ENZYMY

1. Enzymy - biokatalizatory - przyspieszają osiągnięcie stanu równowagi reakcji, których zajście z termodynamicznego punku widzenia jest możliwe. Uczestnicząc w przekształcaniu substratu w produkt same nie zużywają się w trakcie reakcji:

a/ znakomita większość znanych dziś enzymów to białka globularne, część z nich

wymaga współpracy z kofaktorami, którymi są drobnocząsteczkowe związki

organiczne mocno wiązane przez enzym - grupy prostetyczne (1), wiążące się z nim

przejściowo w toku reakcji i pełniące często rolę kosubstratów - koenzymy(2) a

także jony metali(3).

b/ w ostatnich dwudziestu latach odkryto, że niektóre kwasy rybonukleinowe mają

również właściwości katalityczne, nazwano je rybozymami, uczestniczą one jednak

tylko w szeroko pojętym procesie ekspresji genu, nie stwierdzono natomiast udziału

rybozymów w podstawowym metabolizmie, którego przebieg jak i forma życia jaką

znamy nie byłyby możliwe bez udziału typowych enzymów białkowych.

2. Kinetyka reakcji chemicznych i czynniki warunkujące jej przebieg:

a/ definicja szybkości reakcji: v = ± dc/dt ≡ - d[S]/dt = d[P]/dt

b/ równanie kinetyczne - v = k•c₁•c₂• ...c_n : określa zależność szybkości reakcji od

• c - stężeń substratów (krzywa kinetyczna reakcji)

• k - stałej szybkości reakcji - k = A•e^-ΔE/R•T - zależność ta uwzględnia wpływ: T - temperatury (jej wzrost przyspiesza przebieg reakcji chemicznych) oraz ΔE - E_akt - energii aktywacji (konieczna do pokonania bariera energetyczna - m.in. zrywanie wiązań chemicznych - utrudniająca zajście każdej reakcji) - analiza profilu energetycznego reakcji - ΔG - efekt energetyczny reakcji (nie ma związku z szybkością reakcji), E_akt - energia stanu przejściowego, im jest ona niższa tym reakcja biegnie szybciej; rola katalizatora - przyspieszenie przebiegu reakcji przez obniżenie E_akt (w wyrażeniu na stałą szybkości reakcji zawiera się wyjaśnienie wpływu działania katalizatora, nie zmienia on stanu równowagi podyktowanego stałą równowagi reakcji ale przyspiesza jego osiągnięcie przez obniżenie energii aktywacji danego procesu)

ENZYMY jako (BIO)KATALIZATORY obniżają E_akt katalizowanej reakcji

3. Cechy charakteryzujące enzymy jako katalizatory:

a/ sprawność (wydajność) katalityczna - zdolność przyspieszania rzędu 106 - 1012 razy, np. reakcja, która w obecności enzymu zwiększającego szybkość 108 razy biegnie 1s w jego nieobecności musiałaby trwać 108s to znaczy TRZY LATA!!!

b/ swoistość - może być względem substratu, względem reakcji lub względem reakcji i substratu; enzymy są znacznie bardziej selektywne niż jakiekolwiek inne katalizatory

c/ działanie w łagodnych warunkach - niskie ciśnienie, temperatura i zakres łagodnych wartości pH (2 - 8, większość aktywna w pH około 7); katalizatory wykonane przez człowieka wymagają często bardzo wysokich ciśnień, temperatur i stężeń H+ lub OH-

d/ aktywność może ulegać regulacji - istnieje szereg enzymów, które zmieniają aktywność stosownie do aktualnych potrzeb komórki czy organizmu pod wpływem czynników środowiskowych (zmiany jakościowe) lub zmienia się ilość enzymu (zmiany ilościowe)

4. Centrum aktywne, miejsce aktywne to ta część cząsteczki, która jest bezpośrednio zaangażowana w reakcji chemicznej. W przypadku prostych cząsteczek, takich jak np. kwasy nieorganiczne w reakcję zaangażowana jest cała cząsteczka. W przypadku dużych i złożonych cząsteczek, takich jak np. enzymy, polimery syntetyczne i niektóre rozbudowane związki metaloorganiczne tylko niewielka część cząsteczki jest rzeczywiście zaangażowana w reakcję a jej reszta pozostaje praktycznie bierna.

W białku centrum aktywne stanowi grupa aminokwasów, które leżą blisko siebie w trójwymiarowej cząsteczce, choć często są od siebie bardzo oddalone w sekwencji. Częstymi aminokwasami centrum aktywnego są aminokwasy zasadowe oraz kwasowe. Aminokwasy z niepolarnym (hydrofobowym) łańcuchem bocznym bardzo rzadko wchodzą w skład centrum aktywnego, ponieważ taki łańcuch boczny wchodzi w niewiele reakcji.

Aminokwasy wchodzące w skład centrum aktywnego są zazwyczaj ewolucyjnie bardziej stabilne niż aminokwasy na innych pozycjach, ponieważ zmiana aminokwasu w tej pozycji mogłaby uniemożliwić enzymowi katalizowanie dotychczasowej reakcji. W wielu enzymach niektóre z aminokwasów centrum aktywnego są identyczne nawet u bardzo słabo spokrewnionych organizmów.

