BIOTECHNOLOGIA

Dr Ewa Kwapisz

[e-mail]

Działy:

1. Szczepy przemysłowe:

• charakterystyka,

• źródła,

• kontrola.

2. Metody przechowywania mikroorganizmów.

3. Surowce stosowane w biotechnologii.

4. Produkcja białka mikrobiologicznego.

5. Produkcja kwasu cytrynowego.

6. Produkcja penicyliny.

1. SZCZEPY PRZEMYSŁOWE

Głównym narzędziem biotechnologii są mikroorganizmy, których aktywność biologiczną wykorzystuje się w procesach biosyntezy i biotransformacji.

Proces biosyntezy to proces, w ramach którego realizowany jest wzrost szczepu i podczas wzrostu wytwarzany jest produkt.

W procesach biotransformacji wykorzystuje się komórki wyrosłe wcześniej, oddzielone od podłoża i przeniesione do bioreaktora z substratem. Enzymy wprowadzonej populacji powodują przekształcenie substratu w produkt.

Szczególnym przypadkiem biosyntezy jest fermentacja, dochodzi w niej do niepełnego spalenia substratu, tzn. glukoza nie zostaje utleniona do H₂O i CO₂, a jedynie do produktów pośrednich: alkohol etylowy, kwas cytrynowy, kwas propionowy.

Głównym źródłem organizmów dla biotechnologii jest środowisko przyrodnicze. Szacuje się, że zaledwie 1% obecnej mikroflory został zdiagnozowany i wyizolowany. Znakomitej większości tych organizmów nie potrafimy wyhodować w warunkach laboratoryjnych. O ich istnieniu wnioskujemy na podstawie ilości DNA, czy aktywności enzymów i obecności innych białek. W ostatnim dziesięcioleciu trwa rozwój technik hodowlanych i diagnostycznych by zbadać otaczające nas środowisko. Należy zdać sobie sprawę z tego, że mikroorganizmy bytujące w przyrodzie charakteryzują się zrównoważonym metabolizmem i nie dochodzi tam do niekontrolowanej nadprodukcji metabolitu. Szczepy te są zbyt mało wydajne do biosyntezy, tylko niektóre nadają się do produkcji kiszonek i w procesie serowarskim na początku technologii.

W większości technologii stosuje się kultury poddane zabiegom doskonalenia:

1. mutagenizacja,

2. inżynieria genetyczna.

Szacuje się, że 20-30% kultur stosowanych w zaawansowanych technologiach to rekombinanty genetyczne.

Źródła pozyskania szczepów dla biotechnologii:

1. Bezpośrednio ze środowiska bytowania:

1. środowisko przyrodnicze,

2. zakłady przemysłowe,

3. przemysł agrotechniczny.

2. Zakup szczepu z kolekcji czystych kultur, w tych kolekcjach deponowane są mikroorganizmy o zarysowanych cechach, jednakże nie są to szczepy konkurencyjne w stosunku do tych wykorzystywanych przez wiodące firmy.

3. Zakup licencji - praktycznie nie sprzedaje się szczepu produkcyjnego, a jedynie możliwy jest zakup wraz z technologią.

Kryteria oceny mikroorganizmów przemysłowych:

1. Wydajność produktu.

Względy ekonomiczne.

2. Szybkość wzrostu, szybkość tworzenia produktu.

Względy ekonomiczne oraz zmniejszenie prawdopodobieństwa wystąpienia zakażeń. Każda godzina opóźnienia wzrostu szczepu ułatwia zakażenia. Rozpoczęcie syntezy produktu podczas wzrostu szczepu pozwala na szybsze zakończenie hodowli, a więc obniżenie kosztów.

3. Czystość produktu.

Proces wyodrębniania i oczyszczania produktów jest w większości przypadków bardzo kosztowny (zwłaszcza środki lecznicze), a niskie stężenie produktów towarzyszących zmniejsza koszty oczyszczania.

4. Niepatogenność, brak toksycznych produktów.

Większość szczepów stosowanych w biotechnologii jest „w pełni bezpieczna”, jedynie w technologiach takich jak produkcja szczepionek stosuje się szczepy patogenne. Ważne jest również by szczep zaliczany do bezpiecznych w danych warunkach nie wytwarzał produktów toksycznych (Aspergillus Niger może tworzyć aflatoksyny).

5. Stabilność genetyczna.

Stabilność genetyczna gwarantuje powtarzalność wyników biosyntezy, ułatwia przechowywanie szczepów.

Bakteriofagi mogą w krótkim czasie spowodować wyginięcie całej populacji.

6. Wymagania pokarmowe.

Szczególnie cenne są szczepy o niskich wymaganiach pokarmowych i nie reagujące zbyt silnie na zmiany składu podłoża.

7. Tolerancja na zmiany składu podłoża.

W biotechnologii podłoża przygotowuje się głównie na produktach odpadowych przemysłu spożywczego, takich jak: wywary, wytłoki, melasa. Surowce te mają dla kolejnych partii nieco różny skład w zależności od pochodzenia i klimatu, w którym rosły rośliny.

