Wykład II

Biotechnologia - dyscyplina interdyscyplinarna; użycie drobnoustrojów do otrzymania produktu.

Nowa zaawansowana biotechnologia - podstawą są kultury in vitro i inżynieria genetyczna.

Biotechnologia - wykorzystywanie metod biologicznych do produkcji dóbr i usług dla potrzeby OECD i EFB

1978r. - zintegrowane zastosowanie wiedzy i techniki w dziedzinie biochemii, mikrobiologii i nauk inżynieryjnych w celu technologicznego wykorzystania zdolności drobnoustrojów, kultur tkankowych lub ich części.

Historia biotechnologii roślin:

1869 - odkrycie DNA (Miecher)

1944 - funkcja DNA → przechowywanie informacji dziedzicznej (Avery)

1953 - podwójna helisa - odkrycie struktury DNA (Crick, Watson)

1966 - odczytanie kodu genetycznego (Khorana, Nierennberg i inni)

1970 - zbudowanie syntetycznego genu (Khorana)

1973 - odkrycie plazmidu Ti (van Labarke)

1974 - początek inżynierii genetycznej, przeniesienie genu do bakterii → rekombinacja in vitro + klonowanie (Boyeriin)

1976 - National Institute of Health określa zasady badań w wykorzystywaniu zrekombinowanego DNA

1977 - 1980 - charakterystyka naturalnego przenoszenia genów przez plazmid Ti z Agrobacterium tumefaciens (Uniwersytet stanowy w Waszyngtonie, Instytut Maxa Plancka w Kolonii)

Moment, kiedy można było zrekombinować komórki w kulturach in vitro i klonować uznaje się za początek nowoczesnej biotechnologii.

1977 - identyfikacja genu warunkującego wrażliwość na atrazynę (substancja czynna herbicydów)

1978 - pierwsze przepisy regulujące badanie z zakresu inżynierii genetycznej (Niemcy)

1983 - wykorzystanie plazmidu jako wektora przenoszącego obce geny do tytoniu (Instytut w Kolonii)

1986 - otrzymanie pomidorów i tytoniu chronionego przed gąsienicami białkiem Bt (PGS Belgia)

1987 - otrzymanie tytoniu, pomidorów i ziemniaków odpornych na fosfinotrycynę (PGS Belgia)

1988 - otrzymanie buraka cukrowego odpornego na fosfinotrycynę

1989 - doświadczenia polowe z ziemniakami odpornymi ma fosfinorotrycynę

1990 - doświadczenie polowe z pomidorami odpornymi na fosfinotrycynę

1990 - pierwsze patenty europejskie na odporne ziemniaki i tytoń

1990 - regeneracja z protoplastów płodnych roślin kukurydzy odpornej na Liberty

1992 - otrzymanie transgenicznej pszenicy

1994 - pierwsza próba polowa z kukurydzą odporną na glufosynat

1994 -dopuszczenie genetyczni modyfikowanej kukurydzy do spożycia

1994-1995 - wprowadzeni na rynek herbicydu Liberty

Biotechnologia:

• medyczna

• rolnicza

• ochrony środowiska

• surowców kopalnych

• energetyki (biomasa)

Biotechnologia rolnicza: = agrobiotechnologia

• roślin

• zwierząt

• żywności

• gleby

Biotechnologia roślin:

• transgeneza

• markery molekularne

• hodowla molekularna roślin

• sztuczne nasiona

Główne materiały agrobiotechnologii:

• transgeniczne odmiany roślin

• rozmnażanie wegetatywne

• pożywki stałe

• pożywki płynne (bioreaktory)

• produkcja substancji organicznych przez tkanki/komórki roślin w bioreaktorach

• identyfikacja molekularna

• pojedyncze rośliny o danej/danych właściwościach

• odmiany

• czynniki chorobotwórcze

• mikroorganizmy chorobotwórcze

Wykład III

Biotechnologia roślin:

• ochrona roślin

• uprawa roślin

• hodowla roślin

• nasiennictwo

Agrobiotechnologia:

• wykorzystywanie biotechnologii w szeroko pojętym rolnictwie oraz produkcji żywności sektora rolniczego

• oznacza wprowadzenie ścisłej ochrony własności intelektualnej w całej sferze sektora rolniczego

• wytworzenie organizmów o określonych predyspozycjach genetycznych

• sposób ich wykorzystania w produkcji

• skuteczna ochrona własności intelektualnej

• bardzo dobre rozeznanie rynku

• zabezpieczenie finansowe

Długofalowe tendencje w rolnictwie i kierunki zastosowań biotechnologii w produkcji roślinnej:

• Rozpoczyna się epoka „projektowania” produktu spożywczego na poziomie surowca → zapotrzebowanie na nowe odmiany roślin o ściśle zdefiniowanych cechach użytkowych.

• Wyraźny wzrost zainteresowania żywnością mało przetworzoną spożywczo w stanie możliwie surowym.

• Wzrastają wymagania konsumenta związane z jakości żywności, jej bezpieczeństwem zdrowotnym i wartościami żywieniowymi.

• Preferowanie naturalnych metod przetwarzania surowców spożywczych.

• Ograniczona liczba dodatków do żywności, a w przypadku ich stosowania zdecydowany priorytet mają substancje wytwarzane metodami biotechnologicznymi.

• Wzrost zainteresowania biotechnologiami opartymi na roślinach i kulturach in vitro jako bioreaktorach.

Biotechnologia w produkcji roślinnej:

• szeroko pojęta ochrona roślin

• kontrola procesów reprodukcji

• uzyskiwanie surowców o nowych pożądanych cechach jakościowych

• rozwój energooszczędnych i proekologicznych technologii produkcji

Podstawy biotechnologii roślin:

→ powstała jako wynik postępu w wielu naukach podstawowych, głównie biologii molekularnej oraz inżynierii genetycznej i kultur tkankowych i uprawy in vitro.

Porównanie produkcji biotechnologii i uprawy roślin

Biotechnologia roślin Produkcja roślinna

Materiały wyjściowe

- różne genotypy -

- ee w kulturach in vitro - materiały biotechnologiczne

Źródła zmienności

- inżynieria genetyczna - banki genów, kolekcje

- mutageneza in vitro - populacje naturalne

- zmienność somaklonalna - krzyżowanie

- hybrydyzacja somatyczna - mutageneza

Tworzenie obiektów/formowanie odmiany

roślinnych

- regeneracja roślin i tworzenie materiałów wyjściowych - krzyżowanie i selekcje

- proces hodowlany prowadzący do powstania odmiany - formy naturalne

tkankowych

- opracowanie procesów produkcji w pracy laboratoryjnej

- dostosowanie systemu do skali produkcji (różnej wielkości bioreaktory)

Procesy prowadzący do uzyskania licencji (patentu)

produktu finalnego, procesu, różnych elementowi procesu - tylko produktu finalnego

Produkcja materiału wyjściowego

Nasiennictwo, szkółkarstwo inne sposoby rozmnażania roślin

- produkcja biotechnologiczna - uprawa roślin

Trzy zasady stosowane w biotechnologii roślin:

• roślina transgeniczna ma nową cechę i zwiększa wartość użytkową i uprawową

• materiał siewny/sadzonkowy wytwarzany na dużą skalę za pomocą bioreaktorów lub innych kultur in vitro

• w warunkach bioreaktorów wykorzystanie substancji np. do produkcji farmakologicznej przez rośliny

Warunki, które muszą być spełnione:

• odmiana transgeniczna

• dostępny jest gen, który warunkuje daną cechę

• uzyskany jakimiś sekwencjami segregacyjnymi gen musi być uzupełniony, aby uległ ekspresji

• wprowadzenie danego genu dawcy do biorcy

• rośliny z nowym genem mają nową właściwość w normalnych warunkach uprawy

• nowa właściwość jest przekazywana potomstwu

• jest korzystnie reprezentowana w pewnym zakresie warunków klimatyczno - glebowych

