PRODUKCJA WITAMIN - dlaczego jesteśmy okłamywani?
WITAMINY
W 1912 roku, polski chemik Kazimierz Funk z łusek ryżu otrzymał substancję, która leczyła chorobę beri-beri - była to tiamina, czyli witamina B1. Funk uznał tę substancję za niezbędną do życia - amina necessaria ad witam, stąd powstała nazwa witamina.
Dokładne ustalenie zapotrzebowania organizmu człowieka na poszczególne witaminy jest trudne, gdyż zależy ono od wieku, cech osobniczych, działania synergistycznego itp. Niedobór jednej witaminy jest nazywany awitaminozą, wielu witamin - hiperwitaminozą.
W zależności od zapotrzebowania, roczna światowa produkcja witamin waha się od około kilkudziesięciu tysięcy ton w przypadku witaminy C, do kilku kg w przypadku witaminy H. Obecnie na świecie, ze względna koszty, większość witamin jest produkowana metodą syntezy chemicznej. Opracowane technologie produkcji większości witamin przy użyciu drobnoustrojów ze względów ekonomicznych nie zostały dotychczas wdrożone. Metodami biotechnologicznymi produkowane są w skali przemysłowej witaminy B2 i B12 oraz prowitaminy beta-karoten i ergosterol.
W ostatnich latach dużo uwagi poświęca się możliwościom produkcji semisyntetycznych witamin. Proces produkcji polega na syntezie chemicznej lub biologicznej prekursorów witaminy, a następnie przekształceniu prekursora we właściwą witaminę metodą biotechnologiczną lub chemiczną.
Podczas utrwalania surowców lub też ich technologicznego przerobu niejednokrotnie następuje zmniejszanie się zawartości witamin i dlatego zachodzi konieczność ich uzupełniania. Często też zachodzi konieczność wzbogacenia niektórych produktów w witaminy.
Witamina B2 (ryboflawina) jest produkowana przy użyciu różnych drobnoustrojów. Bakterie, drożdże, grzyby strzępkowe i algi zdolne są, podczas wzrostu, syntetyzować znaczące ilości ryboflawiny. Witamina B2 jest stosowana w medycynie, jako dodatek do żywności, a o niższym stopniu oczyszczenia, jako dodatek do pasz.
Do drobnoustrojów syntetyzujących znaczące ilości ryboflawiny (mg/dm3) należą
Clostridium acetobutylicum - 97
Escherichia coli - 505
Candida flareri - 567
Eremothecium ashbyii - 2480
Ashbya gossipii - 6420
Do produkcji witaminy B2 od dawna używa się drożdży Saccharomyces cerevisiae, które zawierają 39 - 80 mikrogramów witaminy B2/g suchej substancji. Proces produkcji jest dość prosty. Drożdże rozdrabnia się i poddaje autolizie w temperaturze 45-50 stopni Celsjusza, utrzymuje pH w przedziale 6 - 6,5. Ekstrakcję witaminy prowadzi się alkoholem, a wyciąg alkoholowy zagęszcza do 60% s.s.
W Japonii w 1985 roku doniesiono o użyciu Saccharomyces cerevisiae do syntezy ryboflawiny na pożywce zawierającej octan wapnia. Po 250h hodowli otrzymano 5,8 g witaminy B2/dm3 pożywki. Octan wapnia okazał się znacznie lepszym źródłem węgla niż melasa, albowiem nie zawierał żadnych zanieczyszczeń. Obecniedo produkcji ryboflawiny z powodzeniem używa się drożdży Candida flareri (Candida famata). Według amerykańskiego patentu (1988) można było otrzymać 21g ryboflawiny / dm3 pożywki po 200h hodowli mutogenizowanych drożdży Candida flareri, zdolnych do nadprodukcji witaminy B2. W przemysłowej produkcji witaminy B2 używa się grzybów Eremothecium ashbyii od 1940 roku i Ashbya gossipi od 1946 roku. Obecnie większość witaminy B2 produkuje się przy użyciu tych grzybów.
Wywar gorzelniczy, melasa, syrop kukurydziany, suszone drożdże, mleko odtłuszczone, mąka z nasion bawełny, mąka sojowa, białka zwierzęce, mąka rybna, brzeczka są podstawowymi surowcami do biosyntezy ryboflawiny przez E. Ashbyiii, A. Gossypii.