8. Zapotrzebowanie na tlen.

Tlen stanowi zwykle najdroższą pożywkę w procesach biosyntezy ze względu na niską rozpuszczalność w wodzie i ciągłą konieczność napowietrzania. Znalezienie szczepu wymagającego mniej tlenu, a mającego taka samą produktywność spowoduje zmniejszenie kosztów.

9. Wymagania: temp, pH, wilgotność, zasolenie, itp.

Zagadnienie to należy rozpatrywać w dwóch aspektach:

1. kosztów,

2. zabezpieczenia przed zakażeniami.

Hodowla przy niskim pH ogranicza możliwość zakażeń, zwiększa natomiast szybkość korozji urządzeń. W hodowli w wysokich temperaturach (40°C i powyżej) zmniejsza się prawdopodobieństwo zakażeń, ale jednocześnie zwiększa koszty procesu.

10. Łatwość wydzielania produktu.

Względy ekonomiczne.

2. PODSTAWOWE ZABIEGI MAJĄCE NA CELU KONTROLĘ POPULACJI

1. Badanie populacji.

Cechą charakteryzującą populację jest rozrzut produktywności, tj. jaki procent komórek wytwarza średnią ilość produktu (uzyskiwaną przez populację wyjściową) i ile klonów produktywność niższą lub wyższą. Ważne jest również jak jest duży rozrzut tych aktywności. Typowo 60-70% posiada produktywność średnią i kilkanaście wyższą oraz kilkanaście niższą; rozrzut nie przekracza 20-25%. Zmiana tych wartości po pół roku przechowywania wskazuje na konieczność modyfikacji warunków przechowywania szczepu.

Korzystnym jest stworzenie nowej populacji składającej się z klonów o najwyższej produktywności. Taka mieszanina może wykazywać większą produktywność przez jeden do kilku miesięcy, a następnie wraca do wyjściowej produktywności.

2. Zabiegi uaktywniające.

W celu uaktywnienia populacji korzystnymi może być: szok termiczny, hodowla przy wysokim zasoleniu, hodowla w podłożu z antybiotykami.

3. Metody przechowywania mikroorganizmów przemysłowych.

Jednym z podstawowych warunków prowadzenia powtarzalności procesów mikrobiologicznych jest utrzymanie genetycznej stabilności szczepu i jego czystości mikrobiologicznej, oznacza to, że dla danego szczepu produkcyjnego niezwykle precyzyjnie powinny być opracowane warunki przechowywania. Niestety metody przechowywania różnego rodzaju szczepów są różne i zwykle są chronione przez dany zakład. Powszechnie obowiązującą zasadą w przechowywaniu jest ograniczenie liczby przesiewów.

Spontaniczne mutacje pojawiają się z częstotliwością 1 na 10¹¹ podziałów komórki, tak więc przy częstym przesiewaniu wzrasta możliwość mutacji.

Warunki przechowywania powinny być tak dobrane by w możliwie największym stopniu ograniczyć lub zahamować procesy metaboliczne w komórce. Zachowanie wysokiej przeżywalności komórek. Jest to szczególnie ważne w przypadku szczepów produkcyjnych, ponieważ najwyższą przeżywalność mają zwykle klony silniejsze biologicznie, a słabsze technologicznie. Niższą przeżywalność mają komórki silniejsze technologicznie, a słabsze biologicznie. Przechowywanie w niekorzystnych warunkach powoduje zaburzenie populacji o komórki korzystniejsze z technologicznego punktu widzenia.

Mikroorganizmy przetrwalnikujące/zarodnikujące przechowuje się w formie spor. Organizmy nie wytwarzające spor przechowuje się w formie niewegetatywnych spor. Obowiązuje zasada by komórki te pochodziły z późnej fazy stacjonarnej.

Nie w skazane jest pobieranie komórek pochodzących z fazy intensywnego wzrostu czyli z fazy w której zachodzi intensywna replikacja DNA. W takiej populacji prawdopodobieństwo spontanicznych mutacji jest znacznie większe.

Podłoże do przechowywania musi być stosunkowo ubogie i mieć zbilansowany skład C:N:P:mikroelementy.

Chodzi o to by po wyczerpaniu np. źródła węgla w podłożu nie pozostały jeszcze związki azotu, ich obecność stymulowałaby wtórny wzrost populacji w czasie przechowywania.

Metody przechowywania mikroorganizmów przemysłowych:

1. Pasażowanie:

Określenie to dotyczy przechowywania na skosach zawierających pożywkę stałą i wyrośnięte kultury przechowuje się w temp. +4°C. powierzchnię wzrostu pokrywa się warstwą płynnej parafiny by ograniczyć dostęp tlenu.