W przypadku polimerów syntetycznych centrum aktywne znajduje się zazwyczaj na końcu cząsteczek, choć w przypadku syntezy polimerów gwiazdowych i dendrymerów centrum aktywne znajduje się najpierw w samym środku cząsteczki a potem ulega "rozmnożeniu" oddalając się jednocześnie od pierwotnego środka. W przypadku szczepionych natomiast centra aktywne są inicjowane w przypadkowych miejscach na łańcuchu głównym polimeru i następnie przenoszą się stopniowo wzdłuż narastających odgałęzień bocznych.

Oprócz enzymów z jednym centrum aktywnym mamy także enzymy allosteryczne. Są to związki mające więcej niż jedno miejsce aktywne, które to miejsca kooperatywnie wiążą cząsteczki substratu, dzięki czemu związanie substratu w jednym miejscu aktywnym indukuje w enzymie zmianę konformacyjną, zmieniającą powinowactwo do substratu w innych miejscach aktywnych. Ten typ enzymów może występować w formie białka złożonego z wielu podjednostek, z których każda ma miejsce aktywne. Poza tym enzymy allosteryczne mogą być kontrolowane przez cząsteczki efektorowe (aktywatory i inhibitory), które wiążą się do innych miejsc niż miejsca aktywne i zmieniają szybkość aktywności enzymatycznej.

5. Enzymy - tworzenie kompleksu enzymu z substratem, ES: tak wielką sprawność, wydajność katalityczną enzymy uzyskują dzięki tworzeniu przejściowego połączenia z substratem tzw. kompleksu ES; pozwala to na pokonanie barier termodynamicznych i fizykochemicznych utrudniających zajście reakcji a mianowicie:

a/ rozproszenia i ruchliwości cząsteczek substratów oraz znacznej przypadkowości

zderzeń w sensie kontaktu reaktywnych ugrupowań substratów (niska efektywność

zderzeń) - enzym „porządkuje” stan substratu(ów) pokonując te efekty entropowe

b/ uwodnienia substratu co w przypadku reakcji biegnących w środowisku wodnym jest

zjawiskiem powszechnym - enzym lokując substrat(y) w obszarze o charakterze

hydrofobowym pozbawia go(je) płaszcza wodnego odsłaniając na działanie swoich

aktywnych grup

c/ stabilności utrwalonej struktury substratu - enzym wytwarza w substracie napięcia,

naprężenia, odkształcenia co powoduje labilizację, osłabienie wiązań, które mają

ulec zerwaniu

6. Enzym wiąże się z substratem w kompleks ES w wyniku zaistnienia wielu odwracalnych, słabych oddziaływań rzędu ułamków do kilku kilokalorii wywołując efekt energetyczny, energię wiązania ES wielkości kilku do kilkunastu kilokalorii; część tej energii, uwalnianej w trakcie tworzenia ES wykorzystywana jest np. do wywołania naprężeń, napięć w substracie służąc w ten sposób m.in. zmniejszeniu energii aktywacji danej reakcji (obliczenie oparte na zależności podanej w punkcie 2b pozwala wykazać, ze obniżenie aktywacji o 15-20 kcal/mol zwiększa stałą szybkości reakcji (k) a tym samym szybkość reakcji (v) ~1014 razy!). Mechanizm działania enzymów polega na stworzeniu z określonym związkiem chemicznym nietrwałego połączenia, w trakcie którego następuje rozłożenie substancji chemicznej do substancji prostej i wchłoniecie jej przez komórkę oraz uwolnienie substancji enzymatycznych.

7. Enzym - centrum aktywne - kompleks ES tworzy się przez przyłączenie substratu do wyróżnionego miejsca w strukturze enzymu określanego jako miejsce aktywne, które charakteryzuje się następującymi własnościami:

a/ obejmuje niewielką część całkowitej objętości enzymu

b/ jest trójwymiarową strukturą, którą często tworzą bardzo odległe sekwencyjnie aminokwasy (np. chymotrypsyna)

• istnieją centra aktywne jakby przygotowane na przyjęcie danego substratu - aprioryczne dopasowanie (np. lizozym, chymotrypsyna)

• centra aktywne innych enzymów tworzą się w trakcie wiązania substratu - indukowane dopasowanie (np. karboksypeptydaza A)

c/ stanowi zagłębienie w strukturze enzymu (niszę, szczelinę, kieszeń) dzięki czemu otoczenie wiązanego substratu ma charakter hydrofobowy i jest mniej lub bardziej izolowane od wody

d/ substrat wiązany jest poprzez wiele oddziaływań nie kowalencyjnych jak hydrofobowe, jonowe, wodorowe czy van der Waalsa a swoistość wiązania substratu uzależniona jest w efekcie od precyzyjnego ułożenia i dopasowania wielu atomów centrum aktywnego i substratu

e/ w jego skład wchodzą:

• aminokwasy odpowiedzialne za związanie substratu, określające tym samym swoistość substratową (1-szy etap procesu katalizy) oraz

• aminokwasy uczestniczące w katalizie, tzw. centra katalityczne określające swoistość reakcji (2-gi etap procesu katalizy)