Obecność w pożywce oleju kukurydzianego, sojowego, kokosowego, słonecznikowego i innych wzmaga proces biosyntezy ryboflawiny przez wymienione grzyby. Stwierdzono, że wykorzystanie węgla z tłuszczu kukurydzianego do biosyntezy ryboflawiny jest prawie dwukrotnie intensywniejsze niż wykorzystanie węgla z glukozy. Do pożywki dodaje się również tiaminy, biotyny, inozytolu oraz mikroelementów.
Duże znaczenie ma dodatek do pożywki glicyny. Przykładowo, podczas hodowli A. Gossypii na pożywce zawierającej nomok kukurydziany, pepton i olej sojowy w płynie pohodowlanym otrzymano 1,5 g ryboflawiny /dm3. Przy dodatku do pożywki glicyny w ilości 1;2;3 g / dm3 w płynie pohodowlanym stwierdzono odpowiednio: 3,6; 3;9 i 4,2 g ryboflawiny /dm3. Kwasowość pożywki dla hodowli E. Aossypii - 5,5-7 pH. Optymalna temperatura napowietrzanej hodowli grzybów w czasie 90 - 120 h wynosiła 25 - 30 stopni Celsjusza. Po zakończeniu hodowli płyn zakwaszono kwasem siarkowym do pH 4,5 i zagęszczeniu suszono metodą walcową lub rozpryskową, uzyskując paszowy koncentrat witaminy B2.
W przypadku otrzymywania oczyszczonej witaminy z płynu pohodowlanego, stosuje się metody ekstrakcji, adsorpcji, frakcjonowanego strącenia. We wszystkich tych metodach pierwszym etapem jest usunięcie pozostałości tłuszczu przy użyciu eteru, w którym ryboflawina jest nierozpuszczalna. Jedna z metod polega na ogrzaniu do 120 stopni Celsjusza płynu pohodowlanego, zakwaszonego do pH 4,5. Po godzinie do filtratu dodaje się chlorku tytanu, co powoduje wytrącenie zredukowanej formy ryboflawiny. Osad rozpuszcza się w kwasie solnym (60st. C.) i napowietrza. Następnie roztwór się schładza, neutralizuje i poddaje krystalizacji.
Semisyntetyczną witaminę B2 produkuje się metodą syntezy chemicznej z otrzymanej metodą mikrobiologiczną D-rybozy i chemiczną izoaloksazyny.
Witaminę B12 (cyjanokobalaminę) otrzymuje się z wątroby lub mikrobiologicznie. Roczną światową produkcję szacuje się na 5 - 10 ton. Używana jest w medycynie do leczenia anemii złośliwej. Witaminę B12 dodaje się również do paszy (30 mg / t) przeznaczonej dla drobiu, świń i cieląt.
Wiele drobnoustrojów jest zdolnych do wewnątrzkomórkowej biosyntezy witaminy B12, między innymi z rodzaju Aerobacter, Azotobakter, Bacillus, Clostridium, Propionibacterium, Pseudomonas. Szczególnie dużo witaminy B12 - do 6 mg/ dm3 - syntetyzują drobnoustroje z gatunku Nocardia rugowa, N. gardneri, Streptomyces griseus, S. Olivaceus. W skali przemysłowej można otrzymać witaminę B12 z grzybni po produkcji antybiotyków, np. streptomycyny, gryzeiny. Obecnie najbardziej ekonomiczną metodą otrzymywania witaminy B12 w skali przemysłowej jest użycie bakterii z rodzaju Propionibacterium shermani i P. freudenreichii, które są zdolne do biosyntezy tej witaminy w ilości ponad 20 mg / dm3 pożywki.
W procesie biosyntezy witaminy B12 bardzo ważny jest dodatek do pożywki soli kobaltowych, niezbędnych dla syntezy witaminy. Niemniej jednak stężenie kobaltu w pożywce przekraczające 50ppm hamuje biosyntezę witaminy. Również dodatek do pożywki betainy, choliny stymuluje syntezę witaminy. Przykładowo, podczas hodowli P. denitrificans dodatek betainy i choliny w ilości 5 mg / ml powodował 10 - 20-krotny wzrost ilości witaminy B12. W hodowli niektórych drobnoustrojów stroje się dodatek
5,5-dimetylobenzoimidazolu, który odgrywa znaczącą rolę w syntezie witaminy B12 jako jeden z prekursorów tej witaminy.
