Ćwiczenia 6

Chromatografia podziałowa gaz-ciecz (ang. GLC = gas-liquid chromatography)

Chromatografia, w której fazą ruchomą jest gaz, a stacjonarną (nieruchomą) ciecz naniesiona na porowaty nośnik lub wewnętrzną ściankę kapilary. W chromatografii gazowej złoże zawsze występuje w kolumnie pakowanej lub otwartej (kapilarnej).

Technika:

• zautomatyzowana, kolumna chromatografii podziałowej w układzie ciecz-gaz

Zasada rozdziału związków:

• różnica we współczynnikach podziału rozdzielanych związków pomiędzy dwoma niemieszającymi się fazami: ruchomą (niereaktywny gaz nośny) i stacjonarną (wysokowrząca ciecz)

*w temperaturze pracy kolumny ciecz nie powinna wrzeć i odparowywać

Np. dwa związki:

Duże powinowactwo do fazy ruchomej = szybciej wyjdzie z kolumny (słabo oddziałują z cieczą)

Duże powinowactwo do fazy stacjonarnej (silnie oddziałują z cieczą= rozpuszczają się w niej lepiej)

Po podniesieniu temperatury układu, związki odparowują do fazy ruchomej (gazowej). Dla związków słabiej związanych z cieczą - silniej z fazą ruchomą , współczynnik podziału (stan równowagi) skierowany jest w kierunku fazy ruchomej. Oznacza to, że ma on wyższą lotność.

Lotność = prężność par nad daną fazą stacjonarną w danej temperaturze. Na lotność wpływają:

• budowa warunkująca temperaturę wrzenia (niższa temperatura wrzenia, wyższa lotność)

• budowa warunkująca polarność

Związki podlegające analizie:

• substancje gazowe (nieduże cząsteczki)

• substancje przeprowadzane w stan gazowy w wyniku odparowania w podwyższonej temperaturze (stabilne w wysokiej temp.)

• substancje (labilne bądź o wys. temp. wrzenia) przeprowadzane w lotne pochodne :

• o mniejszej polarności (mniej oddziałują z fazą stacjonarną)

• niższej temp. wrzenia (łatwiej przechdzą w stan gazowy)

Przykłady:

• mrówczan etylu (węglowodory krótkowęglowe dość lotne)

• butanol (niskie stężenie par)

• sacharoza (nie ma żadnych par!)

Zwiększanie lotności:

• 
  silinacja - wszystkie grupy funkcyjne da się przeprowadzić w pochodne silinowe, np.:

COH - karboksylacja COOH - estryfikacja

Związki dają się odparować bez rozkładu

Faza stacjonarna:

• ciecz wysokowrząca (w czasie rozdziału temp. 20-400°C, w temp. pokojowej może być to ciało stałe - żywica itp.)

• dwa parametry charakterystyczne:

• zakres temperatury

• polarność

• obecnie stosowanych 100 różnych faz stacjonarnych + ich mieszaniny = duża rozpiętość parametrów

Faza ruchoma:

• gaz nośny niereagujący z fazą stacjonarną i rozdzielanymi substancjami (gazy szlachetne: hel, argon, zwykle wystarcza azot)

Kolumna:

• materiał nie może reagować z fazami, rozdzielającymi substancjami

• szklana

• z nierdzewnej stali (może katalizować redukcję!)

• z tworzywa sztucznego

Kolumna umieszczana jest w chromatografie gazowym.


Detektor masowy:

• zwykle płomieniowo-jonizacyjny (FID) - oprócz butli z azotem, podłączone butle z wodorem i tlenem (związki organiczne w tym płomieniu ulegają rozpadowi na jony (dysocjacja))

• piroliza w palniku wodorowym → rekombinacja → prąd

• znakomite oznaczanie większości związków

• konieczność wykraplania części par przed detektorem (chłodzony lodem odbiornik)

Związki po przejściu przez detektor ulegają rozkładowi, chyba że część strumienia azotu skierujemy do innego urządzenia, co spowoduje skroplenie par i związków.

