ralpha (ryc. 4.4), używane do krojenia półcienkich skrawków o dużych rozmiarach z materiałów zatopionych w żywicach. Skrawki takie są przeznaczone do oglądania w mikroskopie świetlnym (p. rozdz. 3.9.5). Noże Ralpha można wykonać jedynie w specjalnych urządzeniach łamiących szkło.
4.5.4. Krojenie i ocena grubości skrawków
Po zamontowaniu noża w ultramikrotomie w ten sposób, aby kąt prześwitu wynosił 1-3°, wanienkę wypełnia się wodą lub 10% acetonem. Należy doprowadzić do wytworzenia lekko wklęsłego menisku dochodzącego do krawędzi tnącej noża. Następnie trzeba tak ustawić oświetlenie ultramikrotomu, by światło padające na nóż odbijało się w menisku (powinien lśnić).
Podczas krojenia kontroluje się pod lupą stereoskopową (stanowiącą wyposażenie każdego ultramikrotomu) jakość skrawków schodzących na powierzchnię cieczy. Powinny one być gładkie, bez rys i fałdów. Przy prawidłowo ustawionym oświetleniu skrawki wykazują barwę wynikającą z interferencji światła i zależną od ich grubości. Najcieńsze skrawki (20-30 nm) są szare, a dalej, wraz ze wzrostem ich grubości, stają się: srebrne, złote, bursztynowe, purpurowe, niebieskie i zielone. Do celów transmisyjnej mikroskopii elektronowej nadają się wyłącznie skrawki szare, srebrne i niekiedy złote; skrawki o pozostałych barwach są zbyt grube.
4.6. Montowanie skrawków
Skrawki montuje się na okrągłych metalowych siatkach o standardowej średnicy 3 mm i różnej - w zależności od zastosowania - wielkości oczek (ryc. 4.5). Siatka jest zatem odpowiednikiem szkiełka podstawowego - przy pomocy precyzyjnej (zegarmistrzowskiej) pensety wkłada się ją do odpowiedniego uchwytu w stoliku przedmiotowym mikroskopu elektronowego. Siatki do rutynowego użytku wykonane są z miedzi, do specjalnych celów (immunocytochemia, autoradiografia) używa się nieaktywnych chemicznie siatek z niklu lub złota.
Przeniesienie skrawków na siatkę odbywa się poprzez dotknięcie siatką powierzchni skrawków pływających w wanience noża mikrotomowego. Niekiedy, przy siatkach o dużych oczkach, przed nałożeniem skrawków trzeba siatkę dodatkowo pokryć cienką błonką z Formvaru lub Butvaru (odmiany żywic poliwinylowych) podtrzymującą skrawki.
4.7. Kontrastowanie skrawków
Kontrast błon komórkowych uzyskany przez wtórne utrwalenie materiału w czterotlenku osmu jest stosunkowo słaby i dlatego powszechnie stosuje się dodatkowe kontrastowanie skrawków przed ich oglądaniem w mikroskopie elektronowym. W tym celu najczęściej używa się roztworów octanu uranylu i cytrynianu ołowiu. Substancje te kontrastują bardzo wyraźnie chromatynę jądrową, rybosomy oraz błony biologiczne. Kontrastowanie wykonuje się przez położenie siatek skrawkami do dołu na kropli roztworu kontrastującego.
4.8. Specjalne techniki przygotowania materiału do transmisyjnej mikroskopii elektronowej
4.8.1. Technika barwienia negatywowego
Służy ona do uwidocznienia struktur biologicznych o niewielkich rozmiarach i słabej barwliwości (izolowane frakcje subkomórkowe, wirusy, wysokocząsteczkowe kompleksy białkowe). Polega na dokładnym zmieszaniu materiału z elektronowo gęstym barwnikiem nie wykazującym powinowactwa do tegoż materiału (np. solami kwasu fosforowolframowego), a następnie na rozpostarciu bardzo cienkiej warstwy materiału wraz z barwnikiem na siatce pokrytej błonką formvarową lub formvarowo-węglową (jest to zatem odpowiednik rozmazu w mikroskopii elektronowej). Po wysuszeniu, w obrazie mikroskopowym obserwuje się "negatyw" badanych struktur: są one jesne na ciemnym tle.
4.8.2. Technika cieniowania metalami
Technika ta pozwala na obserwowanie w transmisyjnym mikroskopie elektronowym plastycznego obrazu niewielkich struktur (wirusy, izolowane organelle) rozpostartych w jednej warstwie na siatce pokrytej błonką podtrzymującą. Preparat taki pokrywa się bardzo cienką (1-2 nm) warstewką metalu (złoto, platyna) poprzez tzw. napylenie próżniowe, podczas którego pary metalu uzyskane na drodze termoemisji kieruje się na powierzchnię preparatu. Napylanie odbywa się zawsze pod pewnym kątem do tej powierzchni, co powoduje powstanie "cieni" uzależnionych od kształtu napylanych struktur (ryc. 4.6). Cienie te tworzą w mikroskopie elektronowym plastyczny obraz badanych struktur.