Metoda ta jest najczęściej stosowana, pozwala na uzyskanie dużej przeżywalności, prawdopodobieństwo zakażeń stosunkowo bardzo duże. Probówki zajmują dużo miejsca.

2. W stanie wysuszenia:

Ta forma przechowywania symuluje warunki jakie występują w przyrodzie i polecana jest głównie dla grzybów strzępkowych i drożdży, a w mniejszym stopniu dla bakterii.

1. suszenie (przy ciśnieniu normalnym):

Suszenie pod ciśnieniem normalnym to prosty zabieg polegający na pozostawieniu skosów w temperaturze pokojowej na czas 1-2 tygodni. Te łagodne warunki suszenia powodują uzyskanie dużej przeżywalności.

2. suszenie pod próżnią:

Proces suszenia można przyspieszyć stosując komory próżniowe do których wkłada się skosy z kulturami mikroorganizmów oraz pojemnik ze środkiem pochłaniającym wilgoć, np. P₂O₅. Podłączenie pompy próżniowej umożliwia wysuszenie materiału w czasie 1-2 godzin.

3. jofilizacja, czyli suszenie ze stanu zamrożonego:

Metoda jofilizacji mimo wysokiej ceny urządzeń jest często stosowana, jednakże w wielu przypadkach poziom przeżywalności jest niewystarczający.

Proces jofilizacji składa się z dwóch etapów:

1. komórki w fazie zawiesiny umieszcza się w ilości do 0,5 ml w fiolkach z miękkiego szkła i zamraża.

2. następuje sublimacja wody w warunkach poniżej 0,1 mmHg. Zamrażanie prowadzi się w mieszaninie suchego lodu z metanolem (etanolem). W czasie zamrażania fiolka poddawana jest ruchowi wirowemu co powoduje delikatne zamrażanie kolejnych cienkich warstewek płynu. Temperatura w łaźni podczas zamrażania wynosi poniżej -40°C. Podczas sublimacji powinna być utrzymywana temperatura -40°C, -50°C, a odprowadzana para wodna zatrzymywana na wypełnieniu z 5-cio tlenkiem fosforu.

Proces zamrażania i sublimacji powinien być prowadzony sprawnie i szybko, ponieważ tlen podczas tych operacji jest bardzo toksyczny dla komórek. Po zakończeniu jofilizacji zatapia się fiolki „pod próżnią” i tak przygotowane fiolki mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej bądź w lodówce nawet przez kilka lat.

Parametrem rzutującym w dużym stopniu na przeżywalność jest poziom wilgotności w przechowywanym materiale. Wilgotność nie powinna przekraczać 1%!

3. W stanie zamrożonym:

Do przechowywania mikroorganizmów nie mogą być wykorzystywane typowe zamrażarki powszechnego użytku. Najwyższa temperatura w jakiej mogą być przechowywane mikroorganizmy to -40°C. Wiele szczepów przemysłowych przechowuje się w zamrażarkach mechanicznych w temp. -70°C, -80°C

Szczepy szczególnie cenne lub wymagające zabezpieczenia przechowuje się w temp. -150°C nad ciekłym azotem.

W biotechnologii medycznej dla przechowywania mikroorganizmów i tkanek wykorzystuje się instalacje umożliwiające przechowywanie kultur w ciekłym azocie w temp. -196°C. Generalnie ta metoda jest bardzo wygodna, umożliwia zachowanie stosunkowo wysokiej przeżywalności. Barierą do szerokiego jej wykorzystania są jedynie koszty instalacji.

Komórki oddziela się od podłoża hodowlanego i zawiesza się w świeżym podłożu hodowlanym i zawiesina napełnia się określoną ilość kapilar, które wypełnia się na zasadzie naczyń włosowatych i umieszcza w zamrażarkach, w razie potrzeby pojedyncze kapilary bierze się do użytku. Ważne dla utrzymania wysokiej przeżywalności jest żeby bezpośrednio po wyjęciu kapilary z zamrażarki umieścić ją w łaźni wodnej o temp. 35-40°C. Gradient temperatur od -80°C do +40°C zabezpiecza właściwą szybkość rozmrażania.

4. W wodzie destylowanej:

Jak dowodzą doświadczenia z licznych laboratoriów dużą przeżywalność komórek można uzyskać przechowując kulturę w wodzie destylowanej, nie jest to jednak sposób wygodny ze względu na duże prawdopodobieństwo zakażeń i zajmowanie dużej ilości miejsca.

3. SUROWCE STOSOWANE DO PRZYGOTOWANIA PODŁOŻY PRODUKCYJNYCH

W biotechnologii wykorzystuje się 3 rodzaje pożywek hodowlanych:

1. Podłożą minimalne - są stosowane jedynie w pracach laboratoryjnych mających na celu badanie fizjologii szczepu oraz badania nad optymalizacją warunków hodowli. Podłoża przygotowywane są z odczynników o wysokiej czystości i zawierają węglowodany, wybrane aminokwasy, sole mineralne oraz ewentualnie witaminy i kofaktory. Podłoże to ma charakter zbilansowany.

