1. Charakterystyka chemiczna kwasów nukleinowych

2. Izolacja genomowego DNA z drożdży Saccharomyces cerevisiae

3. Amplifikacja genów kodujących rybosomowe białka P1A i P1B drożdży Saccharomyces cerevisiae

4. Transkrypcja w warunkach in vivo w komórkach bakteryjnych i drożdżowych

5. Izolacja jąder komórkowych i histonów

6. Analiza składu białkowego chromatyny

7. Trawienie DNA chromatyny nukleazą ze Staphylococcus aureus

8. Elektroforetyczna analiza DNA po trawieniu nukleazą ze Staphylococcus aureus

9. Izolacja RNA z komórek drożdży

10. Elektroforetyczna analiza RNA

11. Translacja w warunkach in vivo w komórkach bakteryjnych i drożdżowych

12. Badanie wpływu inhibitorów translacji na wzrost komórek drożdżowych

13. Otrzymywanie rybosomów i frakcji cytoplazmatycznej drożdży Saccharomyces cerevisiae

14. Izolacja kwaśnych białek rybosomowych z drożdży

15. Analiza elektroforetyczna białek rybosomowych

16. Izolacja kinaz białkowych z drożdży Saccharomyces cerevisiae

17. Lokalizacja i regulacja aktywności kinazy białkowej CK2

18. Aktywacja i specyficzność substratowa kinazy zależnej od cAMP

19. Wykrywanie inhibitorów proteaz serynowych

20. Identyfikacja inhibitora trypsyny metodą elektroforezy w warunkach niedenaturujących

21. Badanie aktywności enzymatycznej w żelu poliakrylamidowym
    na przykładzie inwertazy

22. Cykl życiowy drożdży Saccharomyces cerevisiae

Charakterystyka chemiczna kwasów nukleinowych

Analiza składu chemicznego RNA lub DNA jest poprzedzona ich hydrolizą.
W przypadku RNA, można stosować zarówno hydrolizę zasadową, jak i kwaśną. DNA zaś jest odporny na działanie zasad. Decyduje o tym brak grupy -OH przy węglu 2′-deoksyrybozy. Z tego względu, analizę chemiczną DNA przeprowadza się po hydrolizie kwasami.

Hydroliza kwaśna RNA i DNA

W celu całkowitej hydrolizy RNA lub DNA i uzyskania wolnych zasad purynowych
i pirymidynowych, stosuje się wysokie stężenia kwasu solnego, nadchlorowego lub siarkowego.

Odczynniki

1% wodne roztwory DNA i RNA (preparaty handlowe)

1M roztwór H₂SO₄

Wykonanie ćwiczenia

Do jednej zlewki odmierzyć 10 ml 1% roztworu RNA, a do drugiej 10 ml 1% roztworu DNA. Następnie, do obu zlewek odmierzyć po 10 ml 1M H₂SO₄. Zlewki zatkać gumowym korkiem z umieszczoną w nim rurką szklaną i gotować na wrzącej łaźni wodnej przez 60 min. Po tym czasie zlewki wyjąć z łaźni, oziębić i zachować do dalszych doświadczeń.

Wykrywanie pentoz (reakcja Biala)

Odczynniki

0,5% roztwory RNA i DNA po hydrolizie

Odczynnik orcynolowy (0,3 g orcyny rozpuścić w 100 ml stężonego HCl i dodać 5 kropli 10% roztworu FeCl₃)

Wykonanie ćwiczenia

Do jednej probówki odmierzyć 0,5 ml hydrolizatu RNA, a do drugiej 0,5 ml hydrolizatu DNA. Do każdej z probówek dodać po 1 ml odczynnika orcynolowego i ogrzewać
ok. 5-10 min. we wrzącej łaźni wodnej. W probówce zawierającej pentozę pojawia się zielone zabarwienie.

Wykrywanie deoksyrybozy (reakcja Dischego)

Odczynniki

Odczynnik difenyloaminowy (1g difenyloaminy rozpuścić w 100 ml lodowatego CH₃COOH
z dodatkiem 2,75 ml stężonego H₂SO₄ cz.d.a.)

0,5% roztwory RNA i DNA (przed lub po hydrolizie)

Wykonanie ćwiczenia

Do jednej probówki odmierzyć 0,5 ml roztworu RNA, a do drugiej 0,5 ml roztworu DNA. Do każdej z probówek dodać po 1 ml odczynnika difenyloaminowego. Probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 5-10 min. Pojawienie się niebieskiego zabarwienia próby świadczy
o obecności deoksyrybozy.

Wykrywanie kwasu ortofosforowego

Wykrywanie ortofosforanów w hydrolizatach kwasów nukleinowych polega na reakcji
z molibdenianem amonu. Jon ortofosforowy tworzy kompleks soli amonowej heteropolikwasu tetratrimolibdeniano-fosforowego o barwie żółtej.

Odczynniki

Roztwór molibdenianu amonowego: 10g kwasu molibdenowego rozpuścić w mieszaninie: 14,4 ml 25% roztworu amoniaku i 27,1 ml wody. Następnie całość wlać powoli, ciągle mieszając, do roztworu kwasu azotowego (48,9 ml stężonego kwasu azotowego plus 114,8 ml wody)

0,5% roztwory RNA i DNA po hydrolizie

0,5% roztwór NaH₂PO₄ ( roztwór wzorcowy)

Wykonanie ćwiczenia

Do jednej probówki odmierzyć 0,5 ml hydrolizatu RNA, do drugiej 0,5 ml hydrolizatu DNA, a do trzeciej 0,5 ml wzorcowego roztworu ortofosforanu (kontrola). Do każdej z probówek dodać po 1 ml roztworu molibdenianu amonowego. Zawartość probówek ogrzać na łaźni wodnej do wrzenia. W obecności ortofosforanów wytrąca się żółty osad fosfo-molibdenianu amonowego.

Wykrywanie zasad purynowych

Odczynniki

1M roztwór NaOH

1% roztwór CuSO₄

0,5% roztwor RNA po hydrolizie

Nasycony roztwór Na₂S₂O₅ (10 ml)

Wykonanie ćwiczenia

Do 0,5 ml hydrolizatu RNA dodawać kroplami 1M NaOH, by uzyskać pH roztworu około 6,0 (odczyn sprawdzać papierkiem wskaźnikowym). Następnie, roztwór zagotować, po czym wprowadzić najpierw 6 kropli 1% CuSO₄ a potem ostrożnie kroplami nasycony roztwór Na₂S₂O₅. Pirosiarczyn sodu redukuje jony Cu²⁺ do Cu⁺, które z purynami tworzą nierozpuszczalne sole miedziawe.

Rozpuszczalność kwasów nukleinowych w kwasach, zasadach i alkoholu

Odczynniki

1 % wodne roztwory RNA i DNA

2M roztwór HCl

2M roztwór NaOH

Alkohol izopropylowy (oziębiony)

Wykonanie ćwiczenia

1. Do dwóch probówek zawierających oddzielnie po 0,5 ml roztworów RNA i DNA, dodawać kroplami 2M HCl, aż nastąpi wytrącenie się kwasów nukleinowych. Następnie dodawać kroplami 2M NaOH. Zanotować wynik.

2. Do jednej probówki odmierzyć 0,5 ml roztworu RNA, a do drugiej 0,5 ml roztworu DNA. Do każdej z nich dodać po 1,5 ml izopropanolu. Zanotować wynik.

Izolacja genomowego DNA z drożdży Saccharomyces cerevisiae

Izolacja kwasów nukleinowych jest pierwszym etapem wielu procedur stosowanych
w inżynierii genetycznej oraz diagnostyce molekularnej. Celem jest uzyskanie materiału wysokiej czystości, czyli wolnego od białek i polisacharydów mogących negatywnie wpływać na dalsze analizy. Istotne jest także, aby izolowany kwas nukleinowy nie uległ zbytniej fragmentacji czy enzymatycznej degradacji w czasie stosowanych procedur. Aktualnie dysponujemy bardzo zróżnicowanymi metodami otrzymywania kwasów nukleinowych, od złożonych, wieloetapowych procedur wykorzystujących rozpuszczalniki organiczne do szybszych, prostszych i bezpieczniejszych. Wybór odpowiedniej metody izolacji zależy od:

• rodzaju otrzymywanego kwasu nukleinowego (DNA genomowe, mitochondrialne, plazmidowe, RNA itd.),

• pochodzenia (roślinne, zwierzęce, bakteryjne, wirusowe itd.) i rodzaju materiału
  z którego przeprowadzamy izolację (np. z tkanek, organu, hodowli komórkowej itd.),

• docelowego przeznaczenia kwasu nukleinowego (np. PCR, klonowanie, synteza cDNA, itd.), co nakłada konkretne wymagania względem jego czystości
  i jakości.

Każda izolacja drożdżowego DNA wymaga rozbicia ściany komórkowej. Stosowane są metody mechaniczne lub łagodniejsze obejmujące enzymatyczną degradację ściany komórkowej drożdży i lizę otrzymanych sferoplastów przy udziale detergentów. Enzymy wykorzystywane do otrzymania sferoplastów drożdżowych to najczęściej litykaza
(z Arthrobacter luteus) lub glukulaza (ze ślimaka), hydrolizujące wiązanie -1,3 glikozydowe występujące w glukanie ściany komórkowej.

Zastosowana na ćwiczeniach metoda izolacji umożliwia otrzymanie kilkunastu mikrogramów drożdżowego DNA, które jest gotowe do cięcia enzymami restrykcyjnymi
i może służyć jako matryca w rekcji PCR.

Materiały i odczynniki

1. 12 godzinna hodowla drożdży S. cerevisiae w pożywce YPD (50 ml)

2. Bufor do sferoplastyzacji:

1 M sorbitol,

50 mM Tris-HCl, pH 7,5

20 mM EDTA,

20 mM β-MET (dodać bezpośrednio przed użyciem)

3. Zymoliaza 100T (handlowy preparat zawierający litykazę) - 2,5 mg/ml w buforze
   do sferoplastyzacji

4. 10 % w/v SDS

5. Bufor do lizy (50 mM Tris pH 7.5; 20 mM EDTA)

6. 5 M octan potasu

7. 5 M NaCl

8. 96% i 70% etanol (oziębiony)

9. Bufor TE (10 mM Tris - HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA)

10. Termoblok lub łaźnia wodna

11. Jałowe probówki Eppendorfa o poj. 2 ml i końcówki do pipet

12. Mikroskop świetlny oraz szkiełka podstawowe i nakrywkowe

13. Odczynniki i zestaw do elektroforezy kwasów nukleinowych (patrz strona XX)

Wykonanie ćwiczenia

1. Przenieść 4 ml zawiesiny komórek do dwóch probówek Eppendorfa o poj. 2 ml. Osadzić komórki przez wirowanie przy prędkości 3000 rpm przez 5 min.
   w temp. 4⁰C.

2. Osad komórek zawiesić łącznie w 0,5 ml buforu do sferoplastyzacji w jednej probówce Eppendorfa (dodać β-MET do końcowego stężenia 20 mM!).

3. Dodać 20 μl roztworu zymoliazy 100T, dobrze wymieszać i inkubować przez 20 min w temp. 37⁰C (sferoplastyzacja trwa od 20 do 120 min, zależnie od szczepu, rodzaju podłoża czy fazy wzrostu komórek).

4. Sprawdzić formowanie się sferoplastów:

1. pod mikroskopem świetlnym, pobierając na jedno szkiełko podstawowe 4 μl zawiesiny komórek oraz 4 μl 0,1% SDS, a na drugie 4 μl zawiesiny komórek oraz 4 μl buforu do sferoplastyzacji; formowanie sferoplastów jest zakończone, gdy 80-90 % komórek występuje jako tzw. komórki-duchy (z ang. ghost cells);

2. dodając do dwóch szklanych probówek po 0,5 ml buforu do sferoplastyzacji, potem do jednej z nich 50 μl 10 % roztworu SDS, następnie do obu probówek dodać po 5 μl zawiesiny komórek i energicznie zamieszać; stopień strawienia ściany komórkowej można uznać za zadowalający, jeśli zawiesina w probówce
   z SDS stanie się klarowna.

5. Osadzić uzyskane sferoplasty przez wirowanie przy prędkości 3000 rpm przez 5 min. w temp. 4⁰C. Supernatant delikatnie usunąć za pomocą pipety, a osad sferoplastów zawiesić w 0,5 ml buforu do lizy.

6. Dodać 25 μl 10% SDS (końcowe stężenie 0,5 % SDS). Zawartość dokładnie wymieszać przez kilkakrotne odwracanie probówki. Uważać aby zawartość probówki nie uległa spienieniu! Całość inkubować 20 min. w temp. 65⁰C.

7. Schłodzić probówkę w lodzie po czym dodać 0,2 ml 5M octanu potasu, Zawartość dokładnie wymieszać przez kilkakrotne odwracanie probówki, a następnie inkubować w lodzie przez 20 min. Widoczny po dodaniu octanu potasu biały precypitat tworzą kompleksy SDS ze zdenaturowanymi białkami.

8. Odwirować próbki przy prędkości 10000 rpm przez 10 min. w temp. 4⁰C.

9. Przenieść 500 μl supernatantu do nowej probówki Eppendorfa o poj. 2 ml (temp. pokojowa).

10. Do supernatantu dodać trzy objętości oziębionego 96% etanolu i 1/10 objętości 5M NaCl (precypitacja kwasów nukleinowych). Próbkę pozostawić w temp. -20⁰C
    do kolejnych ćwiczeń (co najmniej godzinę).

11. Osadzić wytrącony kwas nukleinowy przez wirowanie przy prędkości 10000 rpm przez 15 min. w temp. 4⁰C, po czym delikatnie usunąć supernatant.

12. Uzyskany osad DNA przemyć 1 ml oziębionego 70% etanolu, po czym odwirować przez 5 min. przy prędkości 10000 rpm w temp. 4⁰C. Supernatant odrzucić, a osad wysuszyć w eksykatorze przez 20 min. (aż do całkowitego zaniku zapachu etanolu).

13. Rozpuścić osad w 50-100 μl buforu TE (pH 8.0); gdy pojawią się problemy
    z rozpuszczalnością DNA - inkubować ok. 10 min w temp. 62⁰C lub pozostawić
    w lodówce na okres około 12 godzin.

14. Sprawdzić wyizolowane DNA (przygotowując próbki do elektroforezy zawierające
    15 μl DNA i 5 μl buforu próbkowego do DNA) na 0.7 % żelu agarozowym (przygotowanie żelu i przeprowadzenie elektroforezy DNA - patrz przepis strona XX). DNA przechowywać w temp. - 70⁰C. Należy unikać wielokrotnego zamrażania
    i odmrażania próbek DNA.

Amplifikacja genów kodujących rybosomowe białka P1A i P1B drożdży Saccharomyces cerevisiae

Oczyszczone genomowe DNA może służyć jako matryca do amplifikacji genów
z wykorzystaniem metody PCR (z ang. Polymerase Chain Reaction). Amplifikacja sekwencji DNA odbywa się z użyciem pary oligonukleotydowych starterów, z których każdy jest komplementarny do jednego końca docelowej sekwencji DNA. Startery te są wydłużane
w kierunku do siebie przy udziale termostabilnej polimerazy DNA w cyklu kilkunastu (kilkudziesięciu) reakcji, na które składają się: denaturacja, przyłączanie starterów oraz polimeryzacja. Poszczególne etapy cyklu reakcji PCR zachodzą w różnych temperaturach:

• zaczynająca cały cykl reakcja denaturacji odbywa się w temperaturze 93-96°C i jej zadaniem jest rozplecenie podwójnych nici DNA,

• po czym, następuje ochłodzenie mieszaniny reakcyjnej do doświadczalnie dobranej temperatury (42-68⁰C) w której następuje przyłączenie starterów do matrycy,
  ang. annealing (na tym etapie można kontrolować specyficzność łączenia się starterów do DNA),

• w kolejnym etapie, polimeryzacji, temperatura wzrasta do 72⁰C (optymalna temp. działania polimerazy) i następuje wydłużanie nici - począwszy od końca 3' startera enzym dokłada kolejne, komplementarne w stosunku do matrycy nukleotydy w tempie około 1000 nukleotydów na minutę dla najczęściej wykorzystywanej polimerazy Taq (z Thermus aquaticus).

Ze względu na jednoczesne kopiowanie dwóch komplementarnych nici matrycy, po każdym cyklu następuje podwojenie liczby amplifikowanych cząsteczek DNA, a liczba kopii DNA po zakończeniu około 30 cykli przekracza już kilka milionów. Jakość uzyskanego
za pomocą reakcji PCR DNA można analizować metodą elektroforezy w żelu agarozowym, wybarwiając DNA bromkiem etydyny.

Interpretując wyniki uzyskane metodą PCR, należy pamiętać, że najczęstszą przyczyną braku amplifikacji jest hamujący wpływ zanieczyszczeń obecnych w matrycowym DNA. Innym często występującym problemem jest obecność niespecyficznych produktów amplifikacji, która najczęściej wynika z niewłaściwego doboru temperatury przyłączania się starterów czy nieodpowiedniego stężenia jonów Mg++ koniecznych do prawidłowego łączenia się DNA ze starterami.

Celem ćwiczenia jest porównanie długości genów dla dwóch drożdżowych białek rybosomowych: P1A i P1B powielonych metodą PCR z genomowego DNA drożdży. Białka te cechuje jednakowa długość łańcucha polipeptydowego (106 aa) i duże podobieństwo struktury pierwszorzędowej czego pochodną są zbliżone masy cząsteczkowe białek wynoszące odpowiednio 10 908 i 10 667 Da. Pozwala to założyć jednakową długość sekwencji mRNA kodującej te białka. Startery reakcji PCR zostały zaprojektowane w ten sposób, aby powieleniu uległa sekwencja obejmująca początkowy kodon ATG jak też kodon STOP obu białek, dlatego uzyskane po reakcji PCR fragmenty DNA będą bezpośrednio odpowiadały długości genów kodujących te białka.