Rodzaje kolumn:

• kapilarna = rurka o średnicy rzędu 10 części mm

• długość od kilkunastu do kilkudziesięciu (150m) metrów

• lepszy rozdział

• brak oddziaływań dodatkowych

• opór stawiany przez kolumnę mały- brak wzrostu ciśnienia




• pakowana = rurka o średnicy rzędu mm

• długość kolumny mniejsza - 1,5 do kilku metrów

• dużo więcej fazy stacjonarnej

• zastosowania preparatywne

• opór stawiany przez kolumnę duży (wzrost ciśnienia), dlatego długość kolumny wynosi kilka metrów

• przy niewielkiej grubości fazy stacjonarnej związki mogą adsorbować

• chromatografia podziałowo-adsorbcyjna - stosowana dla związków o bardzo wysokiej polarności, które oddziałują zarówno z adsorbentem jak i warstwą cieczy.

(trudniejszy model, ale wykorzystywana)




Efekty pracy = chromatogram:

• parametry:

• czas retencji - RT, mówi o lotności próbki (mierzony od początku wrzenia próbki, im krótszy, tym wyższa lotność)

• ilość substancji ~ powierzchnia szczytów (im większa, tym więcej substancji)

• wzorzec ilości substancji:

• standard zewnętrzny ( w tych samych warunkach podajemy znany roztwór),np.

wstrzykujemy 1 ug związku wzorca, RT= 10 minut, pik= 50 000. Otrzymujemy chromatogram: RT=0 minut, pik=100 000.tzn, że związku jest dwa razy więcej niż wzorca, a lotność związku jest prawie taka sama jak wzorca. Zatem związki w danych warunkach mogą mieć odmienna budowę (polarność) a taką samą lotność.

• standard wewnętrzny (do rozdzielanego roztworu dodajemy znany związek, najlepiej, żeby był na początku albo końcu chromatogramu; ryzyko, że „nakryje” pik jakiegoś związku rozdzielanego)






Wszystko, co znajduje się ponad linią podstawową świadczy o obecności związków organicznych w próbie.

Piki kolejnych związków pojawiają się na skłonie piku rozpuszczalnika.

Wniosek: 5 związków o różnych masach, czasach retencji i ilościach.

Istotna jest symetria szczytu. Wygląd szczytu (piku) zmienia się zgodnie z wydłużaniem czasu retencji.

• gdy podniesiemy temperaturę kolumny, czas retencji się skróci - wzrost lotności rozdzielanych związków. Gdy obniżymy temperaturę odwrotnie.

• gdy zwiększymy szybkość przepływu azotu, czas retencji skróci się.

Główne zalety techniki:

• zautomatyzowana

• duża powtarzalność wyników (czego nie było w adsorpcyjnej)

• duża czułość (możliwość rozdzielania pochodnych cukrów, steroidy itp.)

Jako przykład rozdziału związków techniką chromatografii podziałowej w układzie ciecz-gaz, możemy podać rozdział cholesterolu i cholestelanu.

Cholesterol ma budowę pierścieniową, łańcuch izoprenowy z grupą hydroksylową (-OH) i wiązanie podwójne. Natomiast cholestelan ma charakter nasycony (mówi o tym koncówka -an)- tzn, że nie posiada wiązań wielokrotnych, pozbawiony jest grupy OH.

Na chromatogramie związkiem o najkrótszym czasie retencji, a zatem o największej lotności będzie cholestelan, ponieważ jest on mniej polarny i słabiej oddziałuje z stacjonarną fazą wodną. Dłuższy czas retencji, czyli mniejszą lotność ma bardziej polarny cholesterol.

Derywatyzacja - to przeprowadzenie analitu w pochodne, zwykle dzięki wykorzystaniu ich reaktywnych grup funkcyjnych np. OH, COOH itp. W chromatografii gazowej derywatyzację stosuje się w celu zwiększenia lotności analitu i ograniczenia jego adsorpcji na nośniku ( w chromatografii cieczowej do ułatwienia detekcji przez wprowadzenie chromoforu, fluoroforu lub elektroforu)

Przykładem derywatycacji w chromatografii gazowej jest:

Metylacja kwasów tłuszczowych

• umożliwia detekcję

• modyfikuje rozdział

• ułatwia przechodzenie w lotne pochodne

Wolne kwasy tłuszczowe mają wysokie temperatury wrzenia głównie dzięki dimeryzacji. Aby zwiększyć ich lotność przeprowadzamy je w pochodne metylowe. Estry metylowe kwasów tłuszczowych mają zablokowane wiązaniami estrowymi grupy -COOH, zapobiega to dimeryzacji (wolne grupy COOH tworzą wiązania wodorowe- sprzyja dimeryzacji a zatem ograniczeniu polarności), co wpływa na znaczne obniżenie polarności. Po przeprowadzeniu metylacji kwasów tłuszczowych ich kolejność na chromatogramie zależy tylko od długości łańcucha.