8. Kompleks enzym-substrat - dowody na istnienie:

a/ zmiany właściwości fizykochemicznych enzymu w tym m.in. rozpuszczalności czy

widma pochłaniania promieniowania elektromagnetycznego po związaniu substratu

b/ badania rentgenograficzne pozwalają czasami obserwować inne formy krystaliczne

samego enzymu i jego kompleksu z substratem lub analogiem substratu

c/ w przypadku dużych struktur można niekiedy oglądać połączenie enzymu z

substratem w mikroskopie elektronowym

d/ kinetyka reakcji enzymatycznych również potwierdza tworzenie się kompleksu ES

9. Kinetyka reakcji enzymatycznych:

a/ założenia Michaelisa - Menten (M-M):

• tworzenie się kompleksu enzym-substrat - E∗S

• reakcja jednosubstratowa - E + S ↔ E∗S ↔ E∗P ↔ E + P analiza przebiegu reakcji w początkowym (v_o), bardzo krótkim przedziale czasu; tylko wówczas znamy stężenie substratu ([S_o]) i można pominąć wpływ bardzo niskiego stężenia produktu a powyższa reakcja upraszcza się do - k₁ k₂

E + S ↔ E∗S → E + P

k_-1

• stężenie molowe substratu wielokrotnie wyższe niż stężenie molowe enzymu, utrzymuje się tzw. stan stacjonarny - stałe stężenie kompleksu E∗S przy zmieniających się stężeniach substratu (maleje) i produktu (wzrasta)

b/ analiza stanu stacjonarnego - stanu zrównoważonych szybkości tworzenia i rozpadu E∗S - prowadzi do zależności początkowej szybkości reakcji enzymatycznej (v_o) od początkowego stężenia substratu ([S_o]): V_max • [S_o] v_o = K_m = k_-1 + k₂ / k₊₁ - stała M-M, V_max - szybkość maksymalna K_m + [S_o] wykresem tej zależności v_o od [S_o] jest krzywa hiperboliczna

c/ znaczenie poszczególnych parametrów kinetycznych reakcji enzymatycznej:

• K_m - określa powinowactwo substratu do enzymu; stężenie substratu, przy

którym szybkość reakcji równa się 0.5•V_max; jednostki stężenia [=] M;

najczęstsze wartości w zakresie stężeń μM-mM

• k₂ ≡ k_kat - stała szybkości reakcji powstawania produktu, tzw. liczba obrotów - ilość moli produktu tworzonych w jednostce czasu (s) przez jeden mol enzymu; jednostki odwrotności czasu [=] s^-1, wartości wahają się w granicach od rzędu 10⁶ do mniejszych niż 1

• V_max - maksymalna prędkość katalizowanej reakcji przy danym stężeniu enzymu - aktywność enzymu; jednostki stężenia/czas, najczęściej stosowane μM/s lub mM/s

• k_kat /K_m - najlepiej określa skuteczność enzymu, jego sprawność przy stężeniach substratu znacznie poniżej wartości K_m (odpowiada to często warunkom fizjologicznym); dla najskuteczniejszych enzymów k_kat /K_m ≈ k₁ co oznacza, że wydajność katalizowanych przez nie reakcji jest ograniczona jedynie dyfuzją cząsteczek w roztworze i nie może przekroczyć wartości 10⁸-10⁹ M^-1s^-1

• wyznaczanie wartości K_m i V_max - stosowanie odwróconej postaci zależności M-M; wyrażenie Lineweavera-Burka - 1/v_o = 1/V_max + K_m/V_max • 1/[S_o] - wykres zależności 1/v_o od 1/[S_o] to linia prosta z charakterystycznymi punktami przecięcia osi 1/[S_o] = -1/ K_m a osi 1/v_o = 1/V_max

10. Wyznaczanie i sposoby wyrażania aktywności enzymów - konieczność znajomości i stosowania optymalnych warunków przebiegu reakcji katalizowanej przez dany enzym:

a/K_m - stosuje się wysycające stężenia substratów - [S] > K_m

b/ niezbędne kofaktory - indywidualny dobór rodzaju i stężeń

c/ pH - indywidualna zależność

d/ temperatura (T) - zasadniczo jednakowa zależność dla większości enzymów z

maksimum aktywności dla około 40^oC

e/ jednostki aktywności:

• jednostki międzynarodowe (IU, U): 1U to aktywność wytwarzająca 1μmol produktu/min

• katale: 1kat to aktywność wytwarzająca 1 mol produktu/s; 1katal=6•10⁷ U, 1U=16.67 nKat

11. Kinetyka niehiperboliczna:

• wiele enzymów nie wykazuje hiperbolicznej zależności v_o od [S_o], wykres ma najczęściej kształt sigmoidalny (przypomina krzywą wysycenia Hb tlenem) co generalnie sygnalizuje zjawisko allosterii z dodatnią kooperacją co najmniej dwóch centrów aktywnych - są to tzw. enzymy allosteryczne, zbudowane zasadniczo z wielu identycznych lub różnych podjednostek, które współpracują, kooperują ze sobą (patrz HEMOGLOBINA p. 8 i 9)

• zależność v_o od [S_o] dla enzymów allosterycznych najlepiej opisuje wyrażenie Hilla - v_o/V_max = [S_o]ⁿ/(K_0.5) ⁿ + [S_o]ⁿ - gdzie K_0.5 odpowiada K_m dla enzymów M-M, a n (n_H) to współczynnik kooperacji Hilla; gdy wartość n_H > 1 krzywa wykazuje typowy dla niemal wszystkich enzymów allosterycznych kształt sigmoidalny (wyraz kooperacji pozytywnej (patrz też Y w funkcji pO₂ dla Hb)); natomiast gdy n_H = 1 to otrzymujemy zależność M-M !; wykres Lineweavera-Burka (1/v_o od 1/[S_o]) dla enzymów allosterycznych nie jest linia prostą!