Do cieniowania służą specjalne urządzenia, tzw. napylarki.
4.8.3. Technika replik
Stosuje się ją do badania zróżnicowań odsłoniętych powierzchni materiału biologicznego. Założeniem metody jest podwójne napylenie takiej powierzchni: najpierw metalem, w celu jej wycieniowania, a następnie węglem, którego dość gruba warstwa (ok. 20 nm) jest "przejrzysta" dla elektronów, natomiast stanowi element spajający i wzmacniający mechanicznie delikatną warstewkę napylonego metalu (ryc. 4.6).
Napyloną warstwę metalu i węgla noszącą nazwę repliki (gdyż odwzorowuje konfigurację pokrytej powierzchni) oddziela się od podłoża przez strawienie leżącego pod nią materiału (podchlorynami lub stężonymi ługami) i przenosi na siatkę. Tak przygotowana replika nadaje się do obserwacji w mikroskopie elektronowym.
4.8.4. Technika mrożenia i łamania (ang. freeze-fracture)
Technikę tę stosuje się głównie do badania struktury błon biologicznych i połączeń międzykomórkowych. Polega ona na zamrożeniu utrwalonego i przepojonego glicerolem (krioprotekcja) materiału, a następnie na przełamaniu go w wysokiej próżni (10-6 Torr) i w temperaturze ok. -100°C. Z uzyskanej powierzchni przełomu natychmiast sporządza się replikę, która stanowi przedmiot dalszych badań w mikroskopie elektronowym. Przełamywanie zamrożonego materiału i napylanie powierzchni przełomu odbywa się w specjalnym urządzeniu umożliwiającym napylanie próżniowe w niskich temperaturach.
Istotą tej techniki jest zjawisko przełamywania się zamrożonej tkanki wzdłuż płaszczyzn najmniejszego oporu. Takimi płaszczyznami są błony biologiczne, a konkretnie ich wewnętrzna, fosfolipidowa warstwa. Stwarza to możliwość analizy dużych płaszczyzn "odsłoniętych" błon i struktur z nimi związanych (białka transbłonowe i ich kompleksy, pęcherzyki, struktury należące do połączeń międzykomórkowych). Przełamanie błony prowadzi do odsłonięcia jej dwóch powierzchni: tzw. powierzchni P (protoplazmatycznej, czyli pokrywającej cytoplazmę) i powierzchni E (egzoplazmatycznej, czyli pokrywającej przestrzeń pozakomórkową lub wnętrze struktur błoniastych (ryc. 4.7).
Odmianą techniki mrożenia i łamania jest mrożenie i rytowanie (ang. freeze-etching), podczas którego materiał napyla się po upływie pewnego czasu (od kilkunastu sekund do kilku minut) od chwili jego przełamania. Pod wpływem próżni dochodzi wówczas do sublimacji wody z powierzchni przełomu i stopniowego odsłaniania głębiej położonych struktur, które następnie zostają uwidocznione w replice. Głębokie rytowanie z następowym wykonaniem repliki metodą cieniowania rotacyjnego (napylenie metalu na rytowaną powierzchnię odbywa się nie pod jednym kątem, lecz ze wszystkich stron) stanowi obecnie najlepszą metodę plastycznego uwidocznienia elementów cytoszkieletu.
4.9. Przygotowanie materiału do badań w skaningowym mikroskopie elektronowym
4.9.1. Suszenie w punkcie krytycznym
Celem tej procedury jest możliwie najlepsze zachowanie struktury stosunkowo dużych powierzchni utrwalonego już materiału biologicznego.
Punkt krytyczny określony jest przez takie wartości temperatury i ciśnienia, powyżej których faza płynna i gazowa danej substancji zajmują jednakowe objętości. Nie występują wówczas w fazie płynnej siły napięcia powierzchniowego, deformujące materiał biologiczny podczas zwykłego suszenia.
Punkt krytyczny dla wody wynosi 374°C i ok. 200 at, a zatem nie może być wykorzystany do suszenia materiału biologicznego. Należy więc przed suszeniem przepoić materiał substancją o bardziej odpowiednich parametrach punktu krytycznego. Najczęściej stosuje się suszenie w punkcie krytycznym dwutlenku węgla (31°C, 73 at). W tym celu utrwalony materiał odwadnia się w acetonie, oziębia, przepaja pod ciśnieniem płynnym CO2 i suszy przy podanych wyżej wartościach temperatury i ciśnienia w specjalnym urządzeniu (aparat Andersona). Zamiast CO2 można również używać do tego celu freonu.