2. Podłoża odżywcze (wzbogacone) - służą one do przechowywania i ułatwiania kultu mikroorganizmów, przygotowuje się je na bazie specjalnych odczynników produkowanych specjalnie do tych celów.

Ekstrakty słodowe (Malt extract) - peptony zawierające ściśle określone grupy peptydów; wyciągi sojowe; wyciągi mięsne. Odczynniki te są standaryzowane, tzn. ich skład i stopień czystości jest powtarzalny. Tak więc mogą one być uważane za bazę umożliwiającą utrzymanie stałych warunków przechowywania. Pożywki te są jednak bardzo drogie i nie mogą być wykorzystywane do hodowli w większej skali.

3. Podłoża produkcyjne - są przygotowywane na bazie surowców odpadowych przemysłu rolno-spożywczego, papierniczego i petrochemicznego. Tymi podstawowymi surowcami są takie substancje jak melasa, serwatka, wytłoki nasion oleistych, odpady zbóż, syropy glukozowe, wywary (to co pozostaje po oddestylowaniu alkoholu), namoki kukurydziane. Surowce te są trudne do wykorzystania jako składniki podłoży, ponieważ mają nie w pełni powtarzalny skład, zależny od pochodzenia surowców, warunków klimatycznych. Surowce te zwykle szybko ulegają zakażeniom, mimo tych mankamentów stanowią podstawę dla przygotowania podłoży do procesów biosyntezy ze względu na bardzo niską cenę.

O ile podłoża minimalne i odżywcze miały najczęściej zbilansowany skład o tyle w podłożach produkcyjnych dane składniki podłoża są dodawane w ilościach zwiększonych w celu pobudzenia biosyntezy danego produktu np. przy produkcji kwasu cytrynowego dodaje się zwiększone ilości sacharozy. Podstawowym problemem kompozycji podłoży produkcyjnych jest to, że używane w nich produkty odpadowe typu melasa, odpady zbożowe, serwatka stanowią swoisty konglomerat substancji będących zarówno źródłem węgla, azotu, fosforu i mikroelementów.

Następnym poważnym mankamentem surowców do podłoży produkcyjnych jest to, że maja one niepowtarzalny skład i zależy on od pochodzenia surowca i warunków klimatycznych. Bez względu na te trudności podstawową zasadą przygotowywania podłoży jest to by posiadały one:

• źródło węgla, ponieważ jest to podstawowy składnik organiczny komórki i źródło energii,

• związki azotowe, bo jest to składnik białek i kwasów nukleinowych jak również koenzymów,

• tlen i wodór, są to komponenty wody, jak i komponenty związków komórkowych,

• związki siarki, jest to składnik białek i niektórych koenzymów,

• związki fosforowe, składnik kwasów nukleinowych, fosfolipidów, nukleotydów i niektórych koenzymów,

• potas i magnez, te dwa pierwiastki traktowane są jako makroelementy i są one ko faktorami wielu enzymów.

Pozostałe pierwiastki takie jak: wapń, mangan, żelazo, nazywane są mikroelementami.

Najważniejsze substraty stosowane w podłożach produkcyjnych jako źródło węgla:

• Melasa, odpad przemysłu cukrowniczego, zawierający do 80% suchej masy, w czym połowa to sacharoza. Związków azotowych w melasie jest niewiele, poniżej 2%. Melasa zawiera cenne witaminy i substancje wzrostowe, jest to przede wszystkim biotyna, pentotemian wapnia, inozytol i tiamina. Mankamentem melasy jest to, że może zawierać metale ciężkie w stosunkowo wysokim stężeniu oraz kwasy lotne. Kwasy lotne mogą ograniczać wzrost mikroorganizmów, a metale ciężkie przenikać do produktu.

• Syropy glukozowe, jest to w pewnym sensie odpowiednik melasy, z tym że jest to odpad z fabryk produkcji glukozy ze skrobi ziemniaczanej. Zawartość związków azotowych w tym odpadzie jest niewielka, również poniżej 2%.

• Serwatka - odpad przemysłu mleczarskiego, zawiera w swoim składzie laktozę (4%) i stosunkowo dużą ilość białek rozpuszczalnych, substancje tłuszczowe oraz makro i mikroelementy. Serwatka jest uciążliwym surowcem dla biotechnologii, ponieważ łatwo ulega zakażeniom. Jej skład (stosunkowo duża ilość cukrów i białek) powoduje, że nie można jej traktować jako surowca podstawowego ani do produkcji bakterii ani do hodowli grzybów. Tak więc surowiec ten stosowany jest głównie jako dodatek do podłoży hodowlanych i stosowana jest w takich technologiach jak produkcja drożdży paszowych i etanolu.

• Odpady zbożowe (łuski, strąki, otręby), są to surowce zawierające długie skrobie i pochodne celulozy.