P1A 1 MSTESALSYA ALILADSEIE ISSEKLLTLT NAANVPVENI WADIFAKALD

P1B 1 MSDSIISFAA FILADAGLEI TSDNLLTITK AAGANVDNVW ADVYAKALEG

P1A 51 GQNLKDLLVN FSAGAAAPAG VAGGVAGGEA GEAEAEKEEE EAKEESDDDM

P1B 51 KDLKEILSGF HNAGPVAGAG AASGAAAAGG DAAAEEEKEE EAAEESDDDM

P1A 101 GFGLFD

P1B 101 GFGLFD

Rys. Porównanie sekwencji aminokwasowych drożdżowych białek P1A i P1B

Materiały i odczynniki

1. Genomowe DNA drożdży uzyskane na poprzednich ćwiczeniach.

2. Startery reakcji PCR dla genów kodujących białka P1A i P1B

3. Polimeraza Taq 1U/l

4. Bufor dla polimerazy Taq (firmowy)

5. 2 mM mieszanina deoksynukleotydów (dNTP)

6. 25 mM MgCl₂ (firmowy)

7. Jałowa dejonizowana woda

8. Jałowe probówki Eppendorfa o poj. 0,5 ml i cienkościenne probówki do reakcji PCR
   o poj. 0,2 ml oraz końcówki do pipet

9. Odczynniki i zestaw do elektroforezy kwasów nukleinowych (patrz strona _)

Wykonanie ćwiczenia

1. Do probówki Eppendorfa o poj. 0,5 ml, umieszczonej w lodzie, odmierzyć następujące składniki mieszaniny reakcyjnej:

33 l dejonizowanej wody

5 l dNTP

5 l buforu dla polimerazy Taq

5 l roztworu MgCl₂

1 l genomowego DNA drożdży

1 l polimerazy DNA Taq

2. Wymieszać zawartość probówki i osadzić płyn ze ścianek przez odwirowanie, po czym rozdzielić mieszaninę reakcyjną na dwie równe części do dwóch próbówek do PCR. Następnie do jednej z próbówek dodać po 1 l obu starterów do amplifikacji genu kodującego białko P1A, a do drugiej probówki dodać po 1 l obu starterów do amplifikacji P1B.

3. Reakcje przeprowadzić w termocyklerze w warunkach wskazanych przez prowadzącego ćwiczenia. Po reakcji do każdej probówki dodać po 5 l buforu do elektroforezy DNA i dokonać elektroforetycznego rozdziału powstałych fragmentów oraz komercyjnego wzorca DNA w 1% żelu agarozowym (według przepisu na stronie XX).

Interpretacja wyników

1. Porównać długość fragmentów DNA i zinterpretować otrzymane wyniki.

2. Samodzielnie przeprowadzić porównanie sekwencji genów dla obu białek korzystając z bazy http://www.yeastgenome.org/ (nazwy genów dla białek to odpowiednio RPP1A i RPP1B) i przedstawić zestawienie sekwencji genów obu białek w formie pisemnej na następnych zajęciach.

Transkrypcja w warunkach in vivo w komórkach bakteryjnych
i drożdżowych

W procesie transkrypcji, katalizowanej przez polimerazy RNA zależne od DNA, informacja zawarta w DNA zostaje przepisana na RNA. Celem ćwiczenia jest zbadanie wpływu ryfampicyny i aktynomycyny D na transkrypcję w warunkach in vivo w komórkach bakterii E. coli i drożdży S. cerevisiae. Ryfampicyna, półsyntetyczna pochodna ryfamycyn, oddziałuje z podjednostką β bakteryjnej polimerazy RNA i blokuje inicjację transkrypcji nowych łańcuchów RNA nie wpływając na transkrypcję łańcuchów, których synteza już się rozpoczęła. Aktynomycyna D zaś wiąże się do dwuniciowego DNA, uniemożliwiając wykorzystanie takiego DNA jako matrycy w syntezie RNA.

Materiały i odczynniki

1. 18-godzinna hodowla bakterii E. coli w podłożu LB (20 ml)

2. 18-godzinna hodowla drożdży S. cerevisiae w podłożu SD (20 ml)

3. Podłoże LB i SD

4. Ryfampicyna (20 mg/ml w metanolu)

5. Aktynomycyna D (5 mg/ml w 96% etanolu)

6. [³H]-urydyna

7. Wysuszone krążki bibuły Whatman 3MM o średnicy 2,0 cm, moczone uprzednio przez dobę w roztworze 0,5M NaCl z dodatkiem 1 mg/ml nie znakowanej urydyny

8. TCA 5% i 10%

9. Płyn scyntylacyjny

Wykonanie ćwiczenia

1. Zmierzyć gęstość optyczną całonocnych hodowli drożdży przy długości fali 600 nm (OD₆₀₀). Pomiar wykonać względem próby kontrolnej (pożywka SD). Jeśli zaistnieje konieczność, (tzn. wielkość OD przekracza 1), należy próbkę hodowli rozcieńczyć,
   a następnie uwzględnić to przy obliczaniu jej gęstości. Znając gęstość optyczną hodowli drożdży, przygotować 5 ml hodowli rozcieńczonej pożywką SD,
   do OD₆₀₀=0,4.

2. Tak przygotowaną hodowlę rozlać, po 1 ml, do trzech probówek. Następnie do jednej z probówek hodowli dodać 25 µg aktynomycyny D, do drugiej 100 µg ryfampicyny, a trzecią pozostawić jako kontrolę. Zawartość probówek dokładnie wymieszać
   i inkubować w temp. 30⁰C przez 15 min.

3. Do wszystkich probówek dodać znakowaną urydynę w ilości 10 µCi/ml
   i wymieszać. Bezpośrednio po dodaniu urydyny z probówek pobrać po 50 µl hodowli i nanieść na przygotowane wcześniej krążki bibuły Whatman 3MM moczone
   w roztworze urydyny (czas 0). Identyczne próbki hodowli pobierać po 15, 30, 45 i 60 minutach inkubacji.

4. Krążki wysuszyć pod lampą, przenieść do 10% TCA (ok.200 ml) i pozostawić przy stałym mieszaniu na 15 min.

5. Przenieść krążki do naczynia z 5% TCA (ok. 200 ml) i ponownie mieszać przez
   15 min, po czym wysuszyć pod lampą.

6. Suche krążki umieścić w naczynkach scyntylacyjnych zawierających po 5 ml płynu scyntylacyjnego i liczyć radioaktywne piętno pochodzące od wbudowanej do RNA [³H]-urydyny przy użyciu licznika scyntylacyjnego.

7. Identyczne doświadczenie wykonać z bakteriami E. coli, zachowując temperaturę inkubacji 37⁰C.

Interpretacja wyników

1. Porównać poziom inkorporacji [³H]-urydyny w hodowli bakteryjnej i drożdżowej
   w zależności od czasu inkubacji i obecności antybiotyków. Wyniki przedstawić
   w formie wykresu, odkładając na osi X czas inkubacji, a na osi Y poziom inkorporacji [³H]-urydyny (w imp/min.)

Izolacja jąder komórkowych i histonów

W komórkach eukariotycznych większość DNA znajduje się w wyspecjalizowanych organellach - jądrach komórkowych. DNA jądrowy występuje w postaci kompleksu nukleoproteinowego, zwanego chromatyną. Podstawową jednostką strukturalną chromatyny jest nukleosom. W skład nukleosomu wchodzi tzw. cząstka rdzeniowa (ang. core particle), cząsteczka histonu H1 i fragment DNA o długości ok. 190-220 pz. Cząstkę rdzeniową tworzy kompleks ośmiu histonów (oktamer) zwanych histonami rdzeniowymi (po dwie cząsteczki histonów H2A, H2B, H3 i H4). Wokół oktameru owinięty jest odcinek DNA o długości 140-150 pz. Pozostałą część stanowi łącznikowy DNA (ang. linker DNA) o długości 50-70 pz
z którym oddziałuje pojedyncza cząsteczka histonu H1. Znanych jest wiele wariantów sekwencyjnych histonu H1, występujących w określonych tkankach lub etapach rozwoju danego organizmu. Na przykład w jądrzastych erytrocytach ptaków zamiast histonu H1 występuje histon H5.

Histony mogą podlegać szeregu modyfikacjom potranslacyjnym, np. acetylacji, metylacji, fosforylacji czy ubikwitynacji. Modyfikacje te mają istotne znaczenie w regulacji stopnia upakowania DNA i jego dostępności dla replikacji i transkrypcji np. acetylacja reszt lizyny na N-końcu łańcucha polipeptydowego histonów rdzeniowych zmniejsza ich powinowactwo do DNA, co powoduje rozluźnienie struktury chromatyny i zwiększenie poziomu ekspresji genów. Warto zauważyć, że wpływ modyfikacji potranslacyjnych histonów na stopień kondensacji chromatyny i ekspresję genów nie zależy tylko od rodzaju modyfikacji ale także od miejsca wystąpienia takiej modyfikacji na białku histonowym,
np. metylacja reszty lizyny w pozycji 9 łańcucha polipeptydowego histonu H3 powoduje zwiększenie stopnia upakowania chromatyny i wyciszenie ekspresji genów zaś metylacja reszty lizyny w pozycji 4 wpływa na rozluźnienie struktury chromatyny. Wysunięto hipotezę „kodu histonowego”, która sugeruje, że istnieją pewne określone wzory modyfikacji histonów odpowiedzialne za zachodzenie konkretnych procesów w komórce.

Materiał badawczy na ćwiczeniach stanowi linia komórkowa fibroblastów mysich NIH 3T3 lub linia komórkowa wywodząca się z komórek raka szyjki macicy HeLa. Komórki hodowane są na płytkach Petriego (10x14cm) odpowiednio w płynie hodowlanym DMEM
i RPMI, w temperaturze 37⁰C i w atmosferze 5% CO₂. Celem ćwiczenia jest otrzymanie preparatów zawierających wszystkie białka jądrowe oraz izolacja histonów z jąder komórek linii NIH 3T3 lub HeLa. Histony oczyszcza się z jąder komórkowych wykorzystując zdolność tych białek do rozpuszczania się w kwasach nieorganicznych, np. 0,25M HCl lub 0,2M H₂SO₄.

Materiały i odczynniki

1. Hodowla komórkowa fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa o gęstości komórek ok. 90% (sześć płytek Petriego/na dwa zespoły studentów)

2. Bufor PBS

137 mM NaCl

2,7 mM KCl

10 mM Na₂HPO₄

2 mM KH₂PO_4, pH 7,5

3. Bufor do izolacji jąder:

200 mM Tris-HCl, pH 7,5

100 mM NaCl

250 mM sacharoza

1 mM EDTA

0,5% Triton X-100

4. Bufor próbkowy do elektroforezy białek w żelu poliakrylamidowym
   SDS-PAGE (4x stężony)

5. 0,25 M HCl

6. Aceton (oziębiony)

7. PBS z 66% glicerolem

8. Zdrapywacz do komórek

9. Homogenizator szklano-teflonowy o pojemności 2 ml

10. Jałowe probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 i 2 ml oraz końcówki do pipet.

Wykonanie ćwiczenia

Otrzymywanie jąder z fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa

Uwaga! Poniższe czynności należy wykonywać w temp. +4⁰C

1. Trzy płytki Petriego z komórkami fibroblastów mysich o gęstości ok. 90% przenieść na lód i ściągnąć pipetą płyn hodowlany.

2. Zeskrobać komórki z płytek za pomocą specjalnego zdrapywacza do komórek, opłukać płytki dwa razy po 0,7 ml oziębionego PBS i przenieść zawiesinę komórek do probówki Eppendorfa o poj. 2 ml.

3. Komórki odwirować przy prędkości 1500 rpm przez 5 min. Supernatant odrzucić,
   a osad zawiesić w 2 ml buforu do izolacji jąder i inkubować 20 min. w lodzie.

4. Przenieść zawiesinę komórek do homogenizatora szklano-teflonowego
   i dezintegrować wykonując 40 ruchów teflonowym tłoczkiem (stopień dezintegracji można zweryfikować przy użyciu mikroskopu świetlnego).

5. Uzyskany dezintegrat komórek przenieść do probówki Eppendorfa o poj. 2 ml
   i odwirować przy prędkości 1500 rpm przez 10 min.

6. Supernatant (zawierający białka cytoplazmatyczne) przenieść do nowej probówki Eppendorfa, oznaczyć w nim stężenie białka metodą Bradford (przepis strona XX),
   a następnie przygotować próbki do elektroforezy SDS-PAGE zawierające po 15 μg
   i 30 μg białka (przepis strona XX). Gotowe próbki do analizy metodą SDS-PAGE przechowywać w temp. -20⁰C do kolejnych ćwiczeń.

7. Uzyskany osad jąder zawiesić, za pomocą homogenizatora szklano-teflonowego,
   w 2 ml buforu PBS.

8. Z kolejnych trzech płytek Petriego z komórkami fibroblastów mysich izolować jądra według powyższej procedury ale z zachowaniem warunków jałowych, zaś uzyskany osad jąder zawiesić, za pomocą homogenizatora szklano-teflonowego, w 2 ml buforu PBS z 66% glicerolem i przechowywać w temp. -20⁰C do kolejnych ćwiczeń.

Izolacja białek jądrowych

1. Do probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml przenieść 500 μl zawiesiny jąder i wirować przy prędkości 1500 rpm przez 10 min.

2. Supernatant odrzucić a osad jąder zawiesić w 100 μl buforu próbkowego
   do elektroforezy SDS-PAGE (1x stężony).

3. Próbki dokładnie wymieszać i inkubować w temp. 95⁰C przez 5 min.
   W wyniku uwolnienia DNA z jąder zawiesina przyjmuje galaretowatą konsystencję.

4. Po inkubacji próbki odwirować przy prędkości 6000 rpm przez 10 min. Supernatant zawierający białka jądrowe przenieść do nowej probówki Eppendorfa i zamrozić.

Izolacja histonów z użyciem 0,25 M HCl

1. Do probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml przenieść 500 μl zawiesiny jąder i wirować przy prędkości 1500 rpm przez 10 min.

2. Supernatant odrzucić, a osad jąder zawiesić w 50 μl 0,25 M HCl i dokładnie wymieszać.

3. Próbkę pozostawić w temp. pokojowej na 30 min. (ekstrakcja histonów),
   a następnie odwirować przy prędkości 1500 rpm przez 10 min.

4. Supernatant zawierający histony przenieść do nowej probówki Eppendorfa o poj.
   1,5 ml.

5. Do osadu dodać ponownie 50 μl 0,25 M HCl, dokładnie wymieszać i pozostawić
   na 30 min. w temp. pokojowej (ponowna ekstrakcja w celu zwiększenia wydajności).

6. Próbkę odwirować przy prędkości 1500 rpm przez 10 min.

7. Uzyskane supernatanty, zawierające histony, połączyć.

8. Wytrącać histony z supernatantu przez dodanie 8 objętości (0,8 ml) oziębionego acetonu. Całość pozostawić do kolejnych ćwiczeń (minimum na 24 godziny)
   w temp. -20^OC.

Analiza składu białkowego chromatyny

Ćwiczenie ma na celu dokonanie analizy białek jądrowych techniką elektroforezy jednokierunkowej w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących SDS-PAGE (metoda Laemmli'ego).

Materiały i odczynniki

1. Aceton (oziębiony)

2. Odczynniki i zestaw do elektroforezy SDS-PAGE (patrz strona _)

3. Preparaty białek jądrowych, cytoplazmatycznych i histonów otrzymane na poprzednim
   ćwiczeniu

Wykonanie ćwiczenia

1. Przygotować 13,8 % żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach denaturujących według przepisu na stronie _.

2. Próbki z wytrąconymi histonami odwirować przy prędkości 10000 rpm przez 15 min. w 4⁰C w celu otrzymania osadu białek histonowych. Następnie osad trzykrotnie przemyć 1 ml oziębionego acetonu i wysuszyć na powietrzu. Osad białek histonowych zawiesić w 40 μl buforu próbkowego do elektroforezy SDS-PAGE
   (1x stężony).

3. Próbki zawierające wszystkie białka jądrowe, wyizolowane histony oraz białka cytoplazmatyczne zawieszone w buforze próbkowym do elektroforezy SDS-PAGE ogrzewać przez 3 min. w temp. 90⁰C. Bezpośrednio po ogrzaniu nanosić na żel po
   40 μl przygotowanych próbek. Rozdział prowadzić pod napięciem 150V, tak długo, aż barwnik przesunie się do końca żelu separującego. Po rozdziale białka wybarwić błękitem Coomassie (patrz strona _).

Interpretacja wyników

1. Porównać skład białkowy preparatów poddawanych elektroforezie.

2. Określić masy cząsteczkowe białek histonowych.

Trawienie DNA chromatyny nukleazą ze Staphylococcus aureus

Nukleaza ze Staphylococcus aureus (MN-aza, nukleaza mikrokokowa) jest stosunkowo niespecyficzną endonukleazą, która tnie zarówno jedno- jak i dwuniciowe kwasy nukleinowe, chociaż bardziej aktywna jest wobec substratów jednoniciowych. Cięcie DNA lub RNA następuje preferencyjnie w regionach bogatych w AT lub AU. Zmieszana
z chromatyną MN-aza tnie fragmenty DNA, które nie są chronione przez związanie
z białkami. Dlatego też w wyniku działania MN-azy na chromatynę otrzymuje się szereg fragmentów odpowiadających mono- i oligonukleosomom. Enzym wykazuje swoją aktywność w obecności jonów Ca²⁺. Reakcję trawienia chromatyny przez MN-azę można zatrzymać stosując odpowiednie stężenie EGTA lub EDTA, które działając jako chelatory jonów dwuwartościowych, hamują aktywność enzymu.

Ćwiczenie ma na celu otrzymanie mieszaniny oligonukleosomów w wyniku trawienia chromatyny jąder fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa przez niespecyficzną endonukleazę ze Staphylococcus aureus.

Materiały i odczynniki

1. Zawiesina jąder fibroblastów mysich lub komórek HeLa w PBS z 66% glicerolem

2. Bufor do cięcia MN-azą:

20 mM boran sodu, pH 8,8

5 mM CaCl₂

3. Roztwór MN-azy w H₂O (300 u/µl). Bezpośrednio przed ćwiczeniami rozcieńczyć MN-azę 240-krotnie (1 µl roztworu MN-azy dodać do 239 H₂O µl). Uzyskuje się końcowe stężenie 1,25 u/µl

4. 100 mM EDTA

5. 10% SDS

6. Pronaza E - roztwór w H₂O o stężeniu 25 mg/ml

7. Fenol, pH 7,5- 8,0

8. Chloroform

9. 5 M NaCl

10. 96% etanol (oziębiony)

11. 70% etanol (oziębiony)

12. Jałowe probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 i 2 ml oraz końcówki do pipet.

Wykonanie ćwiczenia

Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków jałowych. Pracę z fenolem wykonywać w rękawicach ochronnych.

1. Do probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml przenieść 1 ml zawiesiny jąder i dodać 0,5 ml buforu do cięcia MN-azą.

2. Zawiesinę wymieszać i odwirować przy prędkości 5000 rpm przez 5 min. w celu uzyskania osadu jąder.

3. Supernatant odrzucić, a osad jąder zawiesić ponownie w 1 ml buforu do cięcia
   MN-azą.

4. Dodać 5 µl przygotowanego roztworu MN-azy (6,25u) i wymieszać zawartość probówki.

5. Bezpośrednio po dodaniu enzymu przenieść 300 µl mieszaniny do nowej probówki Eppendorfa o poj. 1,5 zawierającej 30 µl oziębionego 100 mM EDTA (czas
   trawienia 0).

6. Pozostałą część mieszaniny inkubować w temp. 37^oC. Po upływie 5 i 10 min. (licząc od czasu 0) inkubacji, przenosić po 300 µl mieszaniny do nowych probówek Eppendorfa zawierających po 30 µl oziębionego 100 mM EDTA.

7. Do tak otrzymanych próbek dodać po 5 µl 10% SDS i 3 µl roztworu pronazy.

8. Inkubować próbki przez 30 min. w temp. 37^oC (trawienie białek jądrowych). Reakcję zatrzymać przez dodanie 34 µl 10% SDS.