Wysuszony materał biologiczny pokrywa się metodą napylania próżniowego cienką warstewką węgla, a następnie złota lub platyny (odwrócenie kolejności napylania w porównaniu z techniką replik wynika z faktu, że metal, od którego mają się odbijać elektrony tworzące obraz w mikroskopie skaningowym, musi stanowić warstwę powierzchniową). Tak przygotowana tkanka nadaje się do analizy mikroskopowej.
4.9.2. Technika odlewów mikrokorozyjnych
Technika ta umożliwia trójwymiarowe uwidocznienie wolnych przestrzeni znajdujących się w materiale biologicznym. Najczęściej używa się jej do badania sieci naczyniowych. Polega ona na wypełnieniu łożyska naczyniowego (po uprzednim usunięciu zeń krwi) płynną żywicą akrylową (Mercox), która następnie w podwyższonej temperaturze ulega polimeryzacji. Po wytrawieniu (korozji) otaczająych tkanek ługiem lub podchlorynem sodu pozostaje odlew sieci naczyniowej uwidaczniający nawet najdrobniejsze kapilary. Odlew taki poddaje się liofilizacji (p. rozdz. 5.5), a następnie pokrywa węglem i złotem.
4.10. Przepisy praktyczne
4.10.1. Utrwalacze
A. Buforowany roztwór aldehydu glutarowego
25% aldehyd glutarowy 1 ml
0,15 M bufor kakodylowy, pH 7,2-7,4 9 ml
chlorek wapnia 5 mg
Uniwersalny utrwalacz do badań ultrastrukturalnych. Czas utrwalania 2-24 godz.
B. Utrwalacz Grahama-Karnovsky'ego (zmodyfikowany)
4% paraformaldehyd (1) 25 ml
25% aldehyd glutarowy 2,5 ml
0,3 M bufor kakodylowy, pH 7,2 22,5 ml
chłorek wapnia 25 mg
Utrwalacz stosowany w wielu reakcjach cytoenzymatycznych i immunocytochemicznych. Czas utrwalania: od 5 min (skrawki 50 μm) do 5 godz.
(1) Roztwór paraformaldehydu: 1 g paraformaldehydu rozpuścić, mieszając, w 25 ml wody dest. ogrzanej do 60-70°C. Dodać 1-3 kropli NaOH do całkowitego wyklarowania się roztworu.
C. Roztwór osmu
W szczelnie zamykanej butelce przygotować taką ilość wody dest., która z podaną na opakowaniu firmowym ilością czterotlenku osmu utworzy żądany roztwór (np. 1%). Ostrożnie otworzyć szklaną ampułkę z czterotlenkiem osmu i natychmiast wrzucić obie jej części do butelki z wodą, a butelkę szczelnie zamknąć. Zamieszać i odstawić do 4°C na co najmniej 24 godz.
Uwaga: aldehyd glutarowy i osm są silnie toksyczne, drażnią drogi oddechowe, skórę i śluzówki. Roztwory należy przygotowywać pod wyciągiem, używając gumowych rękawiczek.
4.10.2. Odwadnianie
w alkoholu w acetonie
alkohol 50% 15 min aceton 50% 15 min
alkohol 60% 15 min aceton 60% 15 min
alkohol 70% 15 min aceton 70% 15 min
alkohol 80% 15 min aceton 80% 15 min
alkohol 90% 15 min aceton 90% 15 min
alkohol abs. 30 min aceton 100% I 30 min
aceton I 30 min aceton 100% II 30 min
aceton II 30 min tlenek propylenu 5 min
tlenek propylenu 5 min
4.10.3. Zatapianie w żywicy Epon 812
Epon(1)/tlenek propylenu 1:1 2 godz. (w zamkniętym naczyniu)
Epon I 12 godz. (45°C)
Epon II (polimeryzacja) 48 godz. (60°C)
(1) Roztwór roboczy Eponu 812
Roztwór A: Epon 812 31 ml Roztwory te można przechowywać przez
DDSA 50 ml ok. 2 tygodnie w lodówce
Roztwór B: Epon 812 50 ml
MNA 45 ml
Roztwór roboczy: roztwór A 13 ml Wykorzystać natychmiast
roztwór B 15 ml po sporządzeniu
DMP-30 16 kropli
4.10.4. Zatapianie w żywicy Araldite
Araldite(1)/tlenek propylenu 1:1 1 godz. (w zamkniętym naczyniu)
Araldite/tlenek propylenu 3:1 6 godz. (w otwartym naczyniu)
Araldite I 6 godz.