Surowcem zawierającym pochodne celulozy są tzw. ługi posiarczynowe, które są odpadem przy produkcji papieru. W krajach, w których trudno o produkty uboczne przemysłu rolno spożywczego stosuje się takie surowce jak: n-alkany, metan, metanol.

Metan, metanol stanowi bardzo dobre źródło węgla dla bakterii metylotroficznych.

Etanol - wykorzystywany jest do produkcji kwasu octowego.

Wywary - często produkt odpadowy jednego rodzaju procesu biosyntezy staje się surowcem do otrzymania innego produktu. Wywar po oddestylowaniu etanolu może być cennym surowcem dla produkcji np. białka paszowego.

Surowce stosowane jako źródło azotu.

Najpowszechniej stosowanymi źródłami azotu są: wytłoki sojowe, mączka rybna, namok kukurydziany.

Namok kukurydziany - produkt uboczny uzyskiwany w procesie ekstrakcji skrobi kukurydzianej. Zawiera szerokie spektrum aminokwasów, witamin i soli mineralnych. Namok kukurydziany jest bardzo cennym surowcem w biotechnologii i często w przypadku problemów ze wzrostem szczepu dodatek namoku kukurydzianego ratuje sytuację. Stosowany jest w większości technologii biosyntezy antybiotyków.

4. PRODUKCJA BIAŁKA MIKROBIOLOGICZNEGO (SCP - single cell protein)

Zainteresowanie produkcją białka z mikroorganizmów wynika z faktu głodu w pewnych regionach świata. Jest nas ponad 6 mld z czego około 1 mld ludzi głoduje, a 1/3 ludności jest niedożywiona. Podstawowym argumentem produkcji białka mikrobiologicznego jest to, że jego synteza trwa zaledwie kilka dni, natomiast otrzymanie tej samej ilości białka zwierzęcego może trwać kilka miesięcy a nawet lat, a białka roślinnego przynajmniej kilka tygodni. Cechą wyróżniającą białko mikrobiologiczne jest jego zdefiniowany skład i wysoka wartość odżywcza. Jeżeli chodzi o skład aminokwasów to SCP klasyfikowane jest tuż za białkiem zwierzęcym i przed białkiem ryb i roślinnym.

Do produkcji SCP wybiera się mikroorganizmy charakteryzujące się szczególnymi cechami:

• szybki i obfity wzrost,

• niewyszukane wymagania pokarmowe,

• nie tworzenie toksyn, substancji rakotwórczych, czy alergenów,

• nie wydzielanie poza komórkę metabolitów, które utrudniały by proces oddzielenia biomasy i oczyszczania produktu.

Do produkcji SCP wykorzystuje się zarówno drożdże jak i bakterie i grzyby strzępkowe. Wśród drożdży najczęściej wykorzystuje się takie gatunki jak Candida, Torulla i Sacharomyces. Wśród bakterii Trichosporan, Methylobacterium, Bacillus. Wśród grzybów Aspergillus. Produkcja SCP prowadzona jest w świecie na dużą skalę i na wszystkich szerokościach geograficznych. Celem tej produkcji jest uzyskanie komponentów białkowych do pasz oraz białka dla uzupełnienia diety żywieniowej człowieka. Do tej produkcji wykorzystuje się także glony Chlorella, który wyróżnia się wysoka sprawnością wykorzystywania energii światła słonecznego. O ile typowe rośliny lądowe czerpią tę energię w ilości 2%, glony Chlorella w ilości 20%. Uwzględniwszy, że surowcem węglowym do syntezy białka komórkowego jest CO₂ białko glonów stanowi najgroźniejszą konkurencję w stosunku do białka typowych jednokomórkowców bakterii i grzybów strzępkowych.

Etapy produkcji SCP:

1. Przygotowanie podłoża hodowlanego.

2. Namnożenie biomasy.

3. Oddzielenie biomasy.

4. Przemywanie komórek.

5. Suszenie → otrzymujemy biomasę surową.

6. Usuwanie kwasów nukleinowych^* (rozpuszczalnik HCl).

7. Suszenie → biomasa o zmniejszonej zawartości kwasów nukleinowych.

8. Rozdrabnianie komórek^*.

9. Ekstrahowanie białek (roztwór alkaliczny).

10. Usuwanie pozostałych kwasów nukleinowych^* → zabieg ten prowadzimy z wykorzystaniem enzymów rozkładających kwasy nukleinowe, na tym etapie nie stosuje się już obróbki kwasami, czy rozpuszczalnikami.