Niektóre bakterie, np. P. freudenreichi ATCC 6207 i P. shermanii ATCC 13673, zdolne są do syntezy 5,6-dimetyzoimidiazolu w znacznych ilościach. Dlatego też biosyntezę witaminy B12 przez wymienione bakterie propionowe prowadzi się w dwu etapach. Pierwszy etap w warunkach beztlenowych prowadzi do namnożenia biomasy i syntezy kobinoamidu, a drugi w warunkach tlenowych dla syntezy prekursora i powstania witaminy B12. Hodowle bakterii propionowych prowadzi się przez kilka dni w temperaturze około 30st. C., utrzymując pH na poziomie 6,5 - 7,0.
W przemysłowej produkcji witamin B12 używa się również bakterii z rodzaju Pseudomonas. W wyniku 20 letnich badań, dzięki selekcji i mutagenizacji, produkcyjność szczepu P. denitrificans wzrosła z 5 do 120 - 140 mg witaminy B12 / dm3 pożywki.
W celu otrzymania paszowego koncentratu witaminy B12 całość płynu pohodowlanego wraz z bakteriami propionowymi (witamina b12 jest nagromadzana wewnątrz komórek) suszy się metodą rozpryskową. Gdyż użyte w hodowli drobnoustroje mogą być szkodliwe dla zdrowia zwierząt lub gdy otrzymuje się oczyszczoną witaminę B12, płyn pohodowlany albo wodną zawiesinę biomasy bakterii ogrzewa się do 80 - 120 stopni Celsjusza i przetrzymuje przez 10 - 30 minut przy pH 6,5 - 8,5, w celu ekstrakcji witaminy, a następnie poddaje oczyszczaniu. Proces otrzymywania czystej witaminy B12 metodami ekstrakcji i chromatografii, zwłaszcza na potrzeby medyczne, jest bardzo skomplikowany i długotrwały.
W ostatnich latach, w wyniku fuzji komórek wyselekcjonowanego szczepu Rhodopseudomonas ze szczepem Protominobacter, uzyskano organizm zdolny do biosyntezy 135 mg / dm3 witaminy B12 w ciągu beztlenowej 2 - 7-dniowej hodowli na pożywce z glukozą.
Z dużej grupy karotenoidów prekursorami witaminy A są tylko te, które w cząsteczce mają pierścień beta-jononowy. Jest to przede wszystkim beta-karoten, z którego powstają dwie cząsteczki witaminy A. Formami czynnymi witaminy A są retinol (witamina A1)
i 3, 4-didehydroretinol (witamina A2).
Retinol występuje tylko w tkankach zwierzęcych, natomiast surowce roślinne zawierają prekursory retinolu - karotenoidy, a głównie beta-karoten. Po wysuszeniu biomasy otrzymuje się produkt zawierający 3% beta-karotenu, który może być użyty, jako dodatek do żywności lub do pasz. Biomasę alg można również poddać ekstrakcji, używając, jako rozpuszczalnika beta-karotenu oleju roślinnego.
Wiele grzybów zdolnych jest do biosyntezy beta-karotenu, np. Aspergillus giganteus, Phycomyces blokesleeanus, Rhodosporidium diobovatum mogące zawierać odpowiednio:
0,17 , 0,55 , 0,70 mg beta-karotenu w gramie suchej biomasy. Na skalę przemysłową do produkcji beta-karotenu używa się obecnie grzyba Blakeslea trispora. Na pożywce zawierającej mieloną kukurydzę, mąkę z nasion bawełny, oleje roślinne, melasę owoców cytrusowych, tiaminę, oczyszczoną naftę, uzyskano około 1 grama beta -karotenu w przeliczeniu na 1 dm3 pożywki. Dodatek octanu, aminokwasów, a szczególnie beta-jononu w ilości do 1,8 g /dm3 znacznie intensyfikuje biosyntezę beta-karotenu. Stwierdzono, że wspólna hodowla szczepów B. Trispora, o zróżnicowanej płci, w porównaniu z hodowlą pojedynczego szczepu, umożliwia uzyskanie ponad 5 - 15-krotnego wzrostu biosyntezy beta-karotenu.