• rośliny z nowym genem muszą być konkurencyjne wobec dotychczasowych

• produkcja materiału siewnego

• zarodki somatyczne wytwarzane w dużych ilościach

• zamykanie ich w sztucznej otoczce → sztuczne nasiono

• somatyczne nasiona mają wszystkie cechy dobrego materiału siewnego

• produkcja substancji w bioreaktorze

• warunki do stabilnego wytwarzania danej substancji

• odpowiednia wydajność

• spełnienie wymogów

• opłacalność technologii

Wykład IV

Umiejętności niezbędne do prowadzenia badań z roślinami transgenicznymi (Polska):

- reprezentowane/ + niewystarczające/ ++ wystarczające/ +++ nadmierne

stopień reprezentowania

• izolacja i dostępność genów + -

• konstrukcja genów i wektorów + -

• wprowadzanie wyizolowanych wektorów do dawcy +

• uzyskanie roślin transgenicznych +

• sprawdzenie stabilności genu w różnych warunkach, wytypowanie linii transgenicznych, w warunkach uprawy polowej ++

• sprawdzenie wartości linii transgenicznych w doświadczeniu porównawczym +++

• opracowanie technologii uprawy i nasiennictwa +++

Produkcja materiału siewnego somatycznego:

• wytwarzanie zarodków w bioreaktorze + -

• sprawdzenie jakości zarodków

• genetycznej +

• adaptacyjnej ++

• wzrostu i rozwoju +++

• plonowania +++

• sposób hartowania i adaptacji ++

• dobór otoczki i jej składników +

• fizjologia somatycznego nasienia +++

• kryteria jakości materiału siewnego somatycznych nasion (nasiennictwo) +++

Produkcja triploidalnych nasion ogórka (zawierają trzy genomy):

→ bardzo trudna produkcja (triploidy są niepłodne → mejoza)

• 4 żeńskie - zapłodnienie - 2 męskie (tetraploid x diploid → zarodek x nasiono)

gamety: 2n + 1n → 3n x3

• ee z nasionka i rozwój organizmów 3n w fitotronie → kultura ee nasion/zarodków (aby otrzymać tetraploid kolhicynowanie diploida na agarze)

• kiełkowanie zarodków na pożywce agarozowej w słoiku → 4/5

• pobranie z nich ee i przeniesienie na pożywkę w fitotronie → otrzymanie embriogenicznych/ lub organogenicznych tkanek

• przenoszenie roślin do szklarni torf + perlit - adaptacja

• przeniesienie w warunki polowe - kontrola z roślin 2n, obok nasze 3n

Inżynieria - nauka wykorzystywania robót inżynieryjnych, umiejętność wznoszenia wszelkich budowli oprócz budynków.

Inżynieria genetyczna - wprowadzanie zmian w materiale genetycznym z pominięciem metod genetyki i mutagenezy klasycznej, konstrukcja genomów metodami in vitro

Cel inżynierii genetycznej - dostarczanie metod i strategii wprowadzanie zdefiniowanych zmian w materiale genetycznym.

• poznaniowy - poznanie skutków zmian struktury materiału genetycznego i wpływu na genotyp

• utylitarny - dostarczanie organizmów z nowym układem genetycznym zgodnie z potrzebami gospodarki

Wykład V

Obszary oddziaływań inżynierii genetycznej:

• medycyna

• nauki humanistyczne

• nauki stosowane i gospodarka:

• hodowla

• biotechnologia

• ochrona środowiska

• ochrona roślin

• diagnostyka

• farmacja

Tak szeroki obszar zastosowań bierze się stąd, że pozwala ona na manipulacje jednym z dwóch elementów decydujących o funkcjonowaniu każdego organizmu - substancją dziedziczną. Drugi element to środowisko.