11. Wytrącenie białek → obniżenie pH do punktu izoelektrycznego.

12. Oddzielenie białek.

13. Suszenie → izobat białkowy.

Podsumowując zagadnienie produkcji SCP można wysnuć następujące wnioski, mikroorganizmy używane do biosyntezy białka powinny między innymi:

• możliwość wszechstronnego wykorzystania składników odżywczych takich jak węglowodany, węglowodory, związki azotowe, kwasy organiczne, alkohole i substancje mineralne,

• wyselekcjonowane mikroorganizmy posiadają odpowiedni skład biomasy, tj. wysoką zawartość białka, tłuszczów, węglowodanów, witamin i niską zawartość kwasów nukleinowych. Wyeliminowane zostają składniki antyżywieniowe i alergizujące,

• selekcja szczepów do tej produkcji powinna również obejmować szybkość namnażania (rozbudowany kompleks enzymów oddechowych),

• synteza związków poprawiających wartość odżywczą białek, czyli witamin i specyficznych połączeń związków mineralnych,

• odpornością na niekorzystne składy podłoża i warunków hodowli,

• szczep do produkcji SCP powinien wyróżniać się takimi cechami technologicznymi by obróbka technologiczna wyprodukowanej biomasy nie sprawiała trudności,

• komórki nie powinny absorbować na swojej powierzchni substancji toksycznych i rakotwórczych, które mogą występować w podłożu.

Korzyści wynikające z produkcji SCP:

• możliwość uzyskania znacznych ilości białka w krótkim czasie. Czas podwojenia biomasy dla mikroorganizmów wynosi zaledwie 0,5-1 godz,

• mikroorganizmy łatwiej podlegają modyfikacji genetycznej dla tego też zwiększona jest możliwość podania produkowanemu białku wymaganych cech np. poprawa składu aminokwasów. Białko SCP zawiera duże ilości lizyny (deficyt w białku roślinnym), zawiera dużo algiliny oraz takie aminokwasy egzogenne jak: leucyna, tyrozyna, tryptofan,

• hodowle mikroorganizmów możemy prowadzić metodą ciągłą, co zapewnia dużą wydajność biomasy i hodowle te mogą być prowadzone niezależnie od warunków klimatycznych.

5. PRODUKCJA KWASU CYTRYNOWEGO

Kwas cytrynowy jest związkiem syntetyzowanym w ramach cyklu Krebsa i uczestniczy w podstawowych przemianach zachodzących w ramach metabolizmu centralnego. W 99% kwas ten produkowany jest metodami biotechnologicznymi, głównie z udziałem pleśni Aspergillus Niger, bądź drożdży Candida lub Yarowia. W przypadku Aspergillus Niger surowcami są melasa lub sacharoza, w przypadku Candida węglowodory, Yarowia surowce zawierające glukozę. Pierwsza produkcja kwasu cytrynowego uruchomiona została w 1923 roku i kwas ten wykorzystywany jest w ogromnych ilościach około miliona ton rocznie. Zastosowanie to przede wszystkim przemysł spożywczy, gdzie stosowany jest jako składnik smakowy lub jako środek konserwujący (60%); 10% używane w farmacji do środków farmaceutycznych i para farmaceutycznych; 20% przemysł chemiczny do środków piorąco - czyszczących, przeciw pienieniu i jako zmiękczacz.

Kwas cytrynowy produkuje się trzema metodami:

1. Solid state.

2. Powierzchniowa - produkcja odbywa się w sterylnych komorach, w których umieszczone są stelarze z zamocowanymi tacami ze stali kwasoodpornej o wysokości 15-18 cm i wypełnia się je podłożem na wysokość 9-12 cm. Napełnianie tac z pożywką, czy sczepienie zawiesiną konidiów odbywa się w sposób zautomatyzowany. Główną zaletą tego typu hodowli są niskie koszty aparatury i łatwość eliminowania ewentualnych zakażeń. W hodowli powierzchniowej jako źródło węgla stosuje się najczęściej melasę, a niekorzystny wpływ zawartych w niej jonów metali ciężkich eliminuje się dodaje się dodając do podłoża ściśle określone ilości żelazocyjanku potasu, który wiąże te jony w nierozpuszczalne związki kompleksowe, które osadzają się na dnie pożywki. Tak więc rozwijająca się na powierzchni podłoża grzybnia praktycznie jest uwolniona od wpływu tych jonów.

