Wykład 3

1. Co to jest krystalografia rentgenowska i do czego służy

Krystalografia jest metodą wysokorozdzielczej mikroskopii zdolna do wizualizacji struktur białek na poziomie atomów. Służy do określenia struktury 3d białek i kwasów nukleinowych wykorzystując zjawisko dyfrakcji promieni x na krysztale

2. Jakie zjawisko wykorzystuje krystalografia

Krystalografia rentgenowska polega na rozproszeniu - dyfrakcji promieni x na krysztale. Obraz dyfrakcyjny powstaje dzięki interferencji fal wiążki promieniowania rozproszonego przez atomy materii. Wiązka przechodzaca daje na obrazie plamę centralną - zaczernienie emulsji.

Kryształ wprowadzony w ruch powoduje pojawienie się na kliszy szeregu regularnych plamek zwanych refleksami.

3. Zasady krystalografii:

1. Elektrony powodują rozproszenie promieni rentgenowskich

2. Fale rozproszone nakładaja się

3. Sposób nakładania się fal rozproszonych zależy wyłącznie od rozkładu przestrzennego atomów.

4. Jaki jest cel badań strukturalnych

1. Poznanie struktury czasteczek pozwala na zrozumienie ich funkcji biologicznych

2. Badanie oddziaływań makromolekuł z innymi cząsteczkami i zachodzących zmian konformacyjnych jest podstawą w poszukiwaniu nowych terapii i kluczem do zrozumienia mechanizmów wielu chorób

3. Okreslenie struktury przestrzennej białek pozwala na opracowanie leków rozpoznających białka jako potencjalna tarczę swojego działa

5. Podstawowe pojęcia krystalografii:

1. Kryształy - stanowią regularnie powtarzające się cząsteczki o wewnętrznej symetrii.

2. Komórka elementarna - najmniejsza powtarzająca się komórka która generuje powstanie kryształu

3. Symetria - sposób zorganizowania części niezależnych w komórce elementarnej

4. Rozdzielczość - minimalna odległość między dwoma sąsiadującymi obiektami, przy ktorej mogą być rozróżnione jako 2 niezalezne obiekty

6. Etapy badań krystalografii:

1. Przygotowanie białka (czystość, rozpuszczalność, aktywność, stabilność)

2. Krystalizacja ( odpowiednie kryształy do pomiarów dyfrakcyjnych)

3. Testowanie kryształów

4. Zarejestrowanie danych dyfrakcyjnych (okreslenie symetrii, parametrów komórki elementarnej, gruy przestrzenne itd.)

5. Rozwiązanie struktury ( rozwiązanie problemu fazowego)

6. Zbudowanie modelu ( interpretacja map gęstości elektronowej)

7. Proces udokładnienia

8. Zdeponowanie współrzędnych w strukturalnej bazie danych

7. Jak przygotować białko do krystalografii

1. Czystość i homogenność (metody elektroforetyczne i chromatograficzne)

2. Po oczyszczeniu, rozpuszczalność - nieprawidłowe zwijanie - powstanie ciałek inkluzyjnych

3. Oczyszczona próbka białka wolna od agregatów

4. Sprawdzanie aktywności białka

5. Stabilność białka

8. Metody oczyszczania białek:

1. Separacja cząsteczek poprzez wirowanie : czasteczki poruszają się po okręgu z prędkością Katowa i podlegaja dzialaniu przyspieszenia odśrodkowego. Podczas wirowania czasteczki ulegaja sedymentacji.

2. Elektroforeza - czasteczki obdarzone ladukiem poruszaja się w polu elektrycznym. Szybkość wędrówki bialka zalezy od natężenia pola elektrycznego, od wypadkowego ładunku czasteczki i współczynnika tarcia. Prowadzi się ja na stalym nosniku (zele agarozowe lub poliakrylamidowe).

3. Filtracja Zelowa - czasteczki rozniace się wielkością można rozdzielic metoda chromatograficzna. Koluna wypelniona jest nosnikiem stalym w postaci ziarenek (dekstran). Male czasteczki wnikaja do wnętrza ziaren nosnika, wieksze pozostaja pomiedzy ziarnami.

4. Chromatografia jonowymienna - wykorzystuje roznice w ładunku wypadkowym czasteczek białkowych. Bialka naladowane ujemnie rozdziela się na nosnikach naladowanych dodatnio i odwrotnie.

9. Etapy badań krystalografii:

1. Zatężenie probki bialka do określonego stężenia - 10mg / ml

2. Dodanie soli w celu zmniejszenia rozpuszczalności bialka

3. Dodanie bialka na silikonowane szkiełko nakrywkowe

4. Pozostawienie na 24h w temperaturze 4 lub 18 st celsjusza

10. Budowanie modelu bialka:

1. Opracowanie fali gęstości elektronowej dla każdej plamki

2. Obliczanie map gęstości elektronowej

3. Jakość uzyskanych wynikow zalezy od rozdzielczości analizy rentgenograficznej

4. Granice rozdzielczości wyznacza stopien doskonałości krysztalu

5. W przypadku bialek najlepsza rozdzielczość - 0,2 nm

11. Co to jest spektroskopia rezonansu magnetycznego?

Jest to technika umożliwiająca poznanie atomowej struktury makrocząsteczek w roztworze. Pozwala na podstawie wyznaczonych odległości miedzyatomowych zrekonstruowac strukture bialka. Umozliwia identyfikacje grup funkcyjnych bialek. Pozwala na badanie kinetyki i mechanizmu szybko przebiegających reakcji. Białka muszą być w duzym stężeniu - 15 mg/ml

12. Co to jest proteomika?

Proteomika jest to identyfikacja wszystkich bialek przez genom.

1. Analiza ekspresji bialek w roznych typach Komorek

2. Analiza dystrybucji bialek w roznych subkomorkowych kompartymentach

3. Posttranslacyjna modyfikacja białek

4. Badanie oddziaływania białko-białko

5. Badanie relacji pomiedzy struktura i funkcją

13. Co to spektrometria masowa?

Jest to metoda zdolna do precyzyjnej analizy mas czasteczkowej roznych substancji: białek, polisacharydów, oligonukleotydów, dużych biomolekuł i syntetycznych polimerów.

---