Warunki konieczne do powstania IG:

• rekombinacja DNA in vitro

• możliwość izolacji DNA

• enzymy trawiące DNA w zdefiniowanych miejscach - restryktazy

• enzymy łączące DNA - ligazy

• subklonowanie (namnażanie) DNA przeznaczonego do transformacji

• wektor klonujący (plazmidy)

• organizmy zdolne do namnażania wektora z insertem (początkowo były to tylko bakterie)

• możliwość sprawdzenia rezultatów

• wprowadzenie zrekombinowanego DNA do genomu błony:

• system transdukcji i transjekcji, prowadzące do uzyskania organizmów transgenicznych

bazy danych

generowanie klonowanie amplifikacyjne charakterystyka transgeneza

fragmentów DNA/RNA

modyfikacje przenoszenie do organizmów

Schemat technologii manipulowania materiałem genetycznym w IG:

klonowanie amplifikacja

namnażanie identycznych kopii, fragmentów DNA

Tu używając wektora, do którego Namnażanie chemiczne lub

dany fragment jest wprowadzany, enzymatyczne w probówce

namnażanie wraz z tym fragmentem DNA,

w komórce lub organizmie

Metody generowania fragmentów DNA:

1.Przeszukiwanie bibliotek z użyciem sekwencji pochodzących z:

• wyizolowanych (samemu lub od kogoś) wcześniej sekwencji kwasów nukleinowych z innych organizmów; sondy heterologiczne - nie w pełni podobne do tego, czego szukamy; mieszaniny zdegradowanych oligonukleotydów

• markery molekularne (RADP, ADLP, SSR, RFLP)

• sekwencje użyte do tagowania (oznaczanie, zahaczanie genów) transpozony, plazmidy Ti → sekwencja, która pozwala odszukać gen, który chcemy uzyskać; Tag zahacza określoną sekwencje

• sekwencje aminokwasów w białkach (mieszanina zdegradowanych oligonukleotydów → sonda)

• defferential display

• RACE fragmenty genów, które mogą być użyte do

• losowo wybrana sekwencja przeszukiwań bibliotek genomowych

2.Screaming różnicowy bibliotek

3.Differentia display

4.Tagowanie genów

5.Markery molekularne

6.RACE

7.Losowe wybierenie sekwencji

8.Sekwencje syntetyczne

9.Izolacja bezpośrednia z genomu → pominięcie bibliotek DNA

Metody klonowania fragmentów DNA:

• bezwektorowa → PCR i pochodne - amplifikacja

• wektorowa → właściwe klonowanie

• kombinowana →PCR + wektorowa

Charakterystyka fragmentów DNA:

Analiza strukturalna:

• analiza restrykcyjna - trawimy enzymami restrykcyjnymi, charakterystyka dowolnego fragmentu → mapy restrykcyjne

• ustalenie sekwencji nukleotydów - dokładniejsza

Analiza funkcjonalna:

• komputerowa analiza sekwencji

• laboratoryjna analiza funkcjonalna

• transkrypcja i translacja in vitro i in vivo

• ustalenie zawartości informacyjnej fragmentu i porównanie naszych sekwencji z sekwencjami w bazie danych, można określić, co sekwencja koduje oraz funkcje sekwencji - komputer często podaje podobieństwo naszej sekwencji do wielu innych, musimy zdefiniować, która jest najbliższa - testy w laboratorium)

• testowanie poszczególnych fragmentów sekwencji

• metoda ?? - pozwala na uzyskanie dokładnych kopii oraz można dostać dużą ilość materiału

• PCR amplifikacja - dużo mniej materiału (amplifikatorów), polimeraza czasem się myli, potrzebujemy mało materiału

• metoda kombinowana - bo mamy za mało sekwencji do klonowania, więc przeprowadzamy amplifikacje (namnażamy fragmenty DNA) później wprowadzamy je do wektora, który przenosi gen do komórek i tam namnażany jest genom.