3. Wgłębna - prowadzona jest w typowych bioreaktorach z mieszaniem i napowietrzaniem, niekiedy stosuje się bioreaktory kolumnowe, w których panują dokładniejsze warunki mieszania zapobiegające rozrywaniu strzępek grzybni. Grzybnia w hodowli wgłębnej powinna wykazywać wzrost w postaci kuleczek (kłębuszków), które określa się terminem pellets o średnicy około 0,5-1,5 mm. Taki wzrost grzybni powoduje, że zawiesina hodowlana zachowuje właściwości płynu Newtonowskiego, a tym samym nie zakłócona zostaje efektywność mieszania i napowietrzania. Nie wskazane natomiast jest wzrost szczepów w postaci luźnych strzępek. Taki wzrost powoduje, że zawiesina hodowlana ma właściwości pulpy. Płyn ten ma właściwości nie Newtonowskie, co oznacza, że lepkość tego płynu zależy od szybkości ścinania, tzn. jest bardzo niski w pobliżu łopatek mieszadła i wysoki na obrzeżach fermentora. W praktyce oznacza to, że mieszaniu i napowietrzaniu podlega tylko grzybnia znajdująca się w pobliżu łopatek mieszadła, a na obrzeżach fermentora powstają strefy martwe, gdzie możliwość dyspersji powietrza jest ograniczona, tak samo jak dopływ pożywki i odprowadzanie produktu. Grzybnia w tej formie nie pozwala na rozproszenie pęcherzyków powietrza i następuje ich koagulacja, a w konsekwencji rozrywanie masy płynu dużymi ilościami gazu. Nie wskazane jest również by grzybnia rosła w postaci pellets o średnicy większej niż 3 mm. Penetracja pożywek i tlenu do jej wnętrza jest utrudniona, a grzybnia wewnątrz kuleczki po pewnym czasie może ulegać autolizie. Najczęściej stosowanym surowcem w hodowli wgłębnej jest sacharoza (nie melasa!!), ponieważ bezpośredni kontakt grzybni z substratem wyklucza możliwość uchronienia grzybni przed niekorzystnymi składnikami zawartymi w melasie. Mimo stosowania w warunkach wgłębnych droższego substratu jest ona bardziej wydajna i proces hodowli trwa przynajmniej kilkanaście godzin krócej niż w przypadku hodowli powierzchniowej.

WYKRES - Biosynteza kwasu cytrynowego

Cykl produkcji kwasu cytrynowego z udziałem Aspergillus niger trwa zwykle 6-7 dób. Grzybnia rośnie do trzeciego dnia hodowli i jej namnażanie w dalszej części procesu utrzymuje się na stałym poziomie. Jako źródło azotu stosowany jest najczęściej azotan amonu. W pierwszej kolejności jako łatwiej przyswajalne wykorzystywane są jony amonowe, w kolejnych dniach hodowli azotany. Źródło azotu dodawane jest do podłoża w ilościach limitujących wzrost. Źródło węgla natomiast (sacharoza, melasa) dodawane jest w wysokim stężeniu dochodzącym do 20%. Podczas wzrostu źródło węgla wykorzystywane jest w zaledwie 40% po zakończeniu wzrostu w 60%. Podłoże produkcyjne zawiera limitowane ilości fosforanów oraz jonów manganu, cynku, magnezu i żelaza. Deficyt ten powoduje ograniczenie funkcji układu oddechowego oraz możliwości pozyskiwania przez komórki energii. Przy tej kompozycji podłoża między pierwszą a drugą dobą hodowli komórka zaczyna odczuwać deficyt źródła azotu, fosforu i mikroelementów przy jednoczesnym nadmiarze źródła węgla i w tej sytuacji może jedynie utlenić cukier do związku pośredniego, którym jest kwas cytrynowy. W warunkach nielimitowanych substrat uległ by utlenieniu do CO₂ i H₂­O. Dzięki znajomości mechanizmu syntezy kwasu cytrynowego produkt ten uzyskiwany jest z bardzo wysoką wydajnością dochodząca do 90%.

Uwarunkowania metaboliczne biosyntezy kwasu cytrynowego:

Kwas cytrynowy powstaje w wyniku kondensacji szczawiu octanu i acetylo - koenzymu A. Głównymi szlakami funkcjonującymi u Aspergillus niger są glikoliza, cykl heksozomonofosforanowy i glioksalowy. Podczas wzrostu grzybni aktywność szlaku EMP do HMP jest 2:1. W fazie produkcji ten stosunek wynosi 4:1. Tym samym glikolizę w fazie produkcji należy traktować jako szlak dominujący. Pierwszym enzymem o istotnej roli dla produkcji kwasu cytrynowego jest fosfofruktokinaza powodująca przekształcenie 1,6-fosfofruktozy do dwóch trioz fosfoenolopirogronianu. Dla syntezy cytrynianu potrzebne są ogromne ilości szczawiooctanu. W związku z tym uruchamiane są reakcje wspomagające w czasach, w których następuje fosforylacja fosfoenalopirogronianu i pirogronianu do szczawiooctanu. Szczawiooctan jest najbardziej reaktywnym związkiem cyklu Krebsa, łączy się łatwo z acetylo - koenzymem A tworząc cytrynian. U dzikich szczepów występuje mechanizm regulacji polegający na tym, że przy nadmiarze cytrynianu zahamowaniu ulega fosfofruktokinaza. U szczepów produkcyjnych ten mechanizm regulacyjny nie funkcjonuje, został zniesiony. O wysokiej wydajności kwasu cytrynowego decyduje również włączenie się cyklu glioksalowego, w ramach którego izocytrynian rozpada się do bursztynianu i glioksalanu. Glioksalan z acetylo - koenzymem A tworzy szczawiooctan dając podstawę do utworzenia kolejnej cząsteczki cytrynianu.