Araldite II (polimeryzacja) 24 godz. (45°C)
24-48 godz. (60°C)
(1) Roztwór roboczy Araldite: Araldite 27 ml
DDSA 23 ml
DMP-30 1 ml
4.10.5. Zatapianie w żywicy Durcupan
Durcupan(1)/tlenek propylenu 1:1 4 godz. (w zamkniętym naczyniu)
przez noc (w otwartym naczyniu)
Durcupan I 24 godz. (45°C)
Durcupan II (polimeryzacja) 48 godz. (60°C)
(1) Roztwór roboczy Durcupanu (oznaczenia pochodzą z zestawu firmowego):
roztwór A/M 10 ml
roztwór B 10 ml
roztwór C 0,6 ml
roztwór D 1 ml
4.10.6. Barwienie skrawków półcienkich do celów mikroskopii optycznej
A. błękit metylenowy 0,1 g
azur II 0,1 g
1% boraks 100 ml
B. błękit toluidynowy 0,5 g
azur II 1 g
1% boraks 100 ml
C. 1% safranina w 50% alkoholu etylowym
Na szkiełko podstawowe nakraplamy kilka kropli wody dest. Za pomocą ezy przenosimy skrawki z wanienki noża na powierzchnię wody na szkiełku, ostrożnie zlewamy wodę i kładziemy szkiełko na metalowej płytce ogrzanej do ok. 80°C. Po wysuszeniu skrawków (kilkanaście sekund) nakraplamy na nie jeden z powyższych roztworów barwników i barwimy na płytce do momentu widocznego parowania roztworu (30 sek - 1 min). Następnie płuczemy szkiełko przez 1-2 min w wodzie bieżącej i przemywamy w wodzie dest. Dobre wyniki daje również barwienie podwójne: roztworami A i C lub B i C.
4.10.7. Barwienie (kontrastowanie) skrawków ultracienkich do celów mikroskopii elektronowej
nasycony roztwór octanu uranylu 5-10 min
roztwór cytrynianu ołowiu (1) 1-2 min
Barwienie wykonuje się kładąc siatkę (ze skrawkami na dolnej powierzchni) na kropli odczynnika nakroplonego na płytkę Petry'ego pokrytą woskiem, parafiną lub paraplastem. Na czas barwienia płytkę przykrywamy. Po każdym barwieniu siatkę należy dokładnie opłukać w strumieniu wody dest.
(1) Roztwór cytrynianu ołowiu: cytrynian ołowiu 0,1 g
woda dest. 25 ml
10 M wodorotlenek sodu 0,25 ml
Odczynnik należy przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku, bez dostępu powietrza (np. w dużej plastykowej strzykawce, po całkowitym usunięciu z niej powietrza).
Podpisy pod ilustracje:
Ryc. 4.1. Kolejne etapy łamania noży szklanych. ---- rysa na szkle wyznaczająca linię przełomu
Ryc. 4.2. Fragment ostrza noża szklanego nadający się do krojenia skrawków ultracienkich (←→), określony położeniem łukowatej linii (----) widocznej po przełamaniu szkła na przeciwprostokątnej szklanego trójkąta
Ryc. 4.3. Krojenie skrawków ultracienkich: skrawki spływają na powierzchnię płynu wypełniającego wanienkę przymocowaną do noża szklanego
Ryc. 4.4. Krawędź przełamanego paska szklanego tworząca nóż Ralpha
Ryc. 4.5. Przykładowe typy siatek używanych do montowania skrawków w transmisyjnej mikroskopii elektronowej (powiększenie 6 ×)
Ryc. 4.6. Wykonywanie repliki. Powierzchnia próbki zostaje napylona pod pewnym kątem warstewką metalu, która "cieniuje" nierówności, a następnie warstwą węgla. Po wytrawieniu tkanki pozostaje sama metalowo-węglowa replika
Ryc. 4.7. Schemat metody mrożenia i łamania. Komórka zostaje przełamana na dwie części i powierzchnię przełomu jednej z nich pokrywa się repliką. Poniżej przedstawiono przykłady płaszczyzn przełomu niektórych komórkowych struktur błoniastych: 1 - błona komórkowa (zaznaczono jej trójwarstwową budowę), 2 - mitochondrium, 3 - otoczka jądrowa, 4 - siateczka śródplazmatyczna, C - cytoplazma, E - płaszczyzna egzoplazmatyczna, P - płaszczyzna protoplazmatyczna. Linia przerywana wyznacza płaszczyznę przełomu
69