1. Kolejność na chromatogramie

Kwasy tłuszczowe (i ich pochodne metylowe) mają tym wyższą temperaturę wrzenia, im dłuższy jest ich łańcuch węglowy. Dlatego kolejność estrów metylowych kwasów tłuszczowych na chromatogramie jest następująca:

C_16:0, C_18:0, C_20:0, C_22:0.

Oczywiście C_16:0 oznacza ilość węgli w części estru pochodzącej od kwasu tłuszczowego_.

Kwasy tłuszczowe rozdzielają się kolejno wg schematu: duża lotność niska temperatura wrzenia krótki łańcuch

2. Wpływ temperatury

Rozdział przeprowadzany w wyższej temperaturze skraca czas retencji (łatwiejsze odrywanie cząsteczek od fazy stacjonarnej). Podobny efekt uzyskuje się przez zastosowanie szybszego przepływu azotu lub zmianę polarności fazy stacjonarnej.

Powierzchnia pików mówi o ilości substancji. Podobnie jak w chromatografii kolumnowej zachodzi tu zjawisko dyfuzji, dlatego kolejne piki są bardziej asymetryczne.

Wysokociśnieniowa / wysokosprawna chromatografia cieczowa (ang. HPLC = high pressure / performance liquid chromatography)

Chromatografia, w której stosuje się złoże chromatograficzne w postaci bardzo małych cząstek adsorbenta lub nośnika z fazą związaną chemicznie lub naniesioną na jego powierzchnię, albo kolumny monolityczne i wysokie ciśnienie na wejściu do kolumny.





Klasyfikacja technik chromatograficznych

wg zasady rozdziału	wg sposobu prowadzenia rozdziału
Chromatografia:
podziałowa jonowymienna adsorpcyjna powinowactwa sączenie molekularne	cienkowarstwowa bibułowa kolumnowa: HPLC

Technika HPLC:

• podziałowa

• jonowymienna

• adsorpcyjna

Charakterystyka:

• ciecz jako faza ruchoma tłoczona pod ciśnieniem (pompa)

• na jakość rozdziału wpływa złoże: jednorodne, ściśle upakowane, minus: rozdział trwa długo - konieczność użycia pomp: faza ruchoma tłoczona nawet do 200 MPa

Rozdzielane substancje:

• cukry

• lipidy

• aminokwasy (poddawane derywatyzacji = przeprowadzanie w pochodne dabsylowe, dansylowe, ortoftalaldehydowe, umożliwiające detekcję w zakresie światła widzialnego)

• nie ma ograniczeń co do lotności, stabilności termicznej itp.

Możliwość modyfikacji:

• złoże

• sposób detekcji (spektrofotometry UV-VIS lub IR, spektrofluorymetry, refraktometry, spektrometry masowe)

• rozpuszczalnik

Zalety:

• dokupowanie kolumn, detektorów = możliwość przeprowadzania różnych rozdziałów

• duża czułość

• zautomatyzowana


SCHEMAT BUDOWY APARATURY DO HPLC




OZNACZANIE:

ILOŚCIOWE interesuje nas powierzchnia pików = ilość substancji

JAKOŚCIOWE interesuje nas czas retencji = co to za związek? (wzorce)

Podobnie jak w GLC:

• wzorzec wewnętrzny (dodajemy do próby)

• wzorzec zewnętrzny (porównujemy dwa chromatogramy)

Porównujemy czas retencji związku z czasem retencji wzorca puszczonego na kolumnę w tych samych warunkach.

Jakość rozdziału zależy od jakości złoża - im większa powierzchnia, tym lepszy rozdział.

Znając stężenie wzorca i jego powierzchnię pod szczytem z proporcji policzymy, ile związku jest w badanej próbie.

Zeszyt laboratoryjny - HPLC

Rozdział aminokwasów prowadzimy w odwróconej fazie. Oznacza to, że fazą stacjonarną jest ciecz niepolarna.