• efektory allosteryczne - inne niż substrat(y) ligandy enzymów allosterycznych, które wiążąc się do enzymu odwracalnie w miejscach innych niż centrum(a) aktywne zmieniają ich aktywność względem katalizowanej reakcji:

- inhibitory allosteryczne - zmniejszają aktywność enzymu - krzywa sigmoidalna „przesuwa się w prawo” (kładzie się)

- aktywatory allosteryczne - zwiększają aktywność enzymu - krzywa sigmoidalna „przesuwa się w lewo” (podnosi się)

• modele funkcjonowania enzymów allosterycznych:

- jednoprzejściowy (Monod-Wyman-Changeau) zakłada, że efektor allosteryczny wiążąc się do jednej tylko podjednostki wywołuje analogiczne zmiany powinowactwa i aktywności wszystkich podjednostek danego enzymu

- sekwecyjny (Koshlanda) zakłada, że efektor allosteryczny wiążąc się do jednej podjednostki wywołuje zmiany powinowactwa aktywności tej podjednostki i nic nie potrafimy powiedzieć na temat charakteru zmian powinowactwa i aktywności pozostałych podjednostek danego enzymu

• enzymy allosteryczne ”klasy K” - efektory allosteryczne nie zmieniają szybkości maksymalnej V_max z jaką enzym katalizuje daną reakcję natomiast inhibitor allosteryczny zmniejsza aktywność takiego enzymu poprzez zwiększanie wartości K_0.5 dla substratu(ów) a aktywator allosteryczny zwiększa aktywność enzymu poprzez zmniejszenie K_0.5 - zdecydowana większość enzymów allosterycznych naturalnie funkcjonujących w żywych organizmach należy do ”klasy K”

12. Kontrola aktywności enzymów występująca w organizmie:

a/ zwiększenie lub zmniejszenie efektywności ekspresji genu(ów) kodującego(ych) enzym - synteza enzymu lub jej zahamowanie (zmiana ilości enzymu)

b/ aktywacja zymogenowa - aktywacja enzymu syntetyzowanego i występującego w postaci nieaktywnego proenzymu (zymogenu); dotyczy m.in. enzymów proteolitycznych przewodu pokarmowego jak pepsynogen (pepsyna), trypsynogen (trypsyna), chymotrypsynogen (chymotrypsyna), proelastaza (elastaza) czy kaskady krzepnięcia krwi (protrombina -trombina) i polega na usunięciu różnej długości fragmentów łańcuchów polipeptydowych tych proenzymów

c/ regulacja aktywności enzymów allosterycznych poprzez efektory allosteryczne, których stężenia zmieniają się w trakcie przemian zachodzących w organizmie

d/ modyfikacja kowalencyjna - regulacja aktywności enzymu występującego w komórce poprzez odwracalne, kowalencyjne przyłączanie do łańcuchów bocznych niektórych aminokwasów czynnika modyfikującego: głównie jest to fosforylacja grup hydroksylowych seryn, treonin lub tyrozyn ale także pierścienia imidazolowego histydyny

13. Hamowanie aktywności enzymów czynnikami (inhibitory) nie będącymi naturalnymi składnikami środowiska katalizowanych przez nie reakcji:

a/ inhibicja nieodwracalna - najczęściej kowalencyjna modyfikacja łańcuchów bocznych aminokwasów centrum aktywnego lub katalitycznego, organizm nie posiada enzymów, które mogłyby rozciąć tak powstałe wiązanie, stąd nosi ono charakter trwałego i wyłącza zmodyfikowane cząsteczki enzymu z udziału w katalizie

- aspiryna (kwas acetylosalicylowy) acetyluje serynę (via grupa -OH) centrum aktywnego cyklooksygenazy i wpływa w ten sposób na przemiany kwasu arachidonowego i syntezę związków uczestniczących i towarzyszących szeroko rozumianemu procesowi zapalnemu

- DFP (diizopropylofluorofosforan) i inne halogenopochodne związków fosforoorganicznych (np. sarin - gaz bojowy czy liczne pestycydy) reagują z grupą -OH seryny centrum aktywnego wielu hydrolaz jak np. acetylocholinesterazy, enzymu odpowiedzialnego za hydrolizę acetylocholiny, zahamowanie jego aktywności powoduje utrzymujące się pobudzenie cholinergicznych zakończeń nerwowych; podobne pochodne siarczanów organicznych jak PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu) reagują z grupami - OH reszt seryn licznych proteaz serynowych jak np. trypsyna

- jodooctan lub amid kwasu jodooctowego reagują z grupami -SH łańcuchów bocznych cystein obecnych w centrum aktywnym wielu enzymów; podobną reaktywność wykazują jony metali ciężkich jak rtęci czy ołowiu (Hg+2, Pb+2)