9. Do każdej probówki dodać po 400 µl fenolu i wytrząsać całość przez 10 min. (ekstrakcja DNA) po czym odwirować przez 5 min. (jeśli nie zaznaczono inaczej wszystkie wirowania wykonywać przy 10000 rpm w 4⁰C) w celu rozdzielenia faz.

10. Górne fazy wodne przenieść do nowych probówek Eppendorfa, dodać po 400 μl chloroformu i wytrząsać przez 5 min. (usuwanie resztek fenolu), a potem odwirować przez 5 min.

11. Górne fazy wodne przenieść do nowych probówek Eppendorfa i dodać po 6 μl 5M NaCl oraz 800 μl oziębionego 96% etanolu. Próbki pozostawić w temp. -20^oC, w celu precypitacji DNA, do kolejnych ćwiczeń.

Elektroforetyczna analiza DNA po trawieniu nukleazą
ze Staphylococcus aureus

Ćwiczenie ma na celu dokonanie analizy otrzymanych na poprzednich ćwiczeniach preparatów DNA techniką elektroforezy w żelu agarozowym.

Materiały i odczynniki

1. Odczynniki i zestaw do elektroforezy kwasów nukleinowych (patrz strona _)

2. Bufor próbkowy do elektroforezy DNA

3. Preparaty DNA otrzymane w trakcie poprzednich ćwiczeń.

Wykonanie ćwiczenia

1. Wytrącony na poprzednich ćwiczeniach DNA odwirować przy prędkości 10000 rpm przez 15 min. w 4⁰C. Uzyskany osad DNA przemyć 0,5 ml oziębionego 70% etanolu, po czym odwirować przez 5 min. i wysuszyć na powietrzu.

2. Osad DNA rozpuścić w 30 μl buforu próbkowego do elektroforezy DNA.

3. Przygotować 50 ml 1% roztworu agarozy w buforze TAE według przepisu na stronie _.

4. Na żel nanosić po 5-30 μl próbek DNA. Rozdział fragmentów DNA prowadzić przy napięciu 100V dopóki czoło barwnika nie dotrze do 3/4 długości żelu. Po zakończonej elektroforezie obserwować rozdzielone fragmenty DNA pod lampą UV. Obrazem trawienia powinna być „drabinka” prążków, które odpowiadają fragmentom DNA stanowiącym wielokrotność około 200 par zasad.

Interpretacja wyników

1. Porównać obraz elektroforetyczny DNA przed i po trawieniu MN-azą.

2. Określić wielkość fragmentów DNA otrzymanych w wyniku działania MN-azy.

Izolacja RNA z komórek drożdży

Uzyskanie wysokiej jakości RNA jest pierwszym i często krytycznym etapem wielu zasadniczych eksperymentów w biologii molekularnej m. in. analizy „Northern”, RT-PCR, badaniu ochrony przed nukleazami, translacji in vitro, mapowania RNA, konstrukcji bibliotek cDNA. W izolacji RNA duże znaczenie ma szybkość przeprowadzania procedury oczyszczania i kontrolowanie aktywności rybonukleaz komórkowych, które mogą doprowadzić do szybkiej degradacji RNA. Dlatego też podczas izolacji RNA wszystkie odczynniki należy przygotowywać z użyciem wody traktowanej 0,1% pirowęglanem dietylu (DEPC), który jest silnym inhibitorem RNaz, ponadto trzeba stosować jednorazowy sterylny sprzęt laboratoryjny wykonany z tworzyw sztucznych, który jest wolny od RNaz, a sprzęt wielokrotnego użytku umieszczać w 0,1% roztworze DEPC lub 3% roztworze H₂O_2, po czym przepłukać wodą traktowaną DEPC.

Opracowano szereg metod pozwalających na wyizolowanie czystych
i niezdegradowanych preparatów kwasów nukleinowych o pełnej aktywności biologicznej. Jedną z nich jest ekstrakcja fenolowa. W podanej procedurze, całe nienaruszone komórki drożdży poddawane są ekstrakcji fenolowej podczas, której RNA „przechodzi” do tzw. fazy wodnej. DNA jako substancja wielkocząsteczkowa pozostaje w fazie fenolowej, w której obok DNA znajdują się inne składniki komórkowe stanowiące razem nierozpuszczalną frakcję komórkową.

Materiały i odczynniki

Uwaga! Wszystkie roztwory należy przygotować z użyciem wody traktowanej DEPC.

1. Hodowla S. cerevisiae OD₆₀₀ = 2 (100 ml)

2. H₂O (DEPC, oziębiona)

3. Bufor do zawieszania komórek drożdży ( bufor AE):

50mM CH₃COONa, pH 5,3

10 mM EDTA

4. 10% SDS

5. Kwaśny fenol (stały fenol nasycony wodą a następnie buforem AE )
   z 0,1% hydroksychinoliną. Przechowywać w ciemności w 4⁰C.

6. Mieszanina chloroform - alkohol izoamylowy (24:1)

7. 3 M CH₃COONa, pH 5,3

8. 100% etanol (oziębiony)

9. 70% etanol (oziębiony)

10. 2M LiCl - 0,1M CH₃COONa, pH 5,3

11. Jałowe probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml i 2 ml oraz końcówki do pipet.

Wykonanie ćwiczenia

Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków jałowych. Pracę z fenolem wykonywać w rękawicach ochronnych.

1. Hodowlę drożdży odwirować w probówkach Eppendorfa o poj. 2 ml przez 5 min. przy 1500 rpm w 4⁰C tak, aby w każdej probówce otrzymać osad komórek drożdży pochodzący z 4 ml hodowli. Supernatant odrzucić, a osad komórek drożdży zawiesić w 1 ml oziębionej H₂O, po czym odwirować przez 5 min. przy 1500 rpm w 4⁰C (na tym etapie osad komórek drożdży można zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w -80⁰C). Na wykonanie poniższej procedury potrzebny jest osad komórek drożdży w dwóch probówkach.

2. Osad komórek drożdży w każdej probówce zawiesić w 400 μl buforu AE, dodać po
   40 μl 10% SDS i wytrząsać przez 1 min.

3. Dodać do każdej probówki po 440 μl kwaśnego fenolu i wytrząsać całość przez 5 min. po czym inkubować przez 15 min. w 65⁰C (wytrząsając co 5 min.).

4. Po inkubacji probówki oziębić przez 5 min. w lodzie, a następnie odwirować przez
   5 min. (jeśli nie zaznaczono inaczej wszystkie wirowania wykonywać przy
   10000 rpm w 4⁰C) w celu rozdzielenia faz.

5. Górne fazy wodne przenieść do nowych probówek Eppendorfa o poj. 1,5 ml, ponownie dodać po 400 μl kwaśnego fenolu i wytrząsać przez 5 min. po czym odwirować przez 5 min.

6. Górne fazy wodne przenieść do nowych probówek Eppendorfa o poj. 1,5 ml, dodać po 400 μl mieszaniny chloroform : alkohol izoamylowy (usuwanie resztek fenolu)
   i wytrząsać przez 5 min. a potem odwirować przez 5 min.

7. Górne fazy wodne przenieść do nowych probówek Eppendorfa o poj. 1,5 ml, dodać po 40 μl 3M octanu sodu, pH 5,3 oraz 1 ml oziębionego 100% etanolu.

8. Próbki pozostawić w temp. -20⁰C na 30 min. lub na noc w celu precypitacji RNA. Następnie precypitat RNA odwirować przez 15 min. Uzyskany osad przemyć 1 ml oziębionego 70% etanolu i powtórnie odwirować przez 5 min.

9. Osad z jednej probówki wysuszyć na powietrzu (kilka minut do odparowania etanolu, nie dopuszczając do całkowitego wyschnięcia osadu) a następnie rozpuścić w 20 μl wody i pozostawić w temp. -70⁰C do analizy elektroforetycznej (surowy preparat RNA).

10. Osad z drugiej probówki rozpuścić w 1 ml roztworu 2M chlorku litu z 0,1M octanem sodu o pH 5,3 i mieszać przez 15 min.

11. Odwirować próbkę przez 15 min. i delikatnie usunąć, przy pomocy pipety, supernatant. Uzyskany po wirowaniu osad to rRNA, który należy wysuszyć,
    a następnie zawiesić w 20 μl wody i pozostawić w temp. -70⁰C do analizy elektroforetycznej.

Elektroforetyczna analiza RNA

Ćwiczenie ma na celu dokonanie analizy otrzymanych na poprzednich ćwiczeniach preparatów RNA techniką elektroforezy w żelu agarozowym.

Materiały i odczynniki

1. Odczynniki i zestaw do elektroforezy kwasów nukleinowych (patrz strona _)

2. Preparaty RNA otrzymane w trakcie poprzednich ćwiczeń.

Wykonanie ćwiczenia

Przygotować 50 ml 1% roztworu agarozy w buforze TAE według przepisu na stronie _.

Do próbek RNA zawieszonych w wodzie dodać równą objętość buforu próbkowego do elektroforezy RNA. Na żel nanosić po 5-30 μl próbek RNA. Rozdział prowadzić przy napięciu 100V dopóki czoło barwnika nie dotrze do 3/4 długości żelu. Po zakończonej elektroforezie obserwować rozdzielone RNA pod lampą UV.

Interpretacja wyników

1. Porównać skład preparatów poddawanych elektroforezie.

2. Określić masy cząsteczkowe rozdzielonych cząsteczek RNA.

Translacja w warunkach in vivo w komórkach bakteryjnych
i drożdżowych

Zdolność precyzyjnej translacji mRNA na białko jest jedną z podstawowych cech życia na Ziemi. Chociaż aparat translacyjny wykazuje znaczne podobieństwa między organizmami to jednak w toku ewolucji wykształciły się subtelne różnice w mechanizmie biosyntezy białka u prokariontów i eukariontów. Te różnice wykorzystano w medycynie, gdyż wiele związków selektywnie hamujących proces translacji u bakterii należy do najbardziej skutecznych antybiotyków stosowanych przez człowieka.

Celem ćwiczenia jest zbadanie wpływu chloramfenikolu, cykloheksimidu
i puromycyny na biosyntezę białka w warunkach in vivo w komórkach bakterii E. coli
i drożdzy S. cerevisiae. Chloramfenikol i cykloheksimid są inhibitorami aktywności peptydylotransferazy, odpowiednio rybosomów bakteryjnych i eukariotycznych, zaś puromycyna jest strukturalnym analogiem aminoacylo-tRNA i powoduje przedwczesną terminację syntezy białka.

Materiały i odczynniki

1. 18-godzinna hodowla bakterii E. coli w podłożu M9 (20 ml)

2. 18-godzinna hodowla drożdży S. cerevisiae w podłożu SD (20 ml)

3. Podłoże M9 i SD

4. Chloramfenikol (10 mg/ml w 96% etanolu)

5. Cykloheksimid (10 mg/ml w H₂O)

6. Puromycyna (10 mg/ml w H₂O)

7. [³⁵S]-metionina

8. Wysuszone krążki bibuły Whatman 3MM o średnicy 2,0 cm, moczone uprzednio przez dobę w roztworze 0,5M NaCl z dodatkiem 1 mg/ml nie znakowanej metioniny

9. TCA 5% i 10%

10. Płyn scyntylacyjny

Wykonanie ćwiczenia

1. Zmierzyć gęstość optyczną całonocnych hodowli drożdży przy długości fali 600 nm (OD₆₀₀). Pomiar wykonać względem próby kontrolnej (pożywka SD). Jeśli zaistnieje konieczność, (tzn. wielkość OD przekracza 1), należy próbkę hodowli rozcieńczyć,
   a następnie uwzględnić to przy obliczaniu jej gęstości. Znając gęstość optyczną hodowli drożdży, przygotować 5 ml hodowli rozcieńczonej pożywką SD,
   do OD₆₀₀ = 0,4.

2. Tak przygotowaną hodowlę rozlać, po 1 ml, do czterech probówek. Następnie do jednej z probówek hodowli dodać 200 µg cykloheksimidu, do drugiej 200 µg puromycyny, do trzeciej 200 µg chloramfenikolu, a czwartą pozostawić jako kontrolę. Zawartość probówek dokładnie wymieszać i inkubować w temp. 30⁰C przez
   20 min.

3. Do wszystkich probówek dodać znakowaną metioninę w ilości 10 µCi/ml
   i wymieszać. Bezpośrednio po dodaniu metioniny z probówek pobrać po 50 µl hodowli i nanieść na przygotowane wcześniej krążki bibuły Whatman 3MM moczone w roztworze metioniny (czas 0). Identyczne próbki hodowli pobierać po 15, 30, 45
   i 60 min. inkubacji.

4. Krążki wysuszyć pod lampą, przenieść do 10% TCA (ok. 200 ml) i ogrzewać w temp. 85⁰C przez 20 min.

5. Przenieść krążki do naczynia z 5% TCA (ok. 200 ml) i mieszać przez 15 min, po czym wysuszyć pod lampą.

6. Suche krążki umieścić w naczynkach scyntylacyjnych zawierających po 5 ml płynu scyntylacyjnego i liczyć radioaktywne piętno pochodzące od wbudowanej do białek [³⁵S]-metioniny przy użyciu licznika scyntylacyjnego.

7. Identyczne doświadczenie wykonać z bakteriami E. coli, zachowując temperaturę inkubacji 37⁰C.

Interpretacja wyników

1. Porównać poziom inkorporacji [³⁵S]-metioniny w hodowli bakteryjnej i drożdżowej
   w zależności od czasu inkubacji i obecności antybiotyków. Wyniki przedstawić
   w formie wykresu, odkładając na osi X czas inkubacji, a na osi Y poziom inkorporacji [³⁵S]-metioniny (w imp/min.)

Badanie wpływu inhibitorów translacji na wzrost komórek drożdżowych

Rybosom jest miejscem działania wielu chemicznie zróżnicowanych antybiotyków, które wiążą się ze specyficznymi fragmentami tego rybonukleoproteinowego kompleksu, wpływając w ten sposób na syntezę białka i wzrost komórek. Mutacje w niektórych białkach rybosomowych mogą powodować zmianę wrażliwości komórek na inhibitory translacji.

Celem ćwiczenia jest przebadanie wpływu cykloheksimidu, anizomycyny, higromycyny B i paromomycyny na wzrost komórek mutantów drożdżowych pozbawionych rybosomowych białek P.

Anizomycyna i cykloheksimid są inhibitorami aktywności peptydylotransferazy
w podjednostce 60S rybosomów eukariotycznych. Z kolei higromycyna B i paromomycyna należą do antybiotyków aminoglikozydowych, działających zarówno na komórki bakteryjne jak i eukariotyczne, które wiążą się z rRNA małej podjednostki rybosomowej. Poprzez oddziaływanie z miejscem A na rybosomie aminoglikozydy zwiększają częstotliwość błędów w odczytywaniu mRNA. Ponadto higromycyna B hamuje etap translokacji podczas biosyntezy białka.

Materiały i odczynniki

1. Całonocne hodowle drożdży S. cerevisiae - po 20 ml
   (cztery szczepy wskazane przez prowadzącego ćwiczenia)

2. Podłoże YPD oraz YPD z 2% agarem

3. Roztwór higromycyny B (15 mg/ml w H₂O)

4. Roztwór paromomycyny (250 mg/ml w H₂O)

5. Roztwór anizomycyny (3 mg/ml w roztworze wodnym o pH ≤ 5)

6. Roztwór cykloheksimidu (0,25 mg/ml w H₂O)

7. Jałowe płytki Petriego

8. Jałowe probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml i końcówki do pipet

9. Jałowe krążki bibuły Whatman 3MM o średnicy 6 mm.

Wykonanie ćwiczenia

Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków jałowych

1. Na cztery jałowe płytki Petriego wylać po 15 ml podłoża YPD z agarem i pozostawić do zastygnięcia.

2. Zmierzyć gęstość optyczną całonocnych hodowli drożdży przy długości fali 600 nm (OD₆₀₀). Pomiar wykonać względem próby kontrolnej (podłoże YPD). Jeśli zaistnieje konieczność, (tzn. wielkość OD przekracza 1), należy próbkę hodowli rozcieńczyć,
   a następnie uwzględnić to przy obliczaniu jej gęstości. Znając gęstość optyczną hodowli drożdży przygotować 1 ml hodowli rozcieńczonej pożywką YPD,
   do OD₆₀₀ = 1,0.

3. Rozprowadzić po 100 μl tak rozcieńczonych hodowli na przygotowane wcześniej płytki Petriego ze stałym podłożem YPD.

4. Na płytki nanieść po cztery jałowe krążki bibuły Whatman 3MM i nakroplić na nie
   po 10 μl roztworów paromomycyny, higromycyny B, anizomycyny i cykloheksimidu. Po dwóch dniach inkubacji w temperaturze 30⁰C zmierzyć średnice stref zahamowania wzrostu komórek drożdży wokół krążków bibuły nasączonych roztworami antybiotyków.

Interpretacja wyników

Porównać wpływ antybiotyków na wzrost poszczególnych szczepów drożdżowych

Otrzymywanie rybosomów i frakcji cytoplazmatycznej drożdży Saccharomyces cerevisiae

Frakcjonowanie komórek to metoda rozdzielania struktur subkomórkowych polegająca na wstępnej dezintegracji oraz poddaniu homogenatu wirowaniu różnicowemu (kilkukrotnemu wirowaniu ze stopniowo wzrastającą siłą odśrodkową) albo wirowaniu
w gradiencie sacharozy czy chlorku cezu (poszczególne struktury subkomórkowe osadzają się w roztworze o różnej gęstości).

Celem ćwiczenia jest izolacja mikrosomów i frakcji cytoplazmatycznej oraz oczyszczenie rybosomów z drożdży S. cerevisiae techniką wirowania różnicowego. Mikrosomy są pęcherzykami, powstającymi z samozasklepiających się fragmentów gładkiego lub szorstkiego retikulum endoplazmatycznego. W celu uwolnienia rybosomów od błon retikulum endoplazmatycznego stosuje się bufor z dodatkem 1% niejonowego detergentu jakim jest Triton X-100. Tak traktowane rybosomy (tzw. rybosomy surowe) zawierają zasocjowane z nimi białka cytoplazmatyczne, które można usunąć z powierzchni rybosomów za pomocą zbuforowanych roztworów o wysokim stężeniu soli.