Modyfikacje fragmentów DNA:

• tworzenie genów hybrydowych (poskładane fragmenty pochodzące z różnych genów) często to co składamy też modyfikujemy

• mutageneza in vitro - celowe wstawianie lub wymiana fragmentów DNA ee rosnące „in vitro” + mutageny → zmiany, nad którymi nie panujemy (losowe)

• bez integracji z materiałem genetycznym komórki gospodarza

• plazmid

• sztuczne chromosomy

• z integracją do materiału genetycznego gospodarza

• w sposób losowy (liczba kopii, ich ułożenie, zmiany są losowe)

• w sposób określony (inwersja odbywa się w sposób zaprogramowany)

Wykład VI

Charakterystyka organizmów transgenicznych:

• jakość integracji

• analiza ekspresji transgenów i jej wpływ na genotyp

• określenie sposobu dziedziczenia transgenów

• stabilność form transgenicznych, czasem wygasanie cechy, dziedziczenie nie- mendlowskie

Narzędzia inżynierii genetycznej:

1. podstawowe terminy używane w inżynierii genetycznej

2. enzymy i białka: lista, reakcje, substraty i produkty, warunki reakcji, techniki wymagające ich użycia

3. sekwencje kwasów nukleinowych: sondy, wektory, oligonukleotydy, rybosomy

4. substancje używane do znakowania kwasów nukleinowych: izotopy, nieizotopowe sposoby znakowanie

5. ważniejsza aparatura i urządzenia

Ad 1.

• palindrom - sekwencja o wewnętrznej symetrii np. AATT TTAA osiowa symetria rozpoznawana przez enzymy restrykcyjne

• lepkie i tępe końce generowane przez enzymy restrykcyjne

• primer (starter) - kawałek kwasu nukleinowego, jednoniciowy do 150 nukleotydów, początek syntezy kwasu po przyłączeniu się do matrycy

• annrealing - hybrydyzacja kwasów nukleinowych fragmentów krótkich do dłuższych przy amplifikacji DNA w metodzie PCR, matryca i krótkie fragmenty, które się do niej kleją (annrealing) w odróżnieniu od hybrydyzacji

• ligacja - łączenie kwasów nukleinowych poprzez wiązania fosfodiestrowe / trawienie / polimeryzacja - przyłączanie fragmentów poli A (40 adenin) do Świerzego mRNA koniec 3'

• metyzacja - przyłączanie CH₃

• hybrydyzacja - łączenie się dwóch komplementarnych nici

• sekwencjonowanie - przyłączanie się nukleotydu po nukleotydzie

• ekspresja - wytwarzanie produktów z genów (transkrypcja + transloacja) oraz ich działania i efekty, funkcja wypadkowa produktów genów = rola

• przeszukiwanie bibliotek

• transgeneza - przenoszenie transgenów; transformacja nowotworowa

• transformacja - przejście z jednego stanu w drugi np. komórka somatyczna → nowotworowa

• transdukcja - przenoszenie DNA komórki gospodarza przez wirusa do innej komórki

• transfekcja wprowadzanie DNA na teren komórki

• infekcja - wprowadzanie DNA na teren komórki przez patogen

• restrykcja - ograniczenie możliwości namnażania się fagów w komórkach E.coli innych linii

• amplifikacja - namnażanie identycznych fragmentów DNA

• transgen - przenoszony In vitro metodami inżynierii genetycznej

• organizm transgeniczny - zawiera transgen we wszystkich komórkach ciała; jak mutant → transogórek

• heteroduplex - DNA złożone z dwóch nici różnego pochodzenia, częściowo niekompletne

• mapa restrykcyjna - po potraktowaniu DNA enzymami restrykcyjnymi

Ad 2.

• enzymy syntetyzujące kwasy nukleinowe → polimerazy DNA i RNA (, I, T7, T4, Taq, odwrotna transkrytaza) RNA E.coli, SP6, T3, T7

• enzymy degradujące kwasy nukleinowe nukleazy, DNA endonukleazy (DNAaza tną DNA na kawałki), restryktazy (grupa I, II, IIS,III), egzonukleazy (odcinają nukleotydy), rybonukleazy (RNAaza A i H → eDNA upiorny enzym nie potrzebuje kofaktorów, niehamowana EDTA)

• enzymy modyfikujące kwasy nukleinowe

• działające na końce (terminalna deoksytransferaza TdT, kinaza T4, fosfataza alkaliczna)