- penicylina należy do inhibitorów przypominających działanie tzw. ”substratów samobójców”- modyfikuje kowalencyjnie centrum aktywne peptydylotransferazy glikopeptydów, której aktywność jest niezbędna licznym szczepom bakterii dla budowania szczelnych ścian komórkowych; penicylina jako analog ”stanu przejściowego” wiąże się efektywnie z centrum aktywnym tego enzymu i tworzy estrowe połączenie z łańcuchem bocznym obecnej tam seryny nie dopuszczając do budowania przez bakterie zabezpieczających je ścian komórkowych

b/ inhibicja odwracalna - przejściowe, odwracalne wiązanie inhibitorów co prowadzi do czasowego wyłączenia cząsteczek enzymów wiążących inhibitor z udziału w katalizie

•hamowanie kompetycyjne - inhibitor wykazuje strukturalne podobieństwo do substratu i konkuruje, współzawodniczy z nim o związanie się w centrum aktywnym (E): wytworzenie kompleksu z inhibitorem (EI) wyłącza enzymu z udziału w katalizie ale wzrost stężenia substratu usuwa efekt działania inhibitora - [S]  vo , VImax = Vmax , KIm = Km•(1+ [I]/Ki) ; analiza wykresów obrazujących zależność v od [S] i 1/v od 1/[S];

poszukiwania inhibitorów kompetycyjnych znajdują się w centrum

zainteresowania nauk biomedycznych (na przykład metotreksat i amino-

pteryny jako inhibitory przemian kwasu foliowego i syntezy DNA w leczeniu

nowotworów, azaseryna jako analog kwasu glutaminowego i sulfonamidy

jako analogi kwasu p-aminobenzoesowego stosowane w zwalczaniu infekcji

bakteryjnych poprzez blokowanie syntezy kwasu foliowego)

•hamowanie niekompetycyjne (klasyczne) - inhibitor nie wykazuje podobieństwa do substratu i łączy się zarówno z samym enzymem (EI) jak i z kompleksem enzym-substrat (IES) w innym niż substrat miejscu powodując w obu przypadkach wyłączenie enzymu z udziału w katalizie, spadek jego aktywności (szybkości maksymalnej), w tym wypadku wzrost stężenia substratu nie wpływa na efekt działania inhibitora - [S] vo , KIm = Km , VImax = Vmax/(1+ [I]/Ki); analiza wykresów obrazujących zależność v od [S] i 1/v od 1/[S]

•hamowanie akompetycyjne - inhibitor nie wykazuje podobieństwa do substratu a łączy się tylko z kompleksem enzym-substrat (IES) w innym niż substrat miejscu powodując wyłączenie enzymu z udziału w katalizie, spadkowi aktywności enzymu (szybkości maksymalnej) towarzyszy spadek Km co najczęściej tłumaczone jest zmniejszonym oddysocjowywaniem substratu pod wpływem inhibitora, w tym wypadku wzrost stężenia substratu zmniejsza szybkość reakcji - [S]  vo , VImax = Vmax/(1 + [I]/Ki), KIm = Km/(1+ [I]/Ki); z tym typem hamowania mamy głównie do czynienia w reakcjach wielosubstratowych; analiza wykresów obrazujących zależność v od [S] i 1/v od 1/[S]

14. Klasyfikacja enzymów z uwzględnieniem koenzymów (grup prostetycznych):

a/ oksydoreduktazy - Aoks + Bred Ared + Boks - reakcje utleniania-redukcji

•dehydrogenazy - AH2 + NAD+ (FAD) A + NADH + H+ (FADH2) koenzymy: NAD+, rzadziej NADP+ - pochodne niacyny, witaminy PP (B3) FAD, rzadziej FMN - pochodne ryboflawiny, witaminy B2 (przykłady - dehydrogenaza mleczanowa i bursztynianowa oraz mechanizmy przenoszenia elektronów z udziałem tych koenzymów) DPT (difosfotiamina) - pochodna tiaminy, witaminy B1 , która wraz z liponianem są niezbędnym elementem funkcjonalnym dehydrogenaz α- ketokwasów (pirogronian, α-ketoglutaran i inne pochodne aminokwasów)

•oksydazy - AH2 + O2 A + H2O2 ; koenzymy: FAD, FMN (przykłady - oksydaza glukozy, oksydazy L- i D-aminokwasów)

•oksygenazy:

- dioksygenazy - AH2 + O2 A(OH) 2 (niezbyt często występujące)

- monooksygenazy - AH + O2 + NADP+ A(OH) + H2O + NAPDH (hydroksylazy); koenzymem obok NADPH + H+ jest hem (cytochrom P450, wiele reakcji przemian steroidów; procesy detoksykacji) a także witamina C (np. reakcja hydroksylacji proliny w trakcie syntezy kolagenu - hydroksylaza proliny)

•peroksydazy - AH2 + H2O2 A + 2H2O ; koenzym - hem (przykład - peroksydaza glutationowa: 2GSH + H2O2 GSSG + 2H2O; enzym z selenocysteiną, uczestniczy w procesach usuwania reaktywnych form tlenu)