We Francji opracowano technologię beta-karotenu, która umożliwia uzyskanie ponad 3 g beta-karotenu w litrze pożywki. Hodowlę szczepu B. Trispora NRRL 2456 (+) i NRRL 2457 (-) początkowo prowadzi się w temperaturze 26 stopni Celsjusza przez 48 h, oddzielnie na pożywkach zawierających wyciąg kukurydziany, skrobię kukurydzianą, mąkę sojową, olej bawełniany, antyoksydant, tiaminę, izoniosyd, naftę, sole manganowe. Następnie hodowle łączy się i przez 40 h prowadzi wspólną napowierzchnianą hodowlę, która potem stanowi inokulum. Pożywka produkcyjna o pH 6,3 zawiera wywar gorzelniczy, skrobię kukurydzianą, mąkę sojową, olej bawełniany, antyoksydant, sole manganowe, tiaminę, izoniosyd i naftę. Po inokulacji prowadzi się napowietrzaną 185-godzinną hodowlę, dodając po 48 h beta-jonon, a pod koniec hodowli glukozę. Wysuszona biomasa stanowi źródło beta karotenu, który dodaje się do paszy lub też ponownie poddaje ekstrakcji i oczyszczaniu, otrzymując preparat beta-karotenu na potrzeby medyczne i spożywcze.
Ergosterol jest prowitaminą D2 (erkalcyd, ergokalcyferol) wykazującą w organizmie działanie przeciwkrzywicze i wzrostowe. Jest to jedyna witamina o budowie sterydowej. Witamina D jest stosowana w przemyśle spożywczym do wzbogacania mleka, a zwłaszcza margaryn, albowiem oleje roślinne nie zawierają witaminy D. Drożdże piekarnicze zawierające 0,1 - 0,6% ergosterolu w s.s. były jednym z pierwszych źródeł ergosterolu i wielu innych witamin.
Witaminę D produkuje się na skalę przemysłową metodą chemiczną lub też przy użyciu mikroorganizmów, otrzymując prowitaminę - ergosterol, który pod wpływem promieniowania UV ulega przekształceniu w witaminę D2. Ergosterol produkuje się przy użyciu drożdży S. Cerevisiae, S. Carlsbergensis, S.uvarum, Candida tropicalis, C. petrophilum. S. Carlsbergensis ATC 2345 zdolny jest do biosyntezy ergosterolu w ilości 2,4% s.s., Rhodoturula gracilis 2,7% s.s. a S. Cerevisiae 3,9% s.s. Jako źródło węgla drożdże wykorzystują węglowodany zawarte w melasie, namoku kukurydzianym. Inne węglowodany oraz alkohol etylowy też mogą być źródłem węgla, Na biosyntezę ergosterolu w dużym stopniu wpływa napowietrzenie hodowli. Poczterodniowej hodowli, w temperaturze 28 stoponi Celsjusza, na pożywce zawierającej melasę i namok kukurydziany, biomasa wyselekcjonowanego szczepu S. Cerevisiae zawierała 7 - 10% ergosterolu w s.s. Z 1 dm3 pożywki otrzymano 30 - 40 g biomasy, co sugeruje, że szczep ten jest dobrym producentem ergosterolu.
Namnożoną biomasę drożdży po wydzieleniu z płynu pohodowlanego poddaje się hydrolizie w celu uwolnienia ergosterolu. Stosuje się hydrolizie kwasową enzymatyczną (enzymy proteolityczne) lub autolizę w temperaturze 45 stopni Celsjusza. Metodami ekstrakcji wydziela się ergosterol z hydrolizatu i po zagęszczeniu i kilkakrotnej krystalizacji rozpuszcza w alkoholu etylowym, eterze etylowym lub innym rozpuszczalniku organicznym, nie pochłaniającym promieniowania UV. Roztwór 0,5-proc. ergosterolu poddaje się izomeracji w warunkach beztlenowych, w aparatach ze szkła kwarcowego, naświetlając go falami świetlnymi długości 275 - 315 nm. Wydajność procesu mierzona ilością powstałej witaminy D2 nie przekracza 10%.
Wydawnictwo Naukowo-Techniczne. Biotechnologia Żywności - wydanie drugie zmienione