Materiały i odczynniki

1. Osad zamrożonych komórek drożdży S. cerevisiae

2. Korund

3. 2 M Tris

4. 10% roztwór Tritonu X-100 w buforze A

5. Bufor A (do dezintegracji)

50 mM Tris-HCl, pH 7,5

80 mM KCl

12,5 mM MgCl₂

0,5 mM EDTA

1 mM PMSF

6 mM β- MET

6. Bufor B (do zawieszania rybosomów)

50% glicerol

50 mM Tris-HCl, pH 7,5

80 mM KCl

10 mM MgCl₂

0,5 mM EDTA

5 mM DTT

7. Bufor A z dodatkiem 0,5 M KCl

8. 30% sacharoza w buforze A z dodatkiem 0,5 M KCl

9. Stały siarczan amonu

10. Bufor C (do preparatyki kinaz białkowych)

50 mM Tris - HCl, pH 7,5

0,5 mM EDTA

6 mM β- MET

0,5 mM PMSF

11. Bufor C z dodatkiem 50% glicerolu

12. Wąż dializacyjny

Wykonanie ćwiczenia

Uwaga! Poniższe czynności należy wykonywać w temp. 4⁰C

Dezintegracja komórek drożdży i otrzymywanie ekstraktu bezkomórkowego

1. Komórki drożdżowe dezintegrować, ucierając je z korundem w moździerzu porcelanowym przez około 30 min. Korund dodawać stopniowo w ilości wagowej
   3 -krotnie większej od masy komórek. Podczas dezintegracji utrzymywać wartość pH w zakresie 7,2 - 7,5 poprzez dodawanie 2 M Trisu (niebuforowanego).

2. Uzyskany dezintegrat drożdży zawiesić w buforze A i wirować przy 3000 rpm przez 10 min. celem osadzenia korundu i resztek komórek.

3. Uzyskany supernatant wirować przy 30000 x g w ciągu 20 min. aby osadzić struktury subkomórkowe (mitochondria, jądra, ściany komórkowe).

4. Tak otrzymany ekstrakt komórkowy (tzw. frakcja S30) podzielić na dwie części. Do jednej części, przy stałym mieszaniu, dodać 10% Tritonu X-100 tak, aby jego końcowe stężenie wynosiło 1%, po czym ekstrakt mieszać jeszcze przez 15 min. Drugą część ekstraktu przechowywać w tym czasie w temp. 4⁰C.

5. Obie części wirować przy 100000 x g przez 1,5 godz. W wyniku wirowania otrzymuje się frakcję cytoplazmatyczną, tzw. frakcję S100 i frakcję mikrosomalną
   (z części nietraktowanej Tritonem X-100) oraz rybosomy surowe (z części traktowanej Tritonem X-100).

6. Osad stanowiący frakcję mikrosomalną oraz połowę osadu rybosomów surowych zawiesić w buforze B (za pomocą homogenizatora szklano-teflonoego), oznaczyć stężenie rybosomów (przepis - strona XX) i przechowywać do kolejnych ćwiczeń
   w temp. -20⁰ C.

Oczyszczanie rybosomów

1. Pozostałą część osadu rybosomów surowych zawiesić w buforze A z dodatkiem 0,5 M KCl i mieszać w homogenizatorze szklanym przez 15 min. i ponownie osadzić przez wirowanie przy 100000 x g przez 1,5 godz. Czynność tę wykonać dwukrotnie.

2. Uzyskany preparat rybosomów ponownie zawiesić w buforze A z 0,5 M KCl
   i wirować przez 1cm warstwę zbuforowanego roztworu sacharozy (30% sacharoza
   w buforze A z dodatkiem 0,5 M KCl) przy 100000 x g przez 3 godz. Po osadzeniu, rybosomy zawiesić w buforze B, oznaczyć ich stężenie (przepis - strona XX)
   i przechowywać do kolejnych ćwiczeń w temp. -20⁰ C.

Wysalanie białek z frakcji cytoplazmatycznej

1. Białka z frakcji cytoplazmatycznej wytrącać stałym siarczanem amonu przy wysyceniu 0-55% (tabela frakcjonowania siarczanem amonu - strona XX). Siarczan amonu dodawać stopniowo mieszając przez 1 godzinę. Zawiesinę odwirować przy 12000 rpm przez 20 min.

2. Osad wytrąconych białek rozpuścić w buforze C i poddać dializie (przepis - strona XX) wobec buforu C z dodatkiem 50% glicerolu. Po zakończeniu dializy roztwór białek cytoplazmatycznych przechowywać w temp. -20⁰ C.

Izolacja kwaśnych białek rybosomowych z drożdży

Większość białek rybosomowych stanowią małe białka o charakterze zasadowym, których punkt izoelektryczny oscyluje w pobliżu pH 8,5 lub wyższym. Duża podjednostka rybosomów zawiera jednak grupę powierzchniowych białek kwaśnych, tworzących charakterystyczną strukturę zwaną „kciukiem”, który oddziałuje z czynnikami translacyjnymi podczas syntezy białka. U bakterii kwaśne białka rybosomowe tworzą pentameryczny lub heptameryczny kompleks, złożony, odpowiednio, z dwóch lub trzech dimerów białka L12 oraz pojedynczej cząsteczki białka L10. U Escherichia coli białko L12 nazywane jest L7/L12. Różnica między L7 i L12 polega na potranslacyjnej acetylacji na N-końcu polipeptydu L7. Białko L7/L12 E. coli złożone ze 120 aminokwasów i posiada masę cząsteczkową 12,2 kDa. Eukariotyczne białka kwaśne noszą nazwę białek P, ze względu na ich fosforylacyjną modyfikację. Białka te podzielono na dwie grupy. Jedną z nich stanowią dwa małe białka P1
i P2 o masie 11 kDa i pI równym 3,0-3,5, będące funkcjonalnymi odpowiednikami bakteryjnego białka L12. U niższych eukariontów takich jak drożdże stwierdzono obecność czterech białek P1/P2. Kwaśne białka drożdży S. cerevisiae nazwano P1A, P1B, P2A i P2B. Ponadto u roślin zidentyfikowano dodatkowo białko P3. Drugą grupę białek P stanowi pojedyncze białko P0 o masie ok. 34 kDa, będące odpowiednikiem bakteryjnego białka L10. Na rybosomie białka P tworzą pentameryczny kompleks P0-(P1-P2)₂, który wiąże się, poprzez N-końcowy fragment białka P0, do wysoce konserwatywnego regionu 25S/28S rRNA, zwanego centrum GTPazowym. U S. cerevisiae białka z grupy P1/P2 tworzą preferencyjnie dwa heterodimery P1A-P2B i P1B-P2A w których N-końcowe fragmenty białek są odpowiedzialne za dimeryzację i interakcje z białkiem P0, zaś karboksylowe końce są wolne i oddziałują z czynnikami translacyjnymi takimi jak EF-2.

Białka z grupy P1/P2 nie są niezbędne dla aktywności translacyjnej rybosomu, natomiast białko P0 jest stabilnym białkiem rdzenia rybosomowego i jest konieczne dla jego funkcjonowania. Delecja genu dla P0 prowadzi do śmierci komórki. Wszystkie białka P charakteryzują się niezwykle konserwatywną C-końcową domeną, zawierającą resztę seryny ulegającą fosforylacyjnej modyfikacji oraz stanowiącą antygen, przeciwko któremu skierowane są przeciwciała u ludzi cierpiących na niektóre choroby autoimmunologiczne (układowy toczeń trzewny) i infekcyjne (choroba serca Chagasa, leiszmanioza).

W odróżnieniu od pozostałych składników rybosomu kwaśne białka rybosomowe, zarówno bakteryjne jak i eukariotyczne, występują w postaci wolnej w cytoplazmie.
U organizmów eukariotycznych, w przeciwieństwie do bakterii, odbywa się ponadto wymiana tych białek między rybosomem a pulą cytoplazmatyczną.

Materiały i odczynniki

1. Oczyszczone rybosomy drożdżowe o stężeniu 20 mg/ml

2. Bufor do ekstrakcji kwaśnych białek rybosomowych

20 mM Tris-HCl, pH 7,5

40 mM MgCl₂

6 mM β- MET

1 M NH₄Cl

3. 96% etanol (oziębiony)

4. Aceton (oziębiony)

5. 25 mM Tris-HCl, pH 7,5

6. Odczynnik Bradford

Wykonanie ćwiczenia

1. Kwaśne białka rybosomowe ekstrahować z 2 mg rybosomów oczyszczonych
   S. cerevisiae o stężeniu 20 mg/ml. Do zawiesiny rybosomów (1 objętość) dodać 1 objętość buforu do ekstrakcji białek kwaśnych i pozostawić na 5 min. w lodzie.

2. Dodać 1 objętość 96% etanolu (oziębionego) i pozostawić na 10 min. w lodzie.

3. Powtórzyć punkt 2.

4. Odwirować przy 10000 rpm przez 15 min. w celu osadzenia cząstek rdzeniowych rybosomów ( tj. rybosomów zawierających białka, które nie zostały wyekstrahowane).

5. Supernatant zawierający kwaśne białka rybosomowe przenieść do nowej probówki Eppendorfa, dodać trzykrotną objętość oziębionego acetonu (w celu wytrącenia białek z supernatantu) i pozostawić w temp. -20⁰ C przez co najmniej 24 godz.

6. Wytrącone białka osadzić drogą wirowania przy 10000 rpm przez 15 min., po czym supernatant odrzucić, a osad kwaśnych białek rybosomowych wysuszyć na powietrzu
   i zawiesić w 50 µl 25 mM Trisu - HCl, pH 7,5.

7. Oznaczyć stężenie białka metodą Bradford (przepis - strona XX)

Analiza elektroforetyczna białek rybosomowych

Ćwiczenie ma na celu dokonanie analizy białek rybosomowych techniką elektroforezy jednokierunkowej w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących SDS-PAGE (metoda Laemmli'ego).

Materiały i odczynniki

1. Odczynniki i zestaw do elektroforezy SDS-PAGE (patrz strona XX)

2. Preparaty mikrosomów, rybosomów surowych i oczyszczonych oraz białek P otrzymane na poprzednich ćwiczeniach

Wykonanie ćwiczenia

1. Przygotować 13,8 % żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach denaturujących według przepisu na stronie XX.

2. Przygotować po dwie próbki zawierające: a) 50 μg mikrosomów, b) 50 μg rybosomów surowych, c) 50 μg rybosomów oczyszczonych, d) 10-20 μg białek P, e) wzorce białkowe, według przepisu na stronie XX.

3. Próbki białkowe zawieszone w buforze próbkowym SDS/PAGE nanieść na żel poliakrylamidowy. Rozdział prowadzić pod napięciem 150V tak długo, aż barwnik przesunie się do końca żelu separującego. Po rozdziale, żel poliakrylamidowy przeciąć na pół. Jedną część żelu wybarwić błękitem Coomassie (przepis strona XX) a drugą srebrem (przepis strona XX).

Interpretacja wyników

1. Porównać skład białkowy preparatów poddawanych elektroforezie.

2. Określić masy cząsteczkowe białek P.

3. Porównać czułość obu metod barwienia białek w żelu poliakrylamidowym.

Izolacja kinaz białkowych z drożdży Saccharomyces cerevisiae

Kinazy białkowe uczestniczą w regulacji wielu procesów metabolicznych, biorą udział w transmisji sygnałów przez błony, regulują procesy wzrostu i różnicowania się komórek.

Oczyszczanie enzymów jest stosowane w badaniach ich struktury i funkcji. W tym celu stosuje się metody chromatografii jonowymiennej, chromatografii powinowactwa
i sączenia molekularnego, w których wykorzystuje się takie cechy białek enzymatycznych jak: wielkość, ładunek, powinowactwo wiązania do nośników. Poniżej podana jest jedna z metod oczyszczania białek przez rozdział w procesie chromatografii jonowymiennej (ang. ion exchange chromatography - IEC). Rozdział białek w technice IEC polega na odwracalnej adsorpcji obdarzonych ładunkiem elektrycznym makromolekuł na nośniku jonowymiennym (jonowymieniaczu). Jonowymieniacz to złoże chromatograficzne z unieruchomionymi na powierzchni polarnymi cząsteczkami posiadającymi ładunek elektryczny określonego znaku. W zależności od tego jakie jony wiąże jonowymieniacz, mówimy o anionowymieniaczu (anionicie) - wiążącym aniony lub o kationowymieniaczu (kationicie) - wiążącym kationy.

Celem ćwiczenia jest oczyszczenie kinaz białkowych PKA i CK2 z frakcji cytoplazmatycznej komórek drożdży na DEAE-celulozie (anionit) i P-11 celulozie (kationit).

Materiały i odczynniki

1. Supernatant postrybosomalny z drożdży S. cerevisiae

2. DEAE-celuloza (DE-52) i P-11 celuloza wyrównoważone w buforze do preparatyki kinaz białkowych

3. Bufor C (do preparatyki kinaz białkowych)

4. 0,2 M NaCl w buforze C

5. 0,4 M NaCl w buforze C

6. 0,7 M NaCl w buforze C

7. Bufor C z dodatkiem 50% glicerolu

8. Wąż dializacyjny

Wykonanie ćwiczenia

Chromatografia na DEAE-celulozie

1. Do 5 ml celulozy dodać odpowiednią ilość wysolonej na wcześniejszych ćwiczeniach frakcji cytoplazmatycznej, przyjmując, że 1 ml DE-52 wiąże 5 mg białka.

2. Delikatnie mieszać przez 10 min., a następnie dodać 5 ml buforu C, zamieszać, odwirować (jeśli nie zaznaczono inaczej wszystkie wirowania wykonywać przy 3000 rpm przez 5 min. w 4⁰C) i zebrać supernatant (frakcja 1 - zawierająca białka niewiążące się do DE-52),

3. Do DE-52 dodać 50 ml 0,2 M NaCl w buforze C, zamieszać, odwirować i odrzucić supernatant.

4. Powtórzyć pkt 3.

5. Do DE-52 dodać 5 ml 0,4 M NaCl (w celu elucji białek związanych z DE-52), mieszać przez 10 min. i po odwirowaniu zebrać supernatant (frakcja 2).

Oczyszczanie PKA na P-11 celulozie

1. Supernatant zawierający białka niewiążące się do DE-52 (frakcja 1) dodać do 5 ml P-11 celulozy, delikatnie mieszać przez 10 min. po czym odwirować i supernatant odrzucić.

2. Do P-11 celulozy dodać 50 ml buforu C, zamieszać, odwirować i odrzucić supernatant.

3. Powtórzyć pkt 2.

4. Następnie do P-11 celulozy dodać 5 ml 0,2 M NaCl w buforze C, mieszać przez 10 min. po czym odwirować i zebrać supernatant zawierający aktywność kinazy białkowej A.

5. Zebrany supernatant poddać dializie (przepis - strona XX) wobec buforu C z dodatkiem 50% glicerolu. Po zakończeniu dializy roztwór przechowywać w temp.
   -20⁰ C.

Oczyszczanie CK2 na P-11 celulozie

1. Supernatant ulegający elucji przy 0,4 M NaCl (frakcja 2) rozcieńczyć dwukrotnie buforem C i dodać do 5 ml P-11 celulozy, delikatnie mieszać przez 10 min. po czym odwirować i supernatant odrzucić.

2. Do P-11 celulozy dodać 50 ml 0,2 M NaCl w buforze C, zamieszać, odwirować i odrzucić supernatant.

3. Powtórzyć pkt 2.

4. Następnie do P-11 celulozy dodać 5 ml 0,7 M NaCl w buforze C, mieszać przez 10 min. po czym odwirować i zebrać supernatant zawierający aktywność kinazy białkowej CKII.

5. Zebrany supernatant poddać dializie (przepis - strona XX) wobec buforu C
   z dodatkiem 50% glicerolu. Po zakończeniu dializy roztwór przechowywać
   w temp. -20⁰ C.

Lokalizacja i regulacja aktywności kinazy białkowej CK2

Kinaza białkowa CK2 (dawniej nazywana kinazą kazeinową II) jest tradycyjnie klasyfikowana jako kinaza serynowo-treoninowa, niezależna od wtórnych przekaźników. Niemniej pojawiły się doniesienia o zdolności CK2 do fosforylacji białek w resztach tyrozynowych. Wykazano m.in., że jądrowe białko immunofilina FPR3 u drożdży Saccharomyces cerevisiae jest fosforylowane w reszcie tyrozyny w pozycji 183 przez CK2, co czyni ją kinazą o podwójnej specyficzności. Lista przypuszczalnych fizjologicznych substratów tego enzymu zawiera ponad 300 białek, wśród których znajdują się syntaza glikogenu, receptor insuliny, białka c-Myc i c-Myb czy topoizomerazy DNA I i II. Kinaza białkowa CK2 jest szeroko rozpowszechniona w organizmach eukariotycznych. W większości z nich występuje jako tetrameryczny kompleks składający się z dwóch podjednostek katalitycznych (α i/lub α') i dwóch podjednostek regulatorowych β.
W fosforylowanym białku CK2 rozpoznaje resztę seryny lub treoniny w sekwencji Ser/Thr - X - X - Asp/Glu/pSer/pThr/pTyr, gdzie X oznacza dowolny aminokwas.

Celem ćwiczenia jest wykazanie obecności CK2 w formie zasocjowanej
z rybosomami i wolnej w cytoplazmie komórki drożdżowej oraz określenie specyficzności substratowej i wpływu efektorów na aktywność tej kinazy.

Materiały i odczynniki

1. Preparat enzymatyczny kinazy CK2 po oczyszczeniu na DE-52 celulozie i P-celulozie

2. Frakcja mikrosomalna i rybosomy surowe o stężeniu 15 mg/ml (patrz ćw. XX)

3. Bufor do oznaczania aktywności kinaz - 10 x stężony:

200 mM Tris-HCl, pH 7,5

150 mM MgCl₂

60 mM β-MET

4. Substraty dla kinaz białkowych - 10 x stężone:

fosfityna (30 mg/ml)

kazeina defosforylowana (30 mg/ml)

histon IIA (3 mg/ml)

protamina (3 mg/ml)

rybosomalne białka P (3 mg/ml)

5. 0,5 mM polilizyna

6. Heparyna - 50 µg/ml

7. 2 mM spermina

8. 3 mM GTP

9. [γ³²P]ATP

10. Kwas octowy 30% i 15%

11. Kwas trójchlorooctowy 10% i 5%

12. Krążki z bibuły szklanej i P-81

13. Płyn scyntylacyjny

14. Odczynniki i zestaw do elektroforezy SDS-PAGE (patrz strona XX)

Wykonanie ćwiczenia

Ustalenie optymalnej ilości enzymu

Optymalną dla przebiegu reakcji ilość enzymu ustalić badając aktywność kinazy białkowej CK2 wobec kazeiny jako substratu. Mieszanina reakcyjna w końcowej objętości 50 µl zawiera:

20 mM Tris-HCl, pH 7,5

15 mM MgCl₂

6 mM β-MET

30µM [γ³²P] ATP

150 µg kazeiny

2 - 10 µl frakcji enzymatycznej

Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać według kolejności przedstawionej
w poniższej tabeli (w µl):

Składniki mieszaniny reakcyjnej	Probówka nr
		1	2	3	4	5	6
H2O	uzupełnić do objętości 50 µl
Bufor do oznaczania aktywności kinaz	5	5	5	5	5	5
Kazeina	-	5	-	5	-	5
[γ^32P] ATP	5	5	5	5	5	5
Frakcja enzymatyczna	-	2	-	5	-	10

Inkubację prowadzić 20 min. w temp. 30⁰C. Reakcję zatrzymać przez dodanie 100 µl 10% TCA w celu precypitacji białek a następnie przesączyć na filtrach z bibuły szklanej, przemywając dwa razy po 5 ml roztworu 5% TCA. Krążki wysuszyć i umieścić w płynie scyntylacyjnym. Zliczyć radioaktywność.

