Grupa VI, .04.2008 r.
Wykonano przez:
Temat ćwiczenia:
Analiza aminokwasów metodą chromatografii jonowymiennej przy użyciu analizatora AAA 400 [Ingos]
1. Wstęp teoretyczny
Chromatografia jonowymienna to rodzaj cieczowej chromatografii kolumnowej. Jest to metoda preparatywna używana do wydzielenia z mieszaniny żądanej substancji.W tej metodzie chromatografii faza stacjonarna, złoże, jest obdarzona ładunkiem. Stanowi je zazwyczaj żywica jonowymienna, zawierająca obdarzone ładunkiem grupy funkcyjne, oddziałujące z przeciwnie naładowanymi grupami związków, które mają zostać zatrzymane przez nośnik:
pozytywnie naładowany jonowymieniacz (anionit) wiąże aniony
negatywie naładowany jonowymieniacz (kationit) wiąże kationy.
Związki związane z jonowymieniaczem mogą być wymyte z kolumny przez stopniową elucję, a także poprzez zmianę stężenia soli lub pH.
Tego rodzaju chromatografii używa się do oddzielania takich związków jak aminokwasy, peptydy i białka. Chromatografia jonowymienna jest powszechnie stosowana do oczyszczania białek w systemie FPLC.
Wartości pomiarów detektora rejestrowane są przez komputer widoczne w postaci pików.
2. Cel ćwiczenia
Ilościowa analiza aminokwasów siarkowych
3. Wykonanie
Aminokwasy siarkowe użyte do ilościowej analizy to cysteina i metionina.
Przeprowadzono analizę próbki, wykorzystując program analizatora o parametrach:
Regeneracja i równoważenie kolumny (regeneracja 0,2 M NaOH, równoważenie buforem cytrynianowo - sodowym, pH 3,0)
Rozdział chromatograficzny i elucja buforem cytrynianowo - sodowym - pH 3,0, temperatura kolumny - 60 0C. Odczynnik do post - kolumnowej reakcji ninhydrynowej dozowany był automatycznie. Na podstawie chromatografu roztworu wzorcowego zidentyfikowano aminokwasy w próbce: 1 pik - cysteina, 2 pik - metionina
4. Wyniki
Parametry dla prób wzorcowych:
a). Cysteina- stężenie C= 250 µmoli/mililitr
pole powierzchni pod pikiem 34.3609
b). Metionina- stężenie C= 250 µmoli/mililitr
pole powierzchni pod pikiem 35.6151
Obliczenie stężeń w badanych próbkach:
Obliczenia wykonano korzystając z proporcji:
pole powierzchni pod pikiem wzorca - stężenie wzorca (µmoli/mililitr)
pole powierzchni pod pikiem badanej próbki - X µmoli/mililitr
dla cysteiny
pole powierzchni pod pikiem 9.9745
C=72.57 µmoli/mililitr
dla metioniny
pole powierzchni pod pikiem 8.6668
C=60.84 µmoli/mililitr
5. Dyskusja wyników
Dla cysteiny
C = 62.5 µmoli/mililitr - rzeczywiste stężenie w próbce
x = 72.57 µmoli/mililitr
Błąd bezwzględny:
Błąd względny:
Dla metioniny
C = 62.5 µmoli/mililitr - rzeczywiste stężenie w próbce
y = 60.84 µmoli/mililitr
Błąd bezwzględny
Błąd względny:
Stężenia, które otrzymaliśmy, różnią się od rzeczywistych stężeń aminokwasów w próbce, ponieważ do obliczeń uwzględniono dane tylko jednego roztworu wzorcowego. Gdyby było więcej próbek można by było sporządzić krzywą kalibracji, co pozwoliłoby dokładniej obliczyć stężenia badanych aminokwasów.