•katalaza - H2O2 + H2O2 O2 + 2H2O; koenzym - hem (ważny enzym uczestniczący w procesach usuwania reaktywnych form tlenu)

b/ transferazy - A-B + C A + B-C - reakcje przenoszenia fragmentów substratów

przykładem transferaz są kinazy, enzymy przenoszące resztę fosforanową (-P), której

najczęstszym donorem (kosubstratem) jest ATP- adenozynotrifosoforan: gluko- lub

heksokinaza katalizują reakcję: glukoza + ATP glukozo-6-P + ADP koenzymy: DPT (difosfotiamina) - pochodna tiaminy, witaminy B1 (transketolazy) PLP( fosforan pirydoksalu) - pochodna pirydoksaminy, witaminy B6 (aminotransferazy) KoA (koenzym A) - pochodna kwasu pantoteinowego, witaminy B5 (przenoszenie reszt acetylowych - CO(CH3) i acylowych - CO(R)) THF (tetrahydrofolian) - pochodna kwasu foliowego (przenoszenie licznych tzw. fragmentów jednowęglowych) metylokobalamina - pochodna cyjankobalaminy, witaminy B12 (metylotransferaza homocysteinowa)

c/ hydrolazy - A-B + H2O A-H + B-OH - reakcje hydrolitycznego rozczepienia substratów: np. proteinazy i peptydazy - hydroliza wiązania peptydowego białek i peptydów (chymotrypsyna, trypsyna, kolagenazy i inne); glikozydazy - hydroliza wiązania glikozydowego oligo- i polisacharydów (przykładem jest lizozym); esterazy jak choćby fosfatazy - glukozo-6-P + H2O glukoza + Pi (fosfataza glukozo-6-P), nukleazy - hydroliza wiązań fosfodiestrowych w DNA i RNA czy lipazy - hydroliza

wiązań estrowych estrów kwasów karboksylowych

d/ liazy - A-B A + B - reakcje rozczepienia lub tworzenia wiązań na innej drodze niż hydroliza czy reakcje redoks przykładem liaz są: dehydrataza węglanowa (Zn+2) - H2O + CO2 HCO3 + H+ czy dekarboksylaza pirogronianowa, której koenzymem jest DPT (difosfotiamina) a także liczne dekarboksylazy współpracujące z PLP (fosforanem pirydoksalu) jako koenzymem

e/ izomerazy - A izo-A - reakcje przekształcenia substratu w jego izomer przykładem może być izomeraza fosfotrioz katalizująca reakcje: aldehyd-3-fosfoglicerynowy fosfodihydroksyaceton a także mutaza metylomalonylo-KoA współpracująca z deoksyadenozylokobalaminą jako koenzymem (pochodna witaminy B12)

f/ ligazy - A + B + ATP A-B + ADP + Pi - reakcje łączenia substratów (tworzenia

wiązań) w sprzężeniu z hydrolizy związku ”wysokoenergetycznego) przykładem ligaz (zwanych czasami syntetazami) są karboksylazy współpracujące często z biotyną jako koenzymem, jak choćby karboksylaza pirogronianowa: pirogronian + CO2 + ATP szczawiooctan + ADP + Pi

15. Strategie katalityczne najczęściej wykorzystywane w reakcjach enzymatycznych:

a/ ogólna kataliza kwasowo-zasadowa - wykorzystanie możliwości przekazywania jonu H+ pomiędzy substratem i łańcuchami bocznymi niektórych aminokwasów - przykład hydrolitycznego rozczepiania przez rybonukleazę wiązań fosfodiestrowych w RNA (rola histydyny) oraz przez lizozym wiązań glikozydowych w polisacharydach ścian bakteryjnych (rola glutaminianu i asparaginianu, optimum pH)

b/ kataliza kowalencyjna - tworzenie przejściowego tetraedrycznego połączenia enzymu z substratem (produktem) reakcji co umożliwia rozerwanie wiązania w powstanie kowalencyjnego intermediatu enzym-substrat (produkt) i uwolnienie ostatecznego produktu - przykład hydrolitycznego rozczepiania przez chymotrypsynę niektórych wiązań peptydowych w białkach (centrum aktywne - miejsce wiązania substratu; centrum katalityczne - rola triady katalitycznej ”asparaginian 102histydyna 57seryna 195”, nukleofilowy atak tlenu grupy -OH ”aktywnej seryny” na węgiel wiązania peptydowego)

c/ kataliza z udziałem jonów metali - wykorzystanie jonów niektórych metali do jonizacji H2O i dzięki temu wytworzeniu warunków do zajścia katalizy nukleofilowej - przykład syntezy kwasu węglowego przez dehydratazę węglanową (liaza) z udziałem jonów Zn+2 (rola histydyn w koordynacji jonu)oraz ataku nukleofilowego grupy wodorotlenowej na węgiel CO2 z ostatecznym wytworzeniem jonu wodorowęglanowego (HCO3 ) i jonu H+