Określenie specyficzności substratowej kinazy białkowej CK2

Zbadać aktywność kinazy białkowej CK2, uwzględniając optymalną ilość enzymu, z wykorzystaniem poniżej podanych substratów. Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać według schematu podanego dla ustalenia optymalnej ilości enzymu.

Lp.	Substrat	Wyjściowe stężenie substratu	Końcowe stężenie substratu (w mieszaninie inkubacyjnej)
1.	fosfityna	30 mg/ml	3 mg/ml
2.	kazeina	30 mg/ml	3 mg/ml
3.	histon IIA	3 mg/ml	0,3 mg/ml
4.	protamina	3 mg/ml	0,3 mg/ml
5.	rybosomalne białka P	3 mg/ml	0,3 mg/ml

Inkubację prowadzić 20 min. w temp. 30⁰C. Reakcję w probówkach zawierających fosfitynę, kazeinę i rybosomalne białka P zatrzymać przez dodanie 100 µl 10% TCA,
a następnie przesączyć na filtrach z bibuły szklanej, przemywając dwa razy po 5 ml 5% roztworem TCA po czym wysuszyć i umieścić w płynie scyntylacyjnym. Zliczyć radioaktywność. W przypadku próbek zawierających protaminę i histon IIA bezpośrednio po inkubacji nanosić po 40 µl mieszaniny inkubacyjnej na krążki z bibuły P-81. Krążki płukać przez 10 min. kolejno w 30% i 15% kwasie octowym a następnie wysuszyć i umieścić
w płynie scyntylacyjnym. Zliczyć radioaktywność.

Badanie wpływu efektorów na aktywność CK2

Zbadać wpływ polilizyny i heparyny na aktywność kinazy białkowej CK2, (uwzględniając optymalną ilość enzymu), wobec kazeiny jako substratu. Końcowe stężenie polilizyny w mieszaninie inkubacyjnej powinno wynosić 0,05 mM, 0,1 mM i 0,2 mM, zaś heparynę należy dodawać do końcowego stężenia równego 5 µg/ml oraz 10 µg/ml. Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać i inkubację prowadzić według schematu podanego dla ustalenia optymalnej ilości enzymu.

Lokalizacja CK2 w formie zasocjowanej z rybosomami

Występowanie kinazy CK2 w formie zasocjowanej z rybosomami można wykazać inkubując rybosomy ze źródłem reszty fosforanowej, np. [γ³²P] ATP, w obecności efektorów aktywności CK2, bez dodawania preparatu egzogennej kinazy.

Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać według kolejności przedstawionej
w poniższej tabeli (w µl):

Składniki mieszaniny reakcyjnej	Probówka nr
		1	2	3	4	5	6
H2O	uzupełnić do objętości 50 µl
Bufor do oznaczania aktywności kinaz	5	5	5	5	5	5
Mikrosomy	10	-	-	-	-	-
Rybosomy surowe	-	10	10	10	10	10
Heparyna	-	-	5	10	-	-
Spermina	-	-	-	-	5	-
GTP	-	-	-	-	-	5
[γ^32P] ATP	10	10	10	10	10	10

1. Mieszaninę inkubować 30 min. w temp. 30⁰C, po czym dodać 20 μl buforu próbkowego do elektroforezy białek w warunkach denaturujących (SDS-PAGE)
   w celu zatrzymania reakcji.

2. Przygotować 13,8 % żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) według przepisu na stronie XX.

3. Próbki zawieszone w buforze próbkowym ogrzewać przez 3 minuty w temperaturze 90⁰C. Bezpośrednio po ogrzaniu nanosić na żel po 20 μl przygotowanych próbek. Rozdział prowadzić pod napięciem 150V tak długo, aż barwnik przesunie się do końca żelu separującego. Po rozdziale białka wybarwić błękitem Coomassie (patrz strona XX), wysuszyć, a następnie poddać autoradiografii.

Interpretacja wyników

1. Określić jakie substraty są fosforylowane przez kinazę białkową CK2.

2. Porównać wpływ poszczególnych efektorów na aktywność kinazy CK2.

3. Porównać poziom fosforylacji mikrosomów i rybosomów surowych przez kinazę białkową CK2 zasocjowaną z rybosomami.

Aktywacja i specyficzność substratowa kinazy zależnej od cAMP

Kinaza białkowa zależna od cAMP, zwana także kinazą A (PKA) należy do najlepiej poznanych wielofunkcyjnych kinaz serynowo-treoninowych. Substratami dla tej kinazy są m.in. białka histonowe, białko S6 podjednostki rybosomowej 40S, syntaza glikogenu. PKA jest holoenzymem składającym się z dwóch podjednostek regulatorowych (R) i dwóch podjednostek katalitycznych (C). W obecności cAMP w komórce następuje aktywacja kinazy w wyniku dysocjacji nieaktywnego holoenzymu na dimer podjednostek regulatorowych i dwa aktywne monomery podjednostki katalitycznej według wzoru:

R₂C₂ + 4cAMP R₂(cAMP)₄ + 2C

W warunkach in vitro, aktywację kinazy A można przeprowadzić drogą kontrolowanej proteolizy przy użyciu trypsyny, która odcina w podjednostce regulatorowej kinazy A domenę wiążącą cykliczne nukleotydy, co prowadzi do aktywacji kinazy. Podjednostki regulatorowe są istotne dla lokalizacji PKA w komórce. Przy udziale białek AKAP (ang. A-kinase anchoring protein) wiążących się z jednej strony do podjednostek regulatorowych PKA a z drugiej do białek cytoszkieletu czy membran organelli kinaza A jest kierowana do określonych miejsc w komórce.

Celem ćwiczenia jest określenie specyficzności substratowej kinazy A oraz sposobów jej aktywacji.

Materiały i odczynniki

1. Preparat enzymatyczny kinazy A po oczyszczeniu na DE-52 celulozie i P-celulozie

2. Bufor do oznaczania aktywności kinaz - 10 x stężony (skład ćw. XX)

3. Substraty dla kinaz białkowych - 10 x stężone (patrz ćw. XX)

4. 20 µM cAMP

5. 20 µM cGMP

6. [γ³²P]ATP

7. Bufor T - 10 x stężony:

100 mM Tris-HCl pH 8,0

100 mM β-MET

8. BSA 6 mg/ml

9. Trypsyna 40 µg/ml w 1 mM HCl

10. 1 mM HCl

11. Inhibitor trypsyny 0,4 mg/ml

12. Kwas octowy 30% i 15%

13. Kwas trójchlorooctowy 10% i 5%

14. Krążki z bibuły szklanej oraz P-81

15. Płyn scyntylacyjny

Wykonanie ćwiczenia

Ustalenie optymalnej ilości enzymu

Optymalną dla przebiegu reakcji ilość enzymu ustalić badając aktywność kinazy PKA wobec protaminy jako substratu. Mieszanina reakcyjna w końcowej objętości 50 µl zawiera:

20 mM Tris-HCl, pH 7,5

15 mM MgCl₂

6 mM β-MET

30µM [γ³²P] ATP

15 µg protaminy

2 µM cAMP

2 - 10 µl frakcji enzymatycznej

Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać według kolejności przedstawionej
w poniższej tabeli (w µl):

Składniki mieszaniny reakcyjnej	Probówka nr
		1	2	3	4	5	6
H2O	uzupełnić do objętości 50 µl
Bufor do oznaczania aktywności kinaz	5	5	5	5	5	5
Protamina	-	5	-	5	-	5
cAMP	-	5	-	5	-	5
[γ^32P] ATP	5	5	5	5	5	5
Frakcja enzymatyczna	-	2	-	5	-	10

Inkubację prowadzić 20 min. w temp. 30⁰C. Bezpośrednio po inkubacji nanosić po 40 µl mieszaniny inkubacyjnej na krążki z bibuły P-81. Krążki płukać przez 10 min. kolejno w 30% i 15% kwasie octowym a następnie wysuszyć i umieścić w płynie scyntylacyjnym. Zliczyć radioaktywność.

Określenie specyficzności substratowej kinazy A

Zbadać aktywność kinazy A, uwzględniając optymalną ilość enzymu, z wykorzystaniem poniżej podanych substratów. Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać według schematu podanego dla ustalenia optymalnej ilości enzymu (zamiast protaminy dodawać podane poniżej substraty).

Lp.	Substrat	Wyjściowe stężenie substratu	Końcowe stężenie substratu (w mieszaninie inkubacyjnej)
1.	fosfityna	30 mg/ml	3 mg/ml
2.	kazeina	30 mg/ml	3 mg/ml
3.	histon IIA	3 mg/ml	0,3 mg/ml
4.	protamina	3 mg/ml	0,3 mg/ml
5.	rybosomalne białka P	3 mg/ml	0,3 mg/ml

Inkubację prowadzić 20 min. w temp. 30⁰C. W probówkach zawierających fosfitynę, kazeinę i rybosomalne białka P, reakcję zatrzymać przez dodanie 100 µl 10% TCA,
a następnie przesączyć na filtrach z bibuły szklanej, przemywając, dwa razy po 5 ml,
5% roztworem TCA, po czym wysuszyć i umieścić w płynie scyntylacyjnym. Zliczyć radioaktywność. W przypadku próbek zawierających protaminę i histon IIA bezpośrednio po inkubacji nanosić po 40 µl mieszaniny inkubacyjnej na krążki z bibuły P-81. Krążki płukać przez 10 min. kolejno w 30% i 15% kwasie octowym, a następnie wysuszyć i umieścić
w płynie scyntylacyjnym. Zliczyć radioaktywność.

Badanie wpływu cGMP na aktywność kinazy A

Zbadać wpływ cGMP na aktywność kinazy A (uwzględniając optymalną ilość enzymu), wobec protaminy jako substratu. Końcowe stężenie cGMP w mieszaninie inkubacyjnej powinno wynosić 2 µM i 4 µM. Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać,
a także inkubację prowadzić według schematu podanego dla ustalenia optymalnej ilości enzymu (zamiast cAMP dodawać cGMP).

Aktywacja kinazy A drogą kontrolowanej proteolizy

Preparat kinazy A poddać inkubacji z trypsyną i bez trypsyny. Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać według kolejności przedstawionej w poniższej tabeli (w µl):

Składniki mieszaniny reakcyjnej	Probówka nr
		1	2
H2O	uzupełnić do objętości 50 µl
Bufor T - 10x stężony	5	5
BSA - 6 mg/ml	5	5
HCl - 1 mM	5	-
Trypsyna - 40 µg/ml	-	5
Preparat kinazy A	20	20

Inkubację prowadzić 15 min. w temp. 30⁰C, po czym dodać 5 µl sojowego inhibitora trypsyny w celu zatrzymania reakcji. Następnie w obu preparatach enzymatycznych sprawdzić aktywność kinazy A wobec protaminy jako substratu w obecności cAMP i bez cAMP według schematu podanego dla ustalenia optymalnej ilości enzymu.

Interpretacja wyników

1. Określić jakie substraty są fosforylowane przez kinazę A.

2. Wymienić sposoby aktywacji kinazy A.

Wykrywanie inhibitorów proteaz serynowych

Proteazy (proteinazy, peptydazy) to duża grupa enzymów należących do klasy hydrolaz, przeprowadzających hydrolizę wiązań peptydowych. Ze względu na mechanizm katalizy proteazy podzielone zostały na następujące grupy:

• proteazy serynowe,

• proteazy treoninowe,

• proteazy cysteinowe,

• proteazy aspartylowe

• metaloproteazy

• proteazy glutamylowe

Niektóre proteazy odcinają końcowe aminokwasy od łańcucha peptydowego (egzopeptydazy, np. aminopeptydaza N, karboksypeptydaza A), a inne hydrolizują wewnętrzne wiązania peptydowe (endopeptydazy, np. trypsyna, chymotrypsyna, pepsyna, trombina). Proteazy występują w komórkach wszystkich organizmów. Aktywność proteaz jest hamowana przez specyficzne inhibitory.

Ponad jedną trzecią wszystkich znanych enzymów proteolitycznych stanowią proteazy serynowe. Są one zaangażowane w rożnorodne reakcje w organizmie poczynając od prostego trawienia białek w przewodzie pokarmowym po precyzyjnie regulowane kaskady np. kaskada krzepnięcia krwi. Centrum aktywne wszystkich proteaz serynowych zawiera trzy, położone blisko siebie, reszty aminokwasowe: histydynę, serynę i kwas aspartylowy, tworzące tzw. triadę katalityczną biorącą bezpośredni udział w hydrolizie wiązania peptydowego.

Trombina ( EC 3.4.21.5) to enzym osocza należący do proteaz serynowych. Produkowana jest z protrombiny osocza pod wpływem tromboplastyny i aktywatorów. Trombina umożliwia powstanie nierozpuszczalnej fibryny z rozpuszczalnego fibrynogenu umożliwiając krzepnięcie krwi. Trombina rozpoznaje sekwencję Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser i przecina wiązanie peptydowe pomiędzy resztami Arg i Gly. Enzym wykazuje swoją aktywność w pH 5,0-10,0 (optimum to pH 8,3) i nie wymaga obecności dwuwartościowych jonów metali ani kofaktorów.

W ćwiczeniu badane białko, zawierające sekwencję aminokwasową rozpoznawaną przez trombinę, jest inkubowane z trombiną w obecności i bez inhibitorów proteaz. Po zakończeniu inkubacji przeprowadza się elektroforezę badanego białka w żelu poliakrylamidowym
w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) w celu identyfikacji inhibitorów hamujących aktywność proteolityczną trombiny.

Materiały i odczynniki

1. Roztwór badanego białka w PBS (wg zaleceń prowadzącego ćwiczenia)

2. Trombina (2U/μl - bezpośrednio przed ćwiczeniami rozcieńczyć 50-krotnie w PBS)

3. EDTA (80 mM roztwór w H₂O pH 8,0)

4. PMSF (16 mM roztwór w etanolu)

5. Pepstatyna A (16 μM roztwór w metanolu)

6. Bufor PBS:

137 mM NaCl

2,7 mM KCl

10 mM Na₂HPO₄

2 mM KH₂PO₄ pH 7,5

7. Odczynniki i zestaw do elektroforezy SDS-PAGE (patrz strona XX)

8. Odczynnik Bradford

Wykonanie ćwiczenia

1. Oznaczyć stężenie badanego białka metodą Bradford (przepis strona XX).

2. Badane białko poddać inkubacji z trombiną w obecności i bez inhibitorów proteaz według poniższego schematu (na podstawie podanych stężeń substancji używanych w doświadczeniu, należy samodzielnie obliczyć ilość tych substancji, którą trzeba dodać do probówki):

Uwaga! Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać wg przedstawionej kolejności

Składniki mieszaniny reakcyjnej	Probówka nr
		1	2		3		4		5		6		7
PBS	uzupełnić do objętości 40 μl
Trombina (0,04 U/ μl)	0,4 U			0,08U		0,4 U		0,4 U		0,4 U		0,4 U
EDTA 80 mM	-	-		-		-		10 mM		-		-
PMSF 16 mM	-	-		-		-		-		2 mM		-
Pepstatyna A 16 μM	-	-		-		-		-		-		2 μM
Inkubować 10 min. w temperaturze pokojowej, a następnie dodać badane białko
Badane białko	-		10 μg		10 μg		10 μg		10 μg		10 μg		10 μg

3. Mieszaninę inkubować 30 min. w temp. 37⁰C, po czym dodać 15 μl buforu próbkowego do elektroforezy białek w warunkach denaturujących (SDS-PAGE)
   w celu zatrzymania reakcji. Próbki pozostawić do kolejnych ćwiczeń w temperaturze
   -20⁰C.

4. Przygotować 13,8 % żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) według przepisu na stronie XX.

5. Próbki zawieszone w buforze próbkowym ogrzewać przez 3 minuty w temperaturze 90⁰C. Bezpośrednio po ogrzaniu nanosić na żel po 30 μl przygotowanych próbek. Rozdział prowadzić pod napięciem 150V tak długo, aż barwnik przesunie się do końca żelu separującego. Po rozdziale białka wybarwić błękitem Coomassie (patrz strona XX).

Interpretacja wyników

Określić, które z badanych inhibitorów hamują aktywność proteolityczną trombiny.

Identyfikacja inhibitora trypsyny metodą elektroforezy
w warunkach niedenaturujących

Elektroforeza w warunkach niedenaturujących (PAGE) pozwala na analizę elektroforetyczną białek w formie natywnej i umożliwia identyfikację aktywności badanych enzymów bądź ich inhibitorów.

Celem ćwiczenia jest wykrycie specyficznego inhibitora trypsyny pochodzącego
z nasion soi. Trypsyna (EC 3.4.21.4) to enzym soku trzustkowego należący do grupy proteaz serynowych. Trypsyna syntetyzowana jest w postaci nieaktywnego prekursora (zymogenu) trypsynogenu. W dwunastnicy pod wpływem niewielkich nawet ilości innego enzymu - enterokinazy dochodzi do aktywacji trypsynogenu. Dzięki autokatalitycznej zdolności trypsyny szybko dochodzi do pełnego uczynnienia wydzielonego trypsynogenu. Enzym ten hydrolizuje wiązania peptydowe, w których uczestniczą grupy karboksylowe należące do lizyny lub argininy. W wyniku działania trypsyny powstają peptydy zawierające na C-końcu resztę lizyny lub argininy. Optymalne pH dla aktywności trypsyny wynosi 8,0. Aby zapobiec autolizie trypsynę należy przechowywać
w temperaturze poniżej -20⁰C lub w pH równym 3,0. Aktywność trypsyny może zostać zahamowana przez związanie specyficznego inhibitora. W poniższym ćwiczeniu inhibitor trypsyny poddaje się elektroforezie w natywnym żelu poliakrylamidowym (PAGE) zawierającym edestynę (białko z nasion konopi) będącą substratem dla trypsyny. Edestyna nadaje żelowi mleczne zabarwienie. Po zakończeniu elektroforezy, żel inkubuje się
z roztworem trypsyny. W wyniku hydrolizy edestyny przez trypsynę w żelu powstają przejaśnienia. Jedynie strefy żelu, w których zlokalizowany jest inhibitor trypsyny pozostają mleczne.

Materiały i odczynniki

1. Edestyna (1 % roztwór w 0,05 M kwasie octowym)

2. Trypsyna ( 20 - 100 μg/ml w 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 - przygotować bezpośrednio przed użyciem)

3. Inhibitor trypsyny (0,25 mg/ml w H₂O)

4. 5% roztwór TCA

5. Odczynniki i zestaw do elektroforezy PAGE (patrz strona XX)

Wykonanie ćwiczenia

1. Przygotować 10% żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach niedenaturujących (PAGE) zawierający edestynę, według przepisu na stronie XX.