• etylujące (, demetylaza → etylujące miejsca restrykcyjne, modyfikacja restrykcji, ochrona przed własnymi enzymami restrykcyjnymi

• topoizomerazy - zmiana skręcalności DNA (I - reakcja → tnie jedną nić cząsteczki, rozkręcanie cząsteczki II - odwraca kierunek skrętów)

• białka wiążące się z DNA (SSB, B32 faga T4, Reo A)

• enzymy łączące cząsteczki kwasu nukleinowego

• ligazy DNA (T4, E, coli)

• RNBA T4

• enzymy rekombinujące cząsteczki DNA

• rekombinaza (, FLP, R, Gin)

Wykład VII

Sekwencje kwasów nukleinowych jako narzędzia IG:

• sondy - przeglądy bibliotek, mapowanie molekularne, badanie ekspresji genów, selekcjonowanie, identyfikacja genotypów

• wektory - klonowanie, transgeneza, ekspresja genów, transkrypcja in vitro

• oligonukleotydy - sekwencjonowanie metoda oparta na PCR, odwrotna transkrypcja, sondy, synteza DNA

• rybosomy - projektowanie rybosomów hamujących ekspresje genów, nadających odporność na wirusy poprzez niszczenie ich genotypów

• RNA - interferencja RNA

Substancje używane do znakowania kwasów nukleinowych:

• metody izotopowe

• P-32 znakowanie sond, sekwencjonowanie

• P-33 - znakowanie primerów, sekwencjonowanie

• S-35 - hybrydyzacja in situ, sekwencjonowanie

• metody nieizotopowe

• system biotyna - koniugat avidyny z cząstkami generującymi sygnał

• system hepten (digoxigenian) - koniugat z cząsteczkami generującymi sygnał

Aparatura:

• system oczyszczanie wody

• system mycia szkła i postępowania z odpadami

• system sterylizacji szkła i odczynników

• przechowywanie i praca z odczynnikami wymagającymi niskich temperatur

• warunki głębokiego zamrażania (-75-95°C) → material biologiczny

• warunki zwykłe (20-30°C) → enzymy, białka, oligonukleotydy, kwasy nukleinowe

• lodówki

• aparatura do primerów zawierająca substancje w roztworach (spektromarker)

• inkubatory, cieplarki, termostaty, inkubatory do bakterii

• aparatura do elektroforezy pionowej/ poziomej

• fotodokumentacja fotografii

• aparatura do hybrydyzacji kwasów nukleinowych, transformacja kwasów nukleinowych

• aparatura do transformowania, elektrogenezy, mikroiniekcji

• pokój izotopowy

Wektor - każdy fragment kwasu nukleinowego, który zdolny jest spełnić warunek → wzmaganie integracji ekspresji w układzie do którego został wprowadzony

Ogólna budowa wektora → dwa typy funkcji

• pozwalająca na utrzymanie i namnażanie się wektora w komórce zależnie od specyfiki wektora (plazmidowe, fagowe, YHC); sekwencje: ori, ARS, cos, białka A, telomowe, centromerowi, markerowe, reporterowi i inne

• funkcje pozwalające na spełnianie specyficznych zadań jako wektora

• polilinkery HC3

• markery i sekwencje reporterowi

• sekwencje sygnalne dla wydobywania informacji z insertu

Wykład VIII

Klasyfikacja wektorów i ich ogólna charakterystyka:

• typy komórek gospodarza:

• prokariotyczne

• eukariotyczne

• wahadłowe

• sposób namnażania:

• autonomiczne

• integracyjne (brak ori)

• pochodzenie:

• plazmidowe (minimalna pojemnośc maxymalnie 15 kpz)

• fagowe np. fag lambda do 25 kpz, konstruowanie bibliotek genomowych

• kosmity pliazid x fag z koncami cos

• fagemidy fag x plazmid bez konców ori, z faga miejsce replikacji F1 (możliwa jednoniciowa replikacja nić „+” lub nić „-„