15. Zymogeny i proenzymy - mechanizm aktywacji

Wiele białek jest syntetyzowanych w postaci nieaktywnych prekursorów określanych jako probiałka. W przypadku gdy białka te są enzymami ich probiałka nazywane są proenzymami lub zymogenami ( dawniej tak nazywane). Przekształcenie białek w aktywne białka następuje w wyniku jedno- lub kilkustopniowej proteolizy. Białkami syntetyzowanymi w formie probiałek są np. insulina (probiałko = proinsulina), enzymy trawienne: pepsyna, trypsyna, chymotrypsyna ( odpowiednie probiałka = pepsynogen, trypsynogen, chymotrypsynogen), czynniki krzepnięcia krwi i fibrynolizy oraz białko tk. łącznej - kolagen (probiałko = prokolagen). Podczas gdy jedne białka są wykorzystywane w organizmie stale, inne (np. enzymy krzepnięcia krwi i fibrynolizy) tylko czasami, ale wówczas enzymy te sa potrzebne natychmiast. Do zachowanie homeostazy musza być one skoordynowane w czasie ponadto synteza proteaz w formie nieaktywnych prekursorów chroni tk. w których są one wytwarzane (np. trzustkę) przed samotrawieniem. Synteza de novo niezbędnych w danym momencie białek, nawet przy założeniu dostępności puli aminokwasów, mogłaby przebiegać niewystarczająco szybko w stosunku do potrzeb organizmu np. utraty krwi. Również sam proces wydzielania mógłby być zbyt wolny.

Przekształcenie probiałek w fizjologicznie czynne białka przebiega wg. następujących zasad:

1. Przekształcenie polega na swoistej proteolizie, która może dotyczyć hydrolizy tylko pojedynczego wiązania.

2. Produkty proteolizy mogą zastać rozdzielone lub pozostać razem w ostatecznym białku.

3. Proces może (lub nie) prowadzić do znacznej zmiany masy cząsteczkowej.

4. Podstawową konsekwencją swoistej proteolizy jest nowa konformacja.

5. Jeśli pobiałko jest enzymem, to zmiana konformacji powoduje powstawanie miejsca katalitycznego.

Przekształcenie chymotrypsynogenu, 245-aminokwasowego polipeptydu, w aktywną α-chymotrypsynę przebiega przez formę pośrednią znaną jako chymotrypsyna π. Swoista, ograniczona proteoliza chymotrypsynogenu umożliwia zbliżenie trzech reszt aminokwasowych tworzących system przekazywania protonu ( „triada katalityczna Ser195 - His57 - Asp102”). W chymotrypsynie α His 57 i Asp 102 znajdują się w łańcuchu B, a Ser 195 - w łańcuchu C.

S ------ S S-----S S-------S

S S S S

W reakcji hydrolizy katalizowanej przez chymotrypsynę szczególną role odgrywają te 3 reszty aminokwasowe, które mimo że zajmują odległe w stosunku do siebie miejsca w sensie struktury pierwszorzędowej, znajdują się w pozycjach pozwalających na tworzenie miedzy nimi wiązań w sensie struktury trzeciorzędowej. Podczas gdy większość naładowanych reszt aminokwasowych umiejscowiona jest na zewnątrz cząsteczki, 3 oddziałujące ze sobą reszty znajdują się w niepolarnym wnętrzu cząsteczki. Aminokwasem, który ulega acylacji w reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę jest Ser 195. Zbliżenie anionu octanowego do tlenu gr. OH Ser 195 wyzwala reakcje przeniesienie protonu z Ser 195 poprzez His 57 na Asp 102. to przeniesienie zwiększa reaktywność tlenu Ser, co przyspiesza szybkość acylacji. Podczas deacylacji protony przekazywane są w przeciwnym kierunku, co umożliwia uwalnianie grup acylowych i odtwarzanie Ser 195.

16. Mechanizm aktywacji kinazy białkowej A

Kinaza białkowa A (PKA) jest zależną od cAMP kinazą białkową fosforyzującą białka na serynie bądź treoninie. PKA jest zbudowana z czterech podjednostek, dwu regulacyjnych (R) i dwu katalitycznych (C). Podjednostki regulacyjne różnią się składem aminokwasowym i masą cząsteczkową ( 49 - 58 kDa), natomiast podjednostki katalityczne są podobnej wielkości (40 kDa). Wszystkie podjednostki regulacyjne posiadają podobną budowę domenową. Poczynając od N-końca wyróżnia się domenę hydrofilową odpowiedzialną za tworzenie dimeru R-R, następnie domenę antygenową rozpoznawaną przez swoiste przeciwciała, region pseudosubstratowy odpowiedzialny za wiązanie jednostki pseudokatalitycznej oraz dwie domeny wiążące cAMP, jedną wewnątrz cząsteczki R a drugą przy jej C-końcu.

W podjednostkach katalitycznych wyróżnia się domenę wiążącą ATP (źródło reszty fosforanowej), znajdującą się na N-końcu łańcucha peptydowego (15-127 aa), domenę odpowiedzialną za wiązanie z podjednostką R (128-280aa) oraz domenę kinazową, zlokalizowaną przy C- końcu podjednostki C.

U człowieka podjednostki regulacyjne występują w dwóch głównych formach RI i RII, każda z nich występuje w dwóch podtypach oznaczonych jako α i β. Każda z czterech podjednostek regulacyjnych kodowana jest przez różne geny. Znane są także trzy podtypy podjednostek katalitycznych: Cα, Cβ, Cγ. Różne izotypy podjednostek mają skłonność do różnego rozmieszczenia się w obrębie komórki i pomiędzy tkankami, i tak np. enzymy typu I znajdują się głównie w cytoplazmie, natomiast typu drugiego, mają skłonność do asocjacji z błoną komórkową. Podjednostki RIα , RIIα, Cα występują w większości tkanek, natomiast podjednostki RIIβ, Cβ - głównie w tkankach mózgowych.