	CHROMATOGRAFIA BIBUŁOWA	CHROMATOGRAFIA W ODWRÓCONEJ FAZIE
FAZA STACJONARNA	polarna (woda)	niepolarna
FAZA RUCHOMA	niepolarna	polarna

*w chromatografii bibułowej właściwą fazą stacjonarną jest woda kapilarna obecna w porach między włóknami celulozy.

Wypełnieniem kolumny jest zmodyfikowany żel krzemionkowy z dołączonymi łańcuchami węglowodorowymi (zwykle od 8 do 18 atomów węgla). Na nim zatrzymuje się niepolarna faza stacjonarna. Fazę ruchomą stanowi woda z buforem i rozpuszczonymi w niej wykrywanymi związkami.

Derywatyzacja (pre- lub postkolumnowa)

Przeprowadzanie substancji w pochodne dabsylowe, dansylowe, ortoftalaldehydowe ( w wyniku kowalencyjnego przyłączania grup np. chromoforowych):

• umożliwia detekcję w świetle widzialnym!

• ułatwia rozdział

• modyfikuje właściwości związków (zwykle dołącza się grupy hydrofobowe)

Aminokwasy przeprowadzamy w pochodne dabsylowe. DABS jest związkiem chromatoforowym, hydrofobowym, przyłącza się do grup -NH₂. (Przyłączanie w pH ok. 8, rozdział w pH=3,5) i ułatwia detekcję w świetle widzialnym. Mieszanina dabsylowych pochodnych aminokwasów ma kolor pomarańczowy. DABS dodawany jest w nadmiarze.

*Na chromatogramie pierwszym szczytem jest bardzo polarny oranż metylowy- produkt degradacji DABS.

Kolejność:

Kolejność dabsylowych pochodnych aminokwasów jest następująca:

• kwas asparaginowy

• kwas glutaminowy

• alanina

• ornityna. (dwie grupy aminowe)

Pochodne dabsylowe Asp i Glu mają dwie grupy -COOH. W pH=3,5 są one najbardziej polarne- w niskim pH w jakim odbywał się rozdział, występują one w formie kwasowej. Polarność Asp jest większa niż Glu, gdyż jej łańcuch węglowy jest o jeden atom krótszy.

Ala jako aminokwas obojętny (brak dodatkowych grup funkcyjnych, które mogłyby zwiększyć jej polarność) po przejściu w pochodną dabsylową jest mniej polarna niż pochodna Asp i Glu. Dlatego pojawia się jako 3.

Orn ma dwie grupy -NH₂, do których przyłącza się DABS. Jej pochodna będzie najbardziej „hydrofobowa”, dlatego jako ostatnia wyjdzie z kolumny.

Piki :Pik ornityny ma dwa razy większą powierzchnię, gdyż przyłączenie dwóch grup DABS powoduje większe pochłanianie fali (większą adsorbcję światła). Różnica powierzchni pod szczytem wynika z mM współczynnika absorbancji.

1

Faza stacjonarna

Faza ruchoma

PIEC

DETEKTOR

DOZOWNIK

0,9

0,1

KOLUMNA

temp. o kilka °C wyższa niż w piecu (aby pary nie skraplały się)

Tu nasz roztwór (rozpuszczalnik
+ substancje rozdzielane) przechodzi w formę gazową

• STĘŻENIOWY
  ułamek: substancja / całkowita materia

• MASOWY
  gramy substancji w jednostce czasu

10^-9-10^-11 g/s = wykrywanie pojedynczych atomów!

Faza stacjonarna na ściankach

Tworzywo sztuczne

adsorbent

ciecz wysokowrząca pokrywająca ziarna

pow. 1.

pow. 2.

RT₁

Szczyt rozpuszczalnika - najkrótszy czas retencji = największa lotność = niska temp. wrzenia

RT₂

RT₃

RT₄

RT₅

pompa A

A

B

pompa B

detektor

rejestrator = komputer

CHROMATOGRAM

dozownik

mieszalnik

T

E

R

MO

S

T

A

T

Podają gradient stężeń

Kolumna (kilkanaście cm dł., średnica mm - cm) termostatyzowana

Próba

Mierzony parametrer

czas (t)

---