2. Przygotować próbki zawierające różne ilości inhibitora trypsyny: 1,25 μg; 2,5 μg; 5 μg i 7,5μg w objętości 30 μl.

3. Do każdej probówki zawierającej inhibitor trypsyny dodać po 10 μl 30% sacharozy
   i 1 μl 1% błękitu bromofenolowego. Dokładnie wymieszać i nanieść do studzienek
   w żelu zagęszczającym.

4. Rozdział elektroforetyczny prowadzić pod napięciem 120 V tak długo, aż barwnik przesunie się do końca żelu separującego.

5. Po zakończeniu elektroforezy żel inkubować w temperaturze 37⁰C w roztworze trypsyny o stężeniu 20 - 100 μg/ml w 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 do momentu zaobserwowania przejaśnień w żelu. Reakcję hydrolizy edestyny w żelu zatrzymać przez dodanie 5% roztworu TCA.

Badanie aktywności enzymatycznej w żelu poliakrylamidowym na przykładzie inwertazy

Badanie aktywności enzymów w żelu poliakrylamidowym jest często skuteczną metodą identyfikacji enzymów w nieoczyszczonych preparatach białkowych. Badanie aktywności enzymatycznej można przeprowadzać zarówno po rozdziale białek w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących jak i po elektroforezie w warunkach natywnych. Wybór metody zależy w dużej mierze od wrażliwości badanego enzymu na obecność SDS. W przypadku niektórych białek, które nie zachowują aktywności enzymatycznej w obecności SDS, można przeprowadzić ich renaturację poprzez usunięcie SDS (np. płucząc żel w roztworze 2,5% tritonu X-100). Jednakże nie ma jednej uniwersalnej, efektywnej metody renaturacji enzymów, toteż aktywność enzymatyczną niektórych białek bada się po przeprowadzeniu elektroforezy w warunkach natywnych.

Inwertaza, albo sacharaza (EC 3.2.1.26) katalizuje hydrolizę sacharozy będącej disacharydem złożonym z cząsteczki α-D-glukozy i cząsteczki β-D-fruktozy połączonych wiązaniem α1-β2 glikozydowym. Po rozerwaniu wiązania powstaje równomolarna mieszanina cząsteczek glukozy i fruktozy. Inwertaza jest syntetyzowana przez wiele szczepów drożdży i bakterii. Ilość enzymu produkowana przez mikroorganizm waha się znacznie w zależności od gatunku, szczepu, czy dostępnego źródła węgla. Drożdże Saccharomyces cerevisiae wytwarzają zarówno wewnątrz- jak i zewnątrzkomórkową inwertazę. Zewnątrzkomórkowa inwertaza występuje w formie wysoce glikozylowanego homodimeru wydzielanego do przestrzeni periplazmatycznej. Wewnątrzkomórkowa inwertaza również tworzy homodimer ale nie ulega glikozylacji. Inwertaza jest powszechnie stosowana w przemyśle spożywczym do produkcji fruktozy czy
w biosensorach do stałego monitorowania poziomu sacharozy.

Celem ćwiczenia jest identyfikacja aktywności enzymatycznej inwertazy z drożdży
S. cerevisiae po rozdziale w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących.

Materiały i odczynniki

1. 20 - godzinna hodowla drożdży S cerevisiae, szczep W303 (100ml)

2. (NH₄)SO₄ cz. d. a. w postaci stałej

3. 0,1 M Tris

4. 10 mM bufor fosforanowy pH 7,0

5. 10 mM bufor fosforanowy pH 7,0 z dodatkiem 30% glicerolu

6. 10 mM bufor fosforanowy pH 5,8

7. 0,1 M r-r sacharozy w 10 mM buforze fosforanowym pH 5,8 (przygotować bezpośrednio przed użyciem)

8. Chlorek tetrazolu w postaci stałej

9. 1M NaOH

10. Inwertaza - preparat handlowy (1 mg/ml w 10 mM buforze fosforanowym pH 5,8)

11. Celulozowe „węże” do dializy

12. Papierki wskaźnikowe pH 5,4 - 7,0

13. Odczynniki i zestaw do elektroforezy białek

Wykonanie ćwiczenia

Wysalanie i dializa białek z płynu pohodowlanego

1. Po ok. 20 godzinach hodowli, gdy OD₆₀₀ równa się ok. 9-10 (faza stacjonarna) odwirować komórki przy 3000 rpm przez 10 min.

2. Płyn pohodowlany zlać do cylindra (źródło inwertazy) a osad komórek odrzucić.

3. Zmierzyć objętość płynu pohodowlanego, przelać go do zlewki i pozostawić w lodzie na mieszadle magnetycznym.

4. Białka wytrącać stałym siarczanem amonu przy wysyceniu 0-90% (tabela frakcjonowania siarczanem amonu - strona XX). Siarczan amonu dodawać stopniowo mieszając przez 1 godz. w temp. 4⁰ C. Następnie zawiesinę odwirować przy 10000 rpm przez 20 min.

5. Osad wytrąconych białek rozpuścić w 200-500 µl 10 mM buforu fosforanowego, pH 7,0 i poddać dializie (przepis - strona XX) wobec 10 mM buforu fosforanowego, pH 7,0 z dodatkiem 30% glicerolu. Po zakończeniu dializy roztwór białek przechowywać
   w temp. -20⁰ C.

Oznaczanie aktywności inwertazy w żelu

1. Oznaczyć stężenie białka metodą Bradford (przepis - strona XX).

2. Przygotować 10% żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach denaturujących (SDS/PAGE) według przepisu na stronie XX.

3. Przygotować próbki zawierające 200 µg białka w objętości 30 µl i dodać do nich po
   10 µl buforu próbkowego do elektroforezy białek w warunkach denaturujących (bezpośrednio przed naniesieniem na żel). Jako wzorzec przygotować próbkę zawierającą 10 µg inwertazy handlowej w objętości 30 µl i dodać do niej 10 µl buforu próbkowego. Dokładnie wymieszać (uwaga! nie ogrzewać próbek w temperaturze 90⁰C) i nanieść do studzienek w żelu zagęszczającym.

4. Rozdział elektroforetyczny prowadzić pod napięciem 150 V tak długo, aż barwnik przesunie się do końca żelu separującego.

5. Po zakończeniu elektroforezy żel przenieść do małego pojemnika, przepłukać 30 ml wody destylowanej, a następnie 30 ml 10 mM buforu fosforanowego pH 5,8.

6. Następnie żel zalać 30 ml 0,1 M roztworu sacharozy w 10 mM buforze fosforanowym pH 5,8 i inkubować w łaźni wodnej w temp. 45⁰C przez 45 min. Uwaga! Podczas inkubacji należy kontrolować pH r-ru (pH r-ru wzrasta). W przypadku zmiany pH, zlać roztwór i zalać kolejną porcją.

7. Ok. 10 min przed zakończeniem inkubacji przygotować wrzącą łaźnię wodną. Naważyć 50 mg chlorku tetrazolu i rozpuścić w 50 ml 1M NaOH. Roztwór barwnika umieścić w szklanym naczyniu na wrzącej łaźni wodnej.

8. Gdy roztwór chlorku tetrazolu zaczyna zmieniać barwę (z bezbarwnej na różową), wyjąć żel z inkubacji, zlać roztwór substratu, a żel przepłukać trzy razy wodą destylowaną .

9. Przenieść żel do roztworu barwnika umieszczonego na wrzącej łaźni wodnej.

10. Żel barwić do pojawienia się czerwonych prążków białkowych.

11. Reakcję przerwać przez przeniesienie żelu do roztworu 10 % kwasu octowego.

Cykl życiowy drożdży Saccharomyces cerevisiae

Komórki drożdży mogą występować w dwóch formach: haploidalnej i diploidalnej. Zarówno forma haploidalna jak i diploidalna może się rozmnażać na drodze podziałów wegetatywnych (pączkowanie) i stabilnie rosnąć w hodowlach. Haploidalne komórki drożdżowe mogą występować w dwóch typach płciowych - a i α. Poprzez zlanie się dwóch haploidalnych komórek o przeciwnych typach płciowych (koniugacja) powstaje komórka diploidalna a/α. Komórka w fazie diploidalnej może przechodzić normalne wegetatywne podziały, lecz nie może się krzyżować z innymi komórkami. W niekorzystnych warunkach środowiskowych komórka diploidalna może wejść na szlak sporulacji, wytwarzając po podziałach mejotycznych, worek z czterema haploidalnymi zarodnikami (sporami): dwoma typu a i dwoma α .

Cykl życiowy drożdży S. cerevisiae przedstawiono schematycznie na poniższym rysunku.

Koniugacja drożdży S. cerevisiae

Techniki koniugacji i sporulacji od lat są wykorzystywane w laboratoriach zajmującymi się drożdżami, gdyż pozwalają na połączenie haploidalnych klonów o odmiennych cechach genetycznych. Po wytworzeniu zarodników przez pokolenie diploidalne możliwa jest izolacja klonów pochodzących z jednego zarodnika o pożądanych cechach genetycznych wprowadzonych przez oba szczepy haploidalne użyte do koniugacji. Aby ułatwić takie manipulacje utworzono na drodze mutagenezy liczne tandemy szczepów haploidalnych a i α różniące się posiadanymi markerami auksotroficznymi, co pozwala na swobodne krzyżowanie i łatwą selekcję pokolenia diploidalnego. Przykładem, który to ilustruje jest często wykorzystywany tandem szczepów drożdżowych BY4741 i BY4742
o cechach genotypowych ujętych w tabeli:

Nazwa szczepu	Typ płciowy	markery auksotroficzne
BY4741	a	his3Δ1; leu2Δ0; ura3Δ0; met15Δ0
BY4742	α	his3Δ1; leu2Δ0; ura3Δ0; lys2Δ0

W obu szczepach obecne są delecje inaktywujące geny związane z biosyntezą histydyny, leucyny i uracylu, co pozwala na dowolne wprowadzanie: (1) mutacji kierowanych (ang. site directed) na chromosomie za pomocą aktywnych kopii genów (HIS3, LEU2
i URA3), (2) plazmidów posiadających wymienione geny w celu selekcji. Pozostałe markery służą do przeprowadzenia procesu koniugacji pomiędzy tymi szczepami. Po zmieszaniu hodowli obu szczepów haploidalnych i przeniesieniu mieszaniny na podłoże pozbawione metioniny i lizyny, nie zaobserwujemy wzrostu haploidalnych pokoleń rodzicielskich a i α, natomiast uzyskamy wzrost szczepu diploidalnego, powstałego w wyniku koniugacji obu szczepów haploidalnych, który będzie zawierał zarówno po nieaktywnej kopii genów met15Δ0 i lys2Δ0 jak i ich aktywne kopie wprowadzone przez przeciwny typ płciowy.

Materiały i odczynniki

1. Nocna hodowla wzorcowych szczepów drożdży BY4741 i BY4742 (po 5 ml)

2. Nocna hodowla badanych szczepów drożdży (wybranych przez prowadzącego ćwiczenia - po 5 ml)

3. Podłoże SD z 3% agarem -50 ml

4. 40% glukoza

5. Mieszanina aminokwasów pozbawiona metioniny i lizyny (10 x stężona)

6. Jałowa woda dejonizowana

7. Jałowe płytki Petriego

8. Jałowe probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml i końcówki do pipet

Wykonanie ćwiczenia

Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków jałowych.

1. Na dwie jałowe płytki Petriego wylać po 20 ml podłoża SD z agarem dodając do niego, bezpośrednio przed wylaniem, 1/5 objętości 40% glukozy, i 1/10 objętości roztworu aminokwasów pozbawionych lizyny i metioniny.

2. Pozostawić uchylone płytki do osuszenia przez 15 minut.

3. Odwirować przy 10000 rpm przez 1 min. 200 µl całonocnych hodowli szczepów wzorcowych i szczepów badanych.

4. Osad komórek zawiesić w 1000 µl jałowej wody i ponownie odwirować w celu usunięcia resztek podłoża.

5. Osad komórek zawiesić w 500 µl jałowej wody.

6. W celu sprawdzenia poprawności procedury, wykonać testową koniugację szczepów wzorcowych, wg załączonego schematu, nanosząc na płytkę z podłożem po 10 µl zawiesiny komórek.

7. Wykonać koniugację badanych szczepów z wzorcami typu płciowego a i α.

8. Płytki inkubować w temp. 30⁰C do pojawienia się wzrostu koniugantów (3-4 dni).

Schemat wykonania koniugacji

Interpretacja wyników

Określić typ płciowy badanych szczepów drożdży.

Sporulacja drożdży S. cerevisiae

Wytworzenie zarodników (spor) poprzedzone podziałem mejotycznym jest jedną
ze strategii przetrwania komórek drożdży w czasie pogorszenia się warunków wzrostu
w środowisku. Spory ze względu na odmienną budowę ścian komórkowych i kondensację cytoplazmy są bardziej odporne niż komórki wegetatywne na szkodliwe czynniki takie jak wysuszenie czy wysoka temperatura.

W warunkach laboratoryjnych proces wytwarzania zarodników możemy indukować dobierając odpowiednio podłoża. W pierwszym pasażu komórki drożdżowe hoduje się na podłożu stałym bogatym w źródła azotu i aminokwasy (pepton, ekstrakt drożdżowy) oraz
w obecności niefermentowalnych źródeł węgla takich jak etanol czy gliceryna, w czasie wzrostu metabolizm drożdży przestawiony zostaje na oddychanie tlenowe. Z takiego podłoża komórki drożdży przenosi się na podłoże minimalne pozbawione źródeł azotu oraz
z ograniczonym dostępem do substancji mogących stanowić źródła energii. Standardowo wykorzystujemy w tym celu podłoże agarowe zawierające jedynie octan potasu. Gwałtowne pogorszenie warunków wzrostu, połączone z obniżeniem temperatury inkubacji z 30⁰C do
25⁰C, indukuje procesy prowadzące do podziału mejotycznego i wytworzenia zarodników.

Materiały i odczynniki

1. Płytka Petriego z podłożem presporulacyjnym YPGlic (2% pepton, 1% ekstrakt drożdżowy, 2% glicerol, 2% agar) z rosnącymi komórkami drożdży pokolenia diploidalnego - przygotować trzy dni przed zajęciami

2. Podłoże sporulacyjne (1% octan potasu, 2 % agar)

3. Jałowe płytki Petriego

4. Eza

5. Parafilm

Wykonanie ćwiczenia

Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków jałowych.

1. Przygotować jałowe płytki Petriego z podłożem sporulacyjnym.

2. Za pomocą ezy przenieść komórki drożdży z podłoża presporulacyjnego na podłoże sporulacyjne rozprowadzając je grubą warstwą w postaci kwadratów o powierzchni
   1 cm kw.

3. Płytki Petriego szczelnie zabezpieczyć parafilmem przed wysychaniem.

4. Inkubować w temp. 25⁰C lub w temp. pokojowej do następnych ćwiczeń (min. 7 dni).

Otrzymanie pokolenia haploidalnego drożdży po sporulacji

Poprawa warunków środowiska prowadzi do kiełkowania zarodników. Pokolenie haploidalne najczęściej jeszcze w zarodni wchodzi w proces koniugacji prowadzący do odtworzenia pokolenia diploidalnego. W warunkach laboratoryjnych istotne jest oddzielenie zarodników od komórek wegetatywnych oraz rozbicie zarodni (worków) celem separacji zarodników, aby nie dopuścić do przypadkowych koniugacji.

W tym celu najczęściej dokonujemy mechanicznego rozerwania ścian zarodni poprzez np. wytrząsanie z kulkami szklanymi, bądź prowadzimy enzymatyczną degradację ściany za pomocą enzymów rozkładających wiązanie β(1-3) glikozydowe, np. zymoliazy (ściana zarodnika, ze względu na odmienną budowę, jest na trawienie takimi enzymami odporna). Po uwolnieniu zarodników przeprowadzamy ich izolację wykorzystując różnice w masie zarodników i komórek wegetatywnych lub doprowadzamy do zabicia komórek wegetatywnych działając na nie wysoką temperaturą.

Materiały i odczynniki

1. Podłoże sporulacyjne z komórkami drożdży przygotowanymi na poprzednich zajęciach

2. Nocna hodowla drożdży BY 4741 na płynnym podłożu YPD - 5 ml

3. Podłoże YPD (2% pepton, 1% ekstrakt drożdżowy 2% glukoza, 2% agar) - 200 ml

4. Jałowy bufor PBS

5. Jałowe płytki Petriego

6. Eza

7. Głaszczka

8. Jałowe probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml oraz końcówki do pipet

9. Termoblok

10. Mikroskop świetlny oraz szkiełka podstawowe i nakrywkowe

Wykonanie ćwiczenia

Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków jałowych.

1. Przygotować preparaty mikroskopowe komórek drożdży z płytek z podłożem sporulacyjnym i nocnej hodowli drożdży.

2. Zanotować różnice w wyglądzie komórek zwracając uwagę na: liczbę pączkujących komórek, ich wielkość oraz obecność tetrad zarodników.

3. Za pomocą ezy pobrać komórki z płytek z podłożem sporulacyjnym i zawiesić je
   w 1 ml buforu PBS, utrzymując komórki w lodzie.

4. Zwirować 1 ml komórek nocnej hodowli drożdży i osad zawiesić w 1 ml buforu PBS.

5. Zmierzyć gęstość optyczną zawiesiny komórek pobranych z podłoża sporulacyjnego oraz zawiesiny komórek pobranych z nocnej hodowli drożdży przy długości fali 600 nm (OD₆₀₀).

6. Dla obu próbek przygotować, w probówkach Eppendorfa o poj. 1,5 ml, po 1 ml rozcieńczonej zawiesiny komórek o gęstości OD₆₀₀ = 0,1 w buforze PBS.

7. Pobrać do osobnych probówek Eppendorfa po 0,1 ml zawiesiny (czas 0)

8. Pozostałą część zawiesiny umieścić w termobloku w temperaturze 50⁰C i pobierać po 0,1 ml zawiesiny w odstępach 15 minutowych (czas 15, 30 i 45 min). Ze względu na szybką sedymentację komórek drożdży, przed pobraniem zawartość probówek zamieszać.

9. W czasie inkubacji przygotować 8 płytek Petriego z podłożem YPD z 2% agarem.

10. Pobrane w czasie 0, 15, 30 i 45 min. zawiesiny komórek rozprowadzić głaszczką na płytkach Petriego z podłożem YPD z 2% agarem.

11. Płytki Petriego szczelnie zabezpieczyć parafilmem przed wysychaniem.

12. Inkubować w temperaturze 30⁰C do czasu pojawienia się kolonii drożdży (3-5 dni).

13. Policzyć ilość kolonii na każdej płytce i zanotować wynik.

Załącznik do ćwiczeń

ELEKTROFORETYCZNY ROZDZIAŁ DNA W ŻELU AGAROZOWYM

Agaroza to polisacharyd będący polimerem pochodnych galaktozy, otrzymywany przez oczyszczanie z agaru jadalnego. Agaroza jest łatwo rozpuszczalna w wodzie, w temperaturze pokojowej odwracalnie tworzy żel. Temperatura przejścia żelu w zol (potocznie topnienie agarozy) jest wyższa od temperatury zestalania.