Podjednostka katalityczna PKA fosforyluje białka na Ser i Thr głównie w motywie Arg-Arg-X-Ser/Thr-X, gdzie X jest dowolnym hydrofobowym aminokwasem. PKA fosforyluje zarówno białka cytoplazmatyczne jak i jądrowe. PKA w wyniku fosforylacji zmienia aktywność wielu ważnych molekuł. Należą do nich m.in.:

• enzymy, fosforylacja jest szeroko rozpowszechnionym mechanizmem aktywacji bądź inaktywacji enzymów. W wielu przypadkach, enzym który ulega fosforylacji, sam jest kinazą. Klasycznym przykładem jest fosforylacja przez PKA kinazy fosforylazy glikogenu, która następnie fosforyluje fosforylazę glikogenu, to prowadzi do obniżenia poziomu glikogenu w wątrobie i mięśniach

• kanały jonowe, kanały wapniowe w komórkach mięśnia sercowego są aktywowane przez PKA, w wyniku czego dochodzi do ich skurczu, ważnym przykładem jest także fosforylacja a co za tym idzie aktywacja kanałów chlorkowych, które odgrywają ważną rolę w sekrecji wody w jelicie cienkim

• białka chromosomowe; histon H1, pierwszy zidentyfikowany cel PKA

• czynniki transkrypcyjne; CREB, po fosforylacji może związać się z regionem paromotorowym odpowiedniego genu i stymulować transkrypcję.

AKTYWACJA PKA

Wewnątrzkomórkowe stężenie cAMP stanowi podstawową kontrolę nad aktywnością PKA. Kiedy poziom cAMP jest niski, podjednostki katalityczne związane są z dimerem podjednostek regulacyjnych, wówczas PKA jest nieaktywne. Aktywacja PKA polega na związaniu dwu cząsteczek cAMP z podjednostką R enzymu. Najpierw następuje przyłączenie jednej cząsteczki cAMP do miejsca wiążącego, znajdującego się przy C-końcu podjednostki R, co powoduje zmiany konformacyjne łańcucha polipeptydowego, umożliwiające przyłączeni drugiej cząsteczki cAMP. Efektem związania dwu cząsteczek cAMP do każdej podjednostki R jest dysocjacja podjednostek R i C, a w konsekwencji odsłonięcie centrum aktywnego enzymu. Jednym z mechanizmów zapobiegających niespecyficznej aktywacji PKA jest jej asocjacja z swoistymi białkami dokującymi AKAP.

Aktywacja kinazy białkowej A.

17. Karboksypeptydaza - enzym trawienny, egzopeptydaza. Działa na łańcuchy peptydowe katalizując odczepienie końcowych aminokwasów w łańcuchu, szczególnie jeśli w łańcuchu bocznym aminokwasu występuje pierścień aromatyczny bądź rozbudowany łańcuch alifatyczny. Zawiera jon cynku w miejscu aktywnym. W mechanizmie działania powyższego enzymu należy zwrócić uwagę na dwie cechy: 1) indukowane dopasowanie (przyłączenie substratu powoduje znaczne zmiany w strukturze enzymu) 2) aktywacja wody (jon cynku znajdujący się w miejscu aktywnym enzymu znacznie zwiększa reaktywność wody).

Rybonukleazy (RNA-zy) to enzymy z klasy nukleaz dzielące cząsteczki RNA na krótsze łańcuchy lub pojedyncze nukleotydy przez hydrolizę wiązań fosfodiestrowych.

Endorybonukleazy dzielą cząsteczki RNA pośrodku łańcucha, egzorybonukleazy odłączają nukleotydy od 3' lub 5' końca RNA.

Rybonukleaza należy do enzymów trawiennych pochodzenia trzustkowego.

Lizozym - jedno z przeciwbakteryjnych białek znajdujących się w płynach ustrojowych. Lizozym jest enzymem, który niszczy ścianę komórkową niektórych bakterii. Obecność lizozymu w organizmie człowieka to przykład przeciwbakteryjnej odporności nieswoistej.

Chymotrypsyna - proteolityczny enzym trawienny, produkowany przez trzustkę (jako proenzym chymotrypsynogen) i wchodzący w skład soku trzustkowego. Zostaje uczynniony przez trypsynę. Wykazuje maksimum aktywności przy pH 8-9. Od trypsyny odróżnia go to, że nie powoduje krzepnięcia krwi. Chymotrypsyna należy do hydrolaz i w jelicie cienkim trawi łańcuchy peptydowe białek. Chymotrypsyna tnie łańcuch peptydowy za aminokwasami zawierającymi pierścień fenylowy:

* tryptofanem,

* fenyloalaniną,

* tyrozyną.

Chymotrypsynogen, produkowany jako prekursorowy zymogen, jest polipeptydem złożonym z 245 reszt aminokwasowych. Proces aktywacji tego proenzymu polega na proteolitycznym wycięciu dwóch dipeptydów poprzez przecięcie wiązań Leu(13) i Arg(15) oraz Tyr(146) i Arg(148) przez trypsynę (a następnie inne uczynnione cząsteczki chymotrypsyny). Ostateczna czynna cząsteczka chymotrypsyny, która powstaje przez stabilizację cząsteczki przez połączenie 3 części przez 2 mostki dwusiarczkowe, określana jest jako α-chymotrypsyna.

A

B

C

---