• sztuczne chromosomy

• bakteryjne BAC (koliste) 0,5 Mpz

• drożdżowe YAC 2Mpz

• funkcje

klonujące do subklonowania (powtórne klonowanie)

Tylko sekwencja kodująca konstrukcje bibliotek cDNA (w fagach)

(bez intronów) Konstrukcje bibliotek genomowych

ekspresyjne mRNA

białek

prokariotycznych

eukariotycznych

wielofunkcyjne

Organizmy używane do namnażania DNA mutują, aby mieć kontrolę nad insertem i wektorem i aby zmienić właściwości

Typy wektorów klonujących - plazmidy do mamnażania DNA

P- polilinker - miejsce do którego wklinowuje się insert posiada szereg miejsc restrykcyjnych unikalnych dla tego P → specyficzne miejsca cięcia precyzyjne dla tego insertu.

Końce „cos” - lepkie końce

Lac 2 - enzym rozkładający galaktozydy na niebieski produkt, gdy do P wstawimy insert, to jest on nieczynny i nie daje takiej reakcji → białae kolonie → OK. inercja

AmpR - antybiotyk selekcja komórek z insertem, odporność

Wektor integrujący nie ma miejsca ori!!! (ARI brak możliwości replikacji w komórkach bakteryjnych, tylko w drożdżach , a replikujące tak!

Gen marker np. synteza leucyny gen LEU2

Drożdże z tym wektorem będą mogły żyć na pożyce z leucyny a niezrekombinowane zginą.

Telomery pozwalają na liniową konstrukcje chromosomu

Pary wektorów do badania interakcji białek

Wyznaczone sekwencja wstawiana do dwuch róznych wektorów (domena wiążąca i kodująca - muszą wchodzić w interakcje)

Z pierwotnego 1 wektora → działa kodowane przez 2 wektory w jednej komórce

Wektor używany do wychwytywania z DNA genomowego sekwencji kodujących pozbawionych intronów → uzyskanie cDNA

Wektor BAC do konstrukcji bibliotek genomowych długich fragmentów 100-150 kpz

Miejsce LOP ułatwiające wycięcie lac2 i subklonowanie do wektorów plazmidowych o mniejszej pojemności

Identyfikacja molekuł w mieszaninie:

• skasowanie znaczników

• sondowanie markerów

Sonda molekulatrana - rodzaj molekularnego próbnika, który poprzez specyficzne powinowactwo określonym związkiem umożliwia jego identyfikacje

Rodzaje sond:

• DNA - rożnej długości (oligonukleotydy → kilkanaście tysięcy)

• RNA - hybrydyzacja In situ

• białka - przeciwciała (mikroskopia immuno-elektronowa, western lott, ELISA) białka specyficzne łączące się z DNA

Wykład IX

Metoda znakowania sond:

• znakowanie końców

• dwustopniowe (AP następnie kinaza polinukleotydowaT4)\

• jednostopniowa (konaza polinukleotydowa T7)

• poprzez ramię NHS (metoda nieradioaktywna)

• znakowanie końców 3' z użyciem:

• terminalnej transferazy

• substratu dNTP

• substratu ddNTP dideoksy

• uzupełnianie zwisających końców (DNA polineraza T4)

• wydłużanie znakowanego startera (Taq polimeraza, rewertaza DNA, poli. T7)

• znakowanie poprzez inkorporacje znakowanych nukleotydów

• PCR

• metoda wydłużania starterów o losowej sekwencji

• metoda Nick translation (wykorzystują zjawisko reperacji)

• transkrypcja In vitro

• odwrotna transkrypcja cDNA jednoniciowych

Znaczniki sond:

• radioaktywne

• izotopy fosforu P³², P³³

• izotopy siarki S³⁵

• nieradioaktywne

• związane bezpośrednio z sondą/ pośrednio

Powstają embriony somatyczne → bioreaktor - produkcja zarodków w kulturze płynnej → wyławianie → otoczkowanie → wysiew na polu

Powstają organy bez stadium zarodka.

Budowla = genom (można go konstruować różnymi metodami)

1

---