Elektroforeza DNA w żelu agarozowym jest standardową metodą pozwalającą rozdzielić, zidentyfikować lub oczyścić fragmenty DNA. Do zalet tej metody należy zaliczyć jej prostotę a także możliwość bezpośredniej lokalizacji fragmentów DNA w żelu przy pomocy barwnika interkalującego - bromku etydyny

Czynniki wpływające na tempo migracji DNA w żelu agarozowym.

Masa cząsteczkowa DNA:

Większe cząsteczki DNA migrują wolniej niż cząsteczki małe ze względu na większe opory ruchu oraz większe trudności w penetrowaniu porów żelu będącego rodzajem sita molekularnego. Tempo migracji jest odwrotnie proporcjonalne do logarytmu dziesiętnego ilości par zasad.

Stężenie agarozy:

Zwiększając stężenie agarozy zwalnia się tempo migracji DNA w żelu. Na podstawie prac doświadczalnych ustalono optymalne stężenie agarozy do rozdziałów fragmentów DNA o określonej wielkości. Dane te przedstawiono w tabeli:

Optymalne stężenie agarozy
Wielkość cząsteczki DNA (kb)	Stężenie agarozy (%w/v)
5 - 60	0,3
1 - 20	0,6
0,8 - 10	0,7
0,5 - 7	0,9
0,4 - 6	1,2
0,2 - 3	1,5
0,1 - 2	2,0

Stosowane napięcie prądu podczas elektroforezy:

Przy niskich napięciach tempo migracji liniowych cząsteczek kwasów nukleinowych jest wprost proporcjonalne do napięcia. Zależność ta przestaje obowiązywać dla dużych cząsteczek DNA rozdzielanych przy zastosowaniu wysokich napięć, dlatego też w czasie rozdziału cząsteczek większych niż 2000 pz (2 kb) nie należy stosować napięcia większego niż 5 V/cm.

Temperatura rozdziału:

Temperatura w jakiej dokonuje się rozdziału w zakresie od 4°C do temperatury pokojowej nie wpływa w istotnym stopniu na elektroforetyczne właściwości DNA. Ma jednakże wpływ na bierną dyfuzję kwasów nukleinowych w żelu, co może mieć wpływ (szczególnie w przypadku wyższych temperatur a także mniejszych fragmentów DNA) na ostrość prążków. Obniżenie temperatury podczas rozdziału powoduje wyostrzenie poszczególnych prążków. W celu przeprowadzenia elektroforezy w obniżonej temperaturze należy zastosować aparat z wymiennikiem ciepła.

Bromek etydyny:

Obecność bromku etydyny w buforze do elektroforezy (i żelu) lub w barwniku do próbek zwalnia tempo przemieszczania się cząsteczek o ok. 15%.

Skład i siła jonowa buforu:

W buforze o niskiej sile jonowej DNA przemieszcza się bardzo wolno. W wypadku stosowania buforu o dużej sile jonowej wydzielana jest duża ilość ciepła, które może spowodować roztopienie agarozy i denaturację DNA. Najpowszechniej stosowany jest bufor TAE.

Elektroforezę natywnego RNA przeprowadza się według tych samych zasad co elektroforezę DNA. Jednakże większość cząsteczek RNA tworzy złożone struktury drugorzędowe co powoduje, że szybkość migracji takich cząsteczek RNA nie jest proporcjonalna do ich wielkości. Ponadto, cząsteczki takie mogą tworzyć kilka form widocznych na żelu w postaci oddzielnych prążków. Toteż, próbki RNA przed elektroforezą często poddaje się denaturacji i elektroforezę przeprowadza się w warunkach denaturujących.

Materiały i odczynniki

1. Bufor próbkowy do elektroforezy RNA 2x stężony:

95% formamid

0,025 % SDS

0,025% błękit bromofenolowy

0,025% bromek etydyny

0,5 mM EDTA, w wodzie

2. Bufor próbkowy do elektroforezy DNA:

10 mM Tris-HCl, pH 8,0

30 % glicerol

0,04% błękit bromofenolowy

3. Bufor TAE 50 x stężony:

242 g Tris

57,1 ml kw. octowy lodowaty

100 ml 0,5 M EDTA pH 8,0

dopełnić H₂O do 1000 ml

4. Agaroza

5. Bromek etydyny 10 mg/ml

6. Markery do elektroforezy kwasów nukleinowych

7. Zestaw do elektroforezy kwasów nukleinowych

Wykonanie ćwiczenia

Uwaga! Pracę z bromkiem etydyny wykonywać w rękawicach ochronnych.

Zgodnie z zaleceniami prowadzącego ćwiczenia, przygotować 50 ml 0,7% lub 1% roztworu agarozy w buforze TAE. W tym celu odpowiednio 0,35g lub 0,5g agarozy rozpuścić w 50 ml buforu TAE ( 1 ml 50x stężonego buforu TAE + 49 ml H₂O). Agarozę gotować przez ok. 2 minuty w celu dobrego rozpuszczenia. Następnie roztwór agarozy schłodzić do temp. 60-70⁰C i dodać 5 μl roztworu bromku etydyny. Dokładnie wymieszać, wylać na płytkę i pozostawić do zastygnięcia.

Badane próbki DNA lub RNA zawiesić w buforze próbkowym do elektroforezy, odpowiednio, DNA lub RNA. Płytkę z zastygniętym żelem agarozowym umieścić w aparacie do elektroforezy. Aparat napełnić buforem elektrodowym (1x stężony TAE). Na żel nanosić po 5-30 μl próbek kwasów nukleinowych. Rozdział prowadzić przy napięciu 100V dopóki czoło barwnika nie dotrze do 3/4 długości żelu. Po zakończonej elektroforezie obserwować rozdzielone kwasy nukleinowe pod lampą UV.

ELEKTROFORETYCZNY ROZDZIAŁ BIAŁEK W ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM

Żel poliakrylamidowy posiada następujące cechy: jest bezbarwny, pozbawiony ładunków, odznacza się dużą wytrzymałością mechaniczną, łatwy w przygotowaniu i formowaniu w odpowiednich naczyniach. Żel poliakrylamidowy to łańcuchy akrylamidu (H₂C=CH-CO-NH₂) połączone wiązaniami poprzecznymi za pomocą N,N'-metyleno-bis-akrylamidu (H₂C=CH-CO-NH-CH₂-NH-CO-CH=CH₂). W ten sposób tworzy się sieć, przez „oczka ^„ której migrują rozdzielane cząsteczki. Wielkość „oczek” sieci żelu zależy od stężenia akrylamidu oraz bisakrylamidu. Polimeryzacja żelu odbywa się w obecności nadsiarczanu amonu (AMPS) oraz N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED).

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) umożliwia rozdział cząsteczek białkowych różniących się wielkością i ładunkiem elektrycznym. Rozdział ten można prowadzić w warunkach niedenaturujących oraz w warunkach denaturujących. Elektroforeza białek w warunkach denaturujących określana skrótem SDS-PAGE odbywa się w obecności soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), który jest detergentem jonowym. SDS łącząc się

z grupami hydrofobowymi aminokwasów nadaje białkom ładunek ujemny. Sprawia to, że migrują one w kierunku dodatniej anody. Ilość związanego SDS jest proporcjonalna do wielkości cząsteczek białkowych. Dzięki temu rozdzielają się one w żelu pod względem masy cząsteczkowej. Polipeptydy o niższej masie cząsteczkowej migrują szybciej, zaś większe wolniej. Metoda SDS-PAGE stosowana jest między innymi do: identyfikacji i monitorowania składu mieszaniny białek, sprawdzania jednorodności (homogenności) białek, oznaczania masy cząsteczkowej białek, analizy struktury podjednostkowej aktywnych biologicznie kompleksów białkowych.

Elektroforeza w warunkach niedenaturujących (PAGE)

Materiały i odczynniki

1. 30% roztwór akrylamidu + 0,8% roztwór bisakrylamidu

2. 1,5M roztwór Tris-HCl pH 8,8

3. 0,5M roztwór Tris-HCl pH 6,8

4. 10% roztwór AMPS (nadsiarczanu amonu)

5. TEMED

6. 1% roztwór błękitu bromofenolowego

7. 30% roztwór sacharozy

8. Bufor elektrodowy:

Glicyna 14,4 g

Tris 3,0 g

uzupełnić wodą do1000 ml

9. Wzorce białkowe

10. Zestaw do elektroforezy białek

Przygotowanie żelu i próbek białkowych

Umyte i odtłuszczone specjalne płytki szklane do elektroforezy, złożyć zgodnie ze wskazówkami prowadzącego ćwiczenia. Przygotować 2 rodzaje żeli poliakrylamidowych według przepisu:

Żel separujący

ODCZYNNIK	Żel 10% (8 ml)	Żel 10% (8 ml) z edestyną	Żel 12% (8 ml)	Żel 13,8% (8 ml)	Żel 15% (8 ml)
H2O 30% akrylamid + 1% bisakrylamid 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 10% AMPS 1% edestyna TEMED	3,1 ml 2,7 ml 2,0 ml 80 μl - 8 μl	2,3 ml 2,7 ml 2,0 ml 80 μl 0,8 ml 8 μl	2,6 ml 3,2 ml 2,0 ml 80 μl - 8 μl	2,2 ml 3,6 ml 2,0 ml 80 μl - 8 μl	1,8 ml 4,0 ml 2,0 ml 80 μl - 8 μl

Żel zagęszczający

ODCZYNNIK	na 2,5 ml żelu	na 5,0 ml żelu
H2O 30% akrylamid + 1% bisakrylamid 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 10% AMPS TEMED	1,3 ml 0,5 ml 0,625 ml 25 μl 2,5 μl	2,6 ml 1,0 ml 1,25 ml 50 μl 5 μl

Polimeryzację żelu wykonać między przygotowanymi płytkami szklanymi, zgodnie ze wskazówkami prowadzącego ćwiczenia.

Uwaga! Roztwory dodawać wg przedstawionej kolejności.

TEMED - inicjator polimeryzacji, dodawać jako ostatni składnik, bezpośrednio przed wylaniem mieszaniny między płytki !

Próbki do analizy przygotować w następujący sposób: do każdej probówki zawierającej analizowane białka lub wzorce białkowe (1-20μg białka w objętości 30μl) dodać po 10μl 30% sacharozy i 1μl 1% błękitu bromofenolowego. Dokładnie wymieszać i bez ogrzewania używać do doświadczeń..

Płytki ze spolimeryzowanym żelem poliakrylamidowym umieścić w aparacie do elektroforezy. Aparat napełnić buforem elektrodowym. Przygotowane próbki ostrożnie nanieść do studzienek w żelu zagęszczającym. Podłączyć elektrody do zasilacza. Rozdział elektroforetyczny prowadzić pod napięciem 120 V tak długo, aż barwnik przesunie się do końca żelu separującego. Wyłączyć zasilacz, wyjąć płytki z żelem, a następnie przeprowadzić kolejno barwienie i odbarwianie żelu.

Elektroforeza w warunkach denaturujących (SDS-PAGE)

Materiały i odczynniki

1. 30% roztwór akrylamidu + 0,8% roztwór bisakrylamidu

2. 1,5M roztwór Tris - HCl pH 8,8

3. 0,5M roztwór Tris - HCl pH 6,8

4. 10% roztwór SDS

5. 10% roztwór AMPS

6. TEMED

7. Bufor próbkowy (4x stężony) :

1,25M roztwór Tris-HCl pH 6,8 0,5ml

Glicerol 1,0ml

10% roztwór SDS 2,0ml

DTT 154mg

H₂O 1,3ml

1% roztwór błękitu bromofenolowego 200μl

8. Bufor elektrodowy:

Glicyna 14,4g

Tris 3,0g

SDS 1,0g

uzupełnić wodą do 1000ml

9. Wzorce białkowe

10. Zestaw do elektroforezy białek

Przygotowanie żelu i próbek białkowych

Umyte i odtłuszczone specjalne płytki szklane do elektroforezy złożyć zgodnie ze wskazówkami prowadzącego ćwiczenia. Przygotować żel poliakrylamidowy według przepisu:

Żel separujący

ODCZYNNIK	Żel 10% (8 ml)	Żel 12% (8 ml)	Żel 13,8% (8 ml)	Żel 15% (8 ml)
H2O 30% akrylamid + 1%bisakrylamid 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 10% SDS 10% AMPS TEMED	3,1 ml 2,7 ml 2,0 ml 80 μl 80 μl 8 μl	2,6 ml 3,2 ml 2,0 ml 80 μl 80 μl 8 μl	2,2 ml 3,6 ml 2,0 ml 80 μl 80 μl 8 μl	1,8 ml 4,0 ml 2,0 ml 80 μl 80 μl 8 μl

Żel zagęszczający

ODCZYNNIK	na 2,5 ml żelu	na 5,0 ml żelu
H2O 30% akrylamid + 1%bisakrylamid 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 10% SDS 10% AMPS TEMED	1,3 ml 0,5 ml 0,625 ml 25 μl 25 μl 2,5 μl	2,6 ml 1,0 ml 1,25 ml 50 μl 50 μl 5 μl

Polimeryzację żelu wykonać między przygotowanymi płytkami szklanymi, zgodnie ze wskazówkami prowadzącego ćwiczenia .

Uwaga! Roztwory dodawać wg przedstawionej kolejności.

TEMED - inicjator polimeryzacji, dodawać jako ostatni składnik, bezpośrednio przed wylaniem mieszaniny między płytki !

Próbki do analizy przygotować w następujący sposób: do każdej probówki zawierającej analizowane białka lub wzorce białkowe (1-30 μg białka w objętości 30 μl) dodać po 10 μl buforu próbkowego i wymieszać. Następnie, próbki ogrzewać przez 3 min.
w temp. 90⁰C. Bufor próbkowy zawierający SDS i DTT niszczy strukturę natywną białek
w podwyższonej temperaturze.

Płytki ze spolimeryzowanym żelem poliakrylamidowym umieścić w aparacie do elektroforezy. Aparat napełnić buforem elektrodowym. Przygotowane próbki białkowe ostrożnie nanieść do studzienek w żelu zagęszczającym. Rozdział prowadzić pod napięciem 150V tak długo, aż barwnik przesunie się do końca żelu separującego. Wyłączyć zasilacz, wyjąć płytki z żelem do wybarwienia .

Barwienie białek po elektroforezie

Celem uwidocznienia oraz identyfikacji rozdzielonych prążków białkowych, żel poliakrylamidowy po elektroforezie poddaje się barwieniu. Najczęściej stosuje się tu roztwór barwnika Coomassie lub barwienie metodą srebrową .

A. Barwienie błękitem Coomassie

Odczynniki

Mieszanina barwiąca:

Metanol 400 ml

Kwas octowy 100 ml

H₂O 500 ml

Błękit Coomassie 2,5 g

Odbarwiacz:

Metanol 400 ml

Kwas octowy 100 ml

H₂O 500 ml

Wykonanie ćwiczenia

Wyjęty żel poliakrylamidowy umieścić w roztworze barwnika na okres około
15-30 min. Po tym czasie, zlać barwnik, żel przepłukać wodą a następnie odbarwiać go roztworem odbarwiającym tak długo, aż widoczne staną się rozdzielone prążki białka. Po wybarwieniu żel wysuszyć. Barwienie błękitem Coomassie pozwala na wykrycie prążków białkowych zawierających około 0,1 μg białka.

B. Barwienie srebrem

Jest to metoda 10-100 razy czulsza od metody barwienia białek błękitem Coomassie. W metodzie srebrowej większość białek ulega zabarwieniu na kolor czarny lub brązowy. Lipoproteiny wybarwiają się na niebiesko, a glikoproteiny na brązowo lub czerwono.

METODA I

Odczynniki

Nr 1. 10% roztwór kwasu trichlorooctowego (TCA)

Nr 2. 2% roztwór błękitu Coomassie G - 250

Nr 3. Roztwór do barwienia koloidalnego:

(NH₄)₂SO₄ 70g

85% H₃PO₄ 23,6ml

Metanol 200ml

uzupełnić wodą do 950 ml

Nr 4. 0,2 mM roztwór DTT: 10μl 2M DTT w 100ml H₂O

Nr 5. 0,1% roztwór AgNO₃: 50mg AgNO₃ w 50ml H₂O

Nr 6. 3% roztwór Na₂CO₃ + 0,018% HCHO: 7,5g Na₂CO₃

125μl 37% HCHO w 250ml H₂O

Nr 7. 20% kwas cytrynowy: 5 g kw. cytrynowego w 25 ml H₂O

Uwaga! Odczynniki nr 4, 5, 6 przygotować bezpośrednio przed użyciem. Barwienie wykonywać w kuwecie przeznaczonej wyłącznie do tego celu.

Wykonanie ćwiczenia

1. Żel poliakrylamidowy po elektroforezie utrwalać przez 1 godz. w 50ml 10% TCA .

2. Płukać 3 x 5 min w 100ml wody destylowanej.

3.Barwić żel przez 1godz. w 50 ml roztworu do barwienia koloidalnego, zawierającego
2,5 ml 2% błękitu Coomassie.

4. Płukać 3 x 5 min. w 100ml wody destylowanej.

5. Płukać 10 min. w 50 ml wody destylowanej, w gorącej łaźni wodnej stale mieszając.

6. Dodać 50 ml 0,2M DTT i mieszać przez następne10 min. w gorącej łaźni wodnej.

7. Przepłukać żel w 100 ml wody destylowanej.

8. Barwić w 50 ml 0,1% AgNO₃ w gorącej łaźni wodnej przez 10 min. stale mieszając.

9. Przepłukać żel 100 ml wody destylowanej.

10. Dodać 50ml roztworu wywoływacza barwy (odczynnik nr 6) na około 30 sek., następnie zlać go i powtórnie dodać 50 ml świeżego wywoływacza. Całość dokładnie mieszać. Z chwilą pojawienia się pierwszych prążków białkowych dodać pozostałą porcję wywoływacza i całość mieszać do momentu pojawienia się wyraźnych prążków białkowych.

11. Zatrzymać barwienie przez dodanie 25 ml 20% kw. cytrynowego (odczynnik nr 7).

METODA II

Odczynniki

1. Roztwór A (50% metanol, 10% kw. octowy)

2. 30% etanol

3. Roztwór B (20 mg tiosiarczanu sodu na 100 ml H₂O)

4. Roztwór C ( 5 ml 25% glutaraldehydu + 95 ml H₂O)

5. Roztwór D (200 mg AgNO₃ + 75 μl 37% formaldehydu + 100 ml H₂O)

6. Roztwór E (6g Na₂CO₃ + 50 μl 37% formaldehydu + 200 μl tiosiarczanu z wyjść. r-ru 20 mg na 10 ml H₂O - dopełnić wodą do 100 ml)

Uwaga! Roztwory B, C, D i E przygotować bezpośrednio przed użyciem. Barwienie wykonywać w kuwecie przeznaczonej wyłącznie do tego celu.

Wykonanie ćwiczenia

1. Żel poliakrylamidowy po elektroforezie utrwalać przez 3 x 1 godz. lub przez noc w 100 ml roztworu A.

2. Dodać 100 ml 30% etanolu i mieszać przez 1 godz.

3. Dodać 100 ml roztworu B i mieszać przez 1 min.

4. Dodać 100 ml roztworu C i mieszać przez 30 min.

5. Płukać 3 x 20 sek. w 100 ml wody destylowanej.

6. Barwić w 100 ml roztworu D, stale mieszając przez 20 min.

7. Płukać 3 x 20 sek. w 100 ml wody destylowanej.

8. Dodać 100 ml roztworu E (wywoływacza barwy) i mieszać do momentu pojawienia się wyraźnych prążków białkowych.

9. Płukać 3 x 20 sek. w 100 ml wody destylowanej.

10. Zatrzymać barwienie przez dodanie 100 ml roztworu A na 10 min.

11. Przepłukać żel wodą i wysuszyć.

ILOŚCIOWE OZNACZANIE BIAŁKA

METODY SPEKTROFOTOMETRYCZNE

Białka charakteryzują się zdolnością absorpcji promieniowania ultrafioletowego, której maksimum przypada na fale o długości 280nm oraz 235nm. Wiąże się to z obecnością aminokwasów aromatycznych (tyrozyna, tryptofan) oraz wiązań peptydowych w łańcuchu polipeptydowym. Na wartość absorpcji mogą wpływać zanieczyszczenia kwasami nukleinowymi, dla których maksimum absorpcji promieni UV przypada na fale o długości 260nm.

Metoda Beavena i Holidaya

Zasada metody polega na spektrofotometrycznym pomiarze absorpcji promieni UV o długości 280 nm oraz 260 nm, przez jednocentymetrową warstwę badanego roztworu białka. Uzyskane wartości podstawia się do wzoru i oblicza stężenie białka w mg/ml:

C_{białka(mg/ml)} = 1,55 A₂₈₀ - 0,76 A₂₆₀

Metoda ta obarczona jest pewnym błędem, wynikającym z różnej zawartości aminokwasów aromatycznych w różnych białkach oraz zanieczyszczeń kwasami nukleinowymi.

Metoda Whitakera i Granuma

Jest to metoda spektrofotometrycznego oznaczenia stężenia białka, w której wykonuje się pomiar absorpcji promieni UV o długości fali 280 nm oraz 235 nm. Otrzymane wartości absorpcji podstawia się do wzoru i oblicza stężenie białka w mg/ml.

W oznaczeniach stężenia białka tą metodą nie przeszkadza obecność kwasów nukleinowych, dla których wartość absorpcji fal świetlnych o długości 235 nm i 280 nm jest taka sama.

Odczynniki

Roztwory badanych białek.

Wykonanie ćwiczenia

Przeprowadzić spektrofotometryczny pomiar absorpcji promieni UV przez badany roztwór białka przy trzech długościach fal 235 nm, 260 nm oraz 280 nm. Pomiar wykonać względem próby kontrolnej (bufor lub H₂O dest. bez białka). Jeśli zaistnieje konieczność, (tzn. wielkość absorpcji przekracza 1), należy próbkę białka rozcieńczyć, a następnie uwzględnić to przy obliczaniu jego stężenia. Znając wartość absorpcji (A) obliczyć stężenie białka według podanych wyżej wzorów.

METODA KOLORYMETRYCZNA

Metoda Bradford

Metoda ta pozwala na szybkie oznaczenie stężenia białka w roztworze. W metodzie Bradford wykorzystywana jest zdolność białka do tworzenia kompleksu z barwnikiem zwanym błękitem Coomassie (Coomassie Brilliant Blue). Błękit Coomassie
w środowisku kwaśnym posiada zabarwienie brunatne, które zmienia się na błękitne w reakcji z białkiem. Natężenie barwy jest proporcjonalne do stężenia białka. Absorpcję powstałego kompleksu barwnego odczytuje się w zakresie światła widzialnego przy długości fali 595 nm.

Odczynniki

1. Odczynnik Bradford (preparat handlowy)

2. Roztwór wzorcowy albuminy wołowej o stężeniu 100μg/ml

3. Roztwór badanego białka

Wykonanie ćwiczenia

a) wykreślenie krzywej wzorcowej

Przygotować 8 ponumerowanych probówek, do których odmierzyć (według tabeli) następujące ilości roztworu białka wzorcowego i wody destylowanej:

Nr probówki	1	2	3	4	5	6	7	8
Wzorzec albuminowy (μl)	20	40	80	100	120	160	200	0
Woda (μl)	780	760	720	700	680	640	600	800
Ilość białka w próbie (μg)	2	4	8	10	12	16	20	0

Do wszystkich probówek dodać po 0,2 ml odczynnika Bradford i dokładnie wymieszać.

Po upływie 5 min, zmierzyć absorpcję w kolorymetrze przy długości fali 595nm.

Pomiarów dokonywać względem próby kontrolnej (nr 8). Wykreślić krzywą wzorcową odkładając na osi odciętych (X) stężenia białka, a na osi rzędnych (Y) wartości absorpcji.

b) wykonanie pomiaru w badanej próbce białka.

Do dwóch probówek odmierzyć 2 - 20 μl badanego roztworu białka (zgodnie z zaleceniami prowadzącego ćwiczenia) i uzupełnić wodą do objętości 0,8 ml. Do wszystkich probówek dodać po 0,2 ml odczynnika Bradford i dokładnie wymieszać. Po upływie 5 min, zmierzyć absorpcję w kolorymetrze przy długości fali 595 nm.

Stężenie białka odczytać z przygotowanej krzywej wzorcowej.

ILOŚCIOWE OZNACZANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH

METODA SPEKTROFOTOMETRYCZNA

Kwasy nukleinowe charakteryzują się zdolnością absorpcji promieniowania ultrafioletowego, której maksimum przypada na fale o długości 260 nm. Na wartość absorpcji mogą wpływać zanieczyszczenia białkami, dla których maksimum absorpcji promieni UV przypada na fale o długości 280 nm i 235 nm. Zasada metody polega na spektrofotometrycznym pomiarze absorpcji promieni UV o długości 260 nm, przez jednocentymetrową warstwę badanego roztworu kwasu nukleinowego i obliczeniu jego stężenia wiedząc że, absorpcja (A) o wartości A = 1 odpowiada około 50 μg/ml dwuniciowego dsDNA, około 33 μg/ml jednoniciowego ssDNA oraz około 40 μg/ml jednoniciowego ssRNA i 20 -30 μg/ml oligonukleotydów.

Przykład oznaczenia stężenia RNA

Objętość próbki RNA: 100 μl

Rozcieńczenie: 10 μl próbki RNA + 490 μl dest. wody (rozcieńczenie 1/50)

A₂₆₀ rozcieńczonej próbki = 0.55

Stężenie RNA = 40 μg/ml x A₂₆₀ x rozcieńczenie

= 40 μg/ml x 0.55 x 50

= 1100 μg/ml

Całkowita ilość RNA = stężenie x objętość próbki w ml

= 1100 μg/ml x 0,1

= 110 μg RNA

Ponieważ tak roztwory DNA jak i RNA częściowo absorbują światło przy długości fali 280nm, a roztwory białek częściowo pochłaniają światło również przy długości fali 260 nm, stosunek odczytu przy długości fali 260 nm i 280 nm (A₂₆₀/A₂₈₀) informuje o czystości kwasów nukleinowych. W przypadku dobrej izolacji wartość A₂₆₀/A₂₈₀ dla DNA wynosi 1,8 - 2,0, a dla RNA 1,9 - 2,1.

Odczynniki

Roztwory badanych kwasów nukleinowych.

Wykonanie ćwiczenia

Przeprowadzić spektrofotometryczny pomiar absorpcji promieni UV przez badany roztwór kwasu nukleinowego przy dwóch długościach fal 260 nm oraz 280 nm. Pomiar wykonać względem próby kontrolnej (bufor lub H₂O). Jeśli zaistnieje konieczność (tzn. wielkość absorpcji przekracza 1), należy próbkę kwasu nukleinowego rozcieńczyć (najlepiej wodą), a następnie uwzględnić to przy obliczaniu jego stężenia. Znając wartość absorpcji (A) obliczyć czystość i stężenie badanego kwasu nukleinowego.

ILOŚCIOWE OZNACZANIE RYBOSOMÓW

Stężenie rybosomów w zawiesinie oznacza się spektrofotometrycznie przez pomiar absorpcji przy długości fali 260 nm. Otrzymaną wartość absorpcji podstawia się do wzoru i oblicza stężenie rybosomów w mg/ml.

C rybosomów w mg/ml = ( A₂₆₀ X rozcieńczenie ) : 11

Odczynniki

Roztwory badanych rybosomów

Wykonanie ćwiczenia

Przeprowadzić spektrofotometryczny pomiar absorpcji promieni UV przez badany roztwór rybosomów przy długości fali 260 nm. Pomiar wykonać względem próby kontrolnej (bufor lub H₂O). Jeśli zaistnieje konieczność, (tzn. wielkość absorpcji przekracza 1), należy próbkę rybosomów rozcieńczyć (zwykle konieczne jest rozcieńczenie 1000 lub 2000-krotne). Znając wartość absorpcji (A) obliczyć stężenie rybosomów według podanego wyżej wzoru.

WYSALANIE BIAŁEK

Dzięki obecności grup polarnych w białkach, następuje wiązanie cząsteczek wody, które wytwarzają tzw. płaszcz hydratacyjny. Dodanie niektórych soli (np. siarczanu amonu bądź siarczanu magnezu) do roztworu białka, powoduje jego odwodnienie, co prowadzi do wytrącenia białka z roztworu. Proces ten nosi nazwę wysalania. Wysolone białko można ponownie rozpuścić w wodzie lub w odpowiednim buforze bez straty jego właściwości biologicznych. Dzięki temu wysalanie białek stosuje się często w praktyce jako jeden
z etapów ich łagodnego wydzielania z roztworu. Aby uzyskać określony stopień nasycenia siarczanem amonu, należy dokładnie znać objętość badanego roztworu i na podstawie załączonej tabeli (patrz strona 54) odważyć potrzebną ilość gramów soli. Podczas procedury wysalania białek ważna jest znajomość temperatury roztworu. Wytrącone białka obserwuje się jako bezpostaciowe lub kłaczkowate osady zawierające pewną ilość soli, która wpływa ujemnie na pomiar stężenia białka. Usunięcie soli z roztworu białka możliwe jest poprzez dializę.

DIALIZA BIAŁEK

Metoda dializy pozwala m.in. na usunięcie soli i innych związków niskocząsteczkowych z roztworu białka oraz zmianę buforu w którym białko jest zawieszone.

Materiały i odczynniki

2% roztwór węglanu sodu

0,5 M roztwór EDTA, pH 8,0

Rozwór badanego białka

Roztwór dializacyjny (zgodnie z zaleceniami prowadzącego)

Celulozowe „węże” do dializy

Zaciski do „węży” dializacyjnych

Wykonanie ćwiczenia

1. Uciąć potrzebną długość „węża” dializacyjnego i gotować przez 10 minut w 200 ml 2% roztworu węglanu sodu z dodatkiem 1 mM EDTA w celu usunięcia metali ciężkich i siarczków. Długość „węża” obliczyć następująco:

- długość dializowana (mm) = [poj.(w μl) x 3,2] / [szer. „węża”² (w mm²)]

- dodać 10 % długości dializowanej

- dodać 4 cm na zaciski

2. Po oziębieniu, dokładnie przepłukać „węże” wodą destylowaną (tak przygotowane „węże” można przechowywać w wodzie z dodatkiem substancji konserwujących, np. NaN₃ w 4⁰C).

3. Jeden koniec przygotowanego „węża” zamknąć zaciskiem tak, aby wystawał on co najmniej na 1 cm. Otrzymany woreczek wypełnić wodą destylowaną w celu sprawdzenia jego szczelności.

4. Po wylaniu wody, napełnić woreczek roztworem białka przygotowanym do dializy.
   Z niewypełnionej części woreczka usunąć powietrze ściskając delikatnie woreczek nad płynem.

5. Zamknąć zaciskiem drugi koniec „węża” i umieścić woreczek w roztworze dializacyjnym. Dializę należy prowadzić, przy stałym mieszaniu, w temperaturze 4⁰C.

6. Roztwór dializacyjny powinien być zmieniany co najmniej 3 razy w trakcie trwania dializy. Zaleca się wymianę po upływie 2-4 godzin, 6-8 godzin i 10-14 godzin. Całkowita objętość roztworu powinna być ok. 100 razy większa niż objętość próbki białkowej.

7. Po zakończeniu dializy, zdjąć jeden zacisk, otworzyć woreczek i usunąć próbkę
   za pomocą pipety.

TABELA WYSYCEŃ (NH_4­­)₂SO₄ (temp. pokojowa)

		Końcowe nasycenie siarczanem amonu w %
		10	20	25	30	33	35	40	45	50	55	60	65	70	75	80	90	100
Nasycenie początkowe %		Ilość gramów siarczanu amonu, którą należy dodać do 1 dm^3 roztworu
	0	56	114	144	176	196	209	243	727	313	351	390	430	472	516	561	662	767
	10		57	86	118	137	150	183	216	251	288	326	365	406	449	494	592	694
	20			29	59	78	91	123	155	189	225	262	300	340	382	424	520	619
	25				30	49	61	93	125	158	193	230	267	307	348	390	485	583
	30					19	30	62	94	127	162	198	235	273	314	356	449	546
	33						12	43	74	107	142	177	214	252	292	333	426	522
	35							31	63	94	129	164	200	238	278	319	411	506
	40								31	63	97	132	168	205	245	285	375	469
	45									32	65	99	134	171	210	250	339	431
	50										33	66	101	137	176	214	302	392
	55											33	67	103	141	179	264	353
	60												34	69	105	143	227	314
	65													34	70	107	190	275
	70														35	72	153	237
	75															36	115	198
	80																77	157
	90																	79

Uwaga ! Przystępując do wysalania białek w temperaturze 4⁰C należy pomnożyć wyliczoną z Tabeli ilość gramów siarczanu amonu przez współczynnik 0,92, który uwzględnia zmniejszoną rozpuszczalność tego związku w niższej temperaturze.

Przykład : Jeżeli procedurę wysalania białka (0% - 50% nasycenia) prowadzimy w temp. 4⁰C, wówczas na 1 dm³ roztworu białka należy przygotować odważkę 288g (313 g Ⴔ 0,92) siarczanu amonu. By zwiększyć nasycenie siarczanem amonu od 50% do 100%, należy odważyć dodatkowo 360g (392 g Ⴔ 0,92) soli.

Tabela 1

Symbole wielokrotności i ułamków dziesiętnych

Symbol	Określenie		Przeliczenie
T G M k h dk d c m μ n p	Tera- Giga- Mega- Kilo- Hekto- Deka- Deci- Centi- Mili- Mikro- Nano- Piko-	10^12 10^9 10^6 10^3 10^2 10^1 10^-1 10^-2 10^-3 10^-6 10^-9 10^-12	1 000 000 000 000 1 000 000 000 1 000 000 1 000 100 10 0,1 0,01 0,001 0,000 001 0,000 000 001 0,000 000 000 001

Tabela 2

Przybliżona molowość i ciężar właściwy stężonych kwasów

Związek	Procent wagowy	Molowość M	Otrzymanie molowego roztworu (ml/l)	Ciężąr właściwy
Kwas azotowy Kwas fosforowy Kwas nadchlorowy Kwas nadchlorowy Kwas octowy Kwas siarkowy Kwas solny	70 85 60 70 99,5 96 37	15,7 14,8 9,2 11,6 17,4 18 12	64 68 109 86 58 56 84	1,42 1,70 1,54 1,67 1,05 1,84 1,19

Tabela 3

Barwy promieniowania widzialnego

Przybliżony zakres długości fali (mμ)	Barwa	Barwa dopełniająca
400-450 450-480 480-490 490-500 500-560 560-575 575-590 590-625 625-750	fioletowa niebieska zielononiebieska niebieskozielona zielona żółtozielona żółta pomarańczowa czerwona	żółtozielona żółta pomarańczowa czerwona purpurowa fioletowa niebieska zielononiebieska niebieskozielona

WYKAZ STOSOWANYCH SKRÓTÓW

AMPS - nadsiarczan amonowy (ang. Ammonium Persulphate)

β-MET - β-merkaptoetanol (ang. β-Mercaptoethanol)

DEPC - pirowęglan dietylu (ang. Diethyl Pyrocarbonate)

DMEM - podłoże do hodowli komórkowych (ang. Dulbecco/Vogt modified Eagle's
Minimal Essential Medium)

dsDNA - dwuniciwy DNA (ang. double stranded DNA)

DTT - ditiotreitol (ang. Dithiothreitol)

EDTA - kwas etylenodwuaminoczterooctowy (ang. Ethylenediaminetetraacetic Acid)

HeLa - linia komórkowa wywodząca się z komórek raka szyjki macicy Henrietty
Lacks (ang. Henrietta Lacks cell)

LB - podłoże do hodowli bakterii (ang. Luria-Bertani medium)

NIH 3T3 - linia komórkowa fibroblastów mysich (ang. National Institute of Health,
3-day Transfer, inoculum 3 x 10⁵ cells)

PAGE - elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (ang. Polyacrylamide Gel
Electrophoresis)

PMSF - sulfofluorek fenylometanu (ang. Phenylmethylsulphonyl Fluoride)

RPMI - podłoże do hodowli komórkowych (ang. Roswell Park Memorial Institute
medium)

SDS - sól sodowa siarczanu dodecylu (ang. Sodium Dodecyl Sulphate)

SDS-PAGE - elektroforeza w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS (ang. Sodium
Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

ssDNA - jednoniciowy DNA (ang. single stranded DNA)

TAE - bufor do elektroforezy DNA/RNA (ang. Tris- Acetate-EDTA)

TCA - kwas trójchlorooctowy (ang. Trichloroacetic Acid)

TEMED - N,N,N',N'-czterometyletylenodiamina (ang. N,N,N',N'-
tetramethylethylenediamine)

Tris - trójhydroksymetyloaminometan; 2-amino-2(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol

UV - promieniowanie ultrafioletowe (ang. Ultraviolet )

LITERATURA

1. Alberts B. i inni, Podstawy biologii komórki, PWN, Warszawa, 2005

2. Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., Biochemia, PWN, Warszawa, 2005

3. Brown T.A., Genomy, PWN, Warszawa, 2001

4. Kłyszejko-Stefanowicz L., Cytobiochemia, PWN, Warszawa, 2002

5. Lewin B., Genes VII, Oxford University Press, 2000

6. Sambrook J., Russell D.W., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
   Laboratory Press, 2001

7. Tuner P.C. i inni, Krótkie wykłady. Biologia molekularna, PWN, Warszawa, 2007

8. Węgleński P., Genetyka molekularna, PWN, Warszawa, 2006

9. Prace oryginalne i artykuły przeglądowe wskazane przez prowadzącego ćwiczenia.

75

a a+α α

---