6. BIOSYNTEZA ANTYBIOTYKÓW NA PRZYKŁADZIE PRODUKCJI PENICYLINY G

Antybiotyki są to substancje wytwarzane prze mikroorganizmy lub organizmy wyższe działające w niskim stężeniu rzędu mikrogramów, bójczo w stosunku do wybranych grup mikroorganizmów. Do syntezy tych związków wykorzystuje się zarówno promieniowce, grzyby, jak i bakterie. 75% spośród znanych antybiotyków tworzonych jest przez promieniowce z rodzaju Streptomyces, z tej puli 90% wykorzystywane jest w lecznictwie. Antybiotyki oprócz podstawowego działania (bójczego) są lekami wspomagającymi przy leczeniu nowotworów, przy dokonywaniu przeszczepów. Antybiotyki są produktami metabolizmu peryferyjnego (wtórnego, drugorzędowego), czyli syntetyzowane są w ramach dodatkowych przemian w komórce poza przemianami związanymi bezpośrednio ze wzrostem i zdobywaniem energii. Antybiotyki - idiolity, ponieważ ich synteza przebiega w idiofazie.

Zjawisko antybiozy zostało wykryte w 1929 roku przez A. Fleminga, pierwotna fabryka penicyliny ruszyła w 1942 roku i uruchomiona została przez Waksman'a w USA.

Penicylina G

Antybiotyki klasyfikuje się w oparciu o różne kryteria:

1. Budowa chemiczna:

1. Antybiotyki laktamowe (penicylina).

2. Polipeptydowe.

3. Amino glikozydowe produkowane przez Streptomyces (Streptomycyna).

4. Tetracykliny.

5. Makrolidowe.

6. Polienowi.

7. Inne (chloramfenikol).

2. Podział ze względu na mechanizm działania:

1. Zakłócające syntezę ściany komórkowej (penicylina).

2. Zaburzają funkcje błony cytoplazmatycznej - rządzi transportem (np. nystatyna).

3. Hamują syntezę kwasów nukleinowych na poziomie replikacji i transkrypcji.

4. Zakłócają translację - syntezę białka (np. erytromycyny).

5. Zakłócają procesy energetyczne - mają działanie uboczne(aktynomycyny).

3. Ze względu na zakres działania:

1. O średnim spektrum działania - penicyliny, afelomyces.

2. Gram +.

3. Gram -.

4. Działają na prątki gruźlicy.

5. Przeciwgrzybowe.

6. Przeciwnowotworowe.

Do produkcji penicyliny wykorzystuje się Panicylium chrysogenum lub Penicylium notatum.

Źródłem węgla w tej biosyntezie jest zwykła mieszanina glukozy i laktozy.

Źródło azotu, podobnie jak w produkcji kwasu cytrynowego, to azotan amonu, źródło to uzupełnione jest dodatkiem namoku kukurydzianego (cenne aminokwasy chroniące wzrost i biomasę), specyficzne dodatki np. olej arachidowy lub palmowy.

Hodowle prowadzi się metodą wgłębną w typowych bioreaktorach z mieszaniem i napowietrzaniem, muszą być wyposażone w sprawne systemy dozowania pożywek i kontroli pH.

WYKRES - Biosynteza penicyliny

Od drugiego dnia po troszeczku dozujemy prekursor, którym jest fenylooctan, w przypadku penicyliny G fenylooctan jest toksyczny dla grzybni, tak więc musi być precyzyjnie dozowany, jego stężenie nie może przekraczać 3g/l.

W czasie wzrostu temp 27°C, a czasie produkcji 24°C.

Trzeba cały czas kontrolować, czy nie brakuje np. źródła azotu, ponieważ może nastąpić autoliza grzybni. Dlatego w fazie ostatniej technologowie muszą precyzyjnie dbać o kondycję grzybni (stężenie laktozy, nie może zabraknąć!!).

Opis schematu:

Produkcja penicyliny stanowi przykład biosyntezy III typu według podziału Gadena. Produkt gromadzony jest w fazie stacjonarnej. Głównym celem opieki technologicznej jest utrzymanie w jak najdłuższym czasie grzybni w fazie aktywności biologicznej oraz nie dopuszczenie do autolizy. Autoliza oznacza koniec produkcji antybiotyku, uwolnienie do podłoża substancji, które utrudniają oczyszczanie produktu. Autolizę kontroluje się mierząc odczyn pH (wzrost pH do warości 8 oznacza intensywną autolizę).

Opieka techno logiczna nad produkcja penicyliny:

• Przygotowanie odpowiedniego podłoża - podłoże powinno zawierać kompozycję łatwiej i trudniej przyswajalnego źródła węgla (glukoza, laktoza). Podobnie źródło azotu.

• W czasie wzrostu utrzymujemy temperaturę na poziomie 27°C aby wydłużyć maksymalnie fazę stacjonarną obniżamy temperaturę do 24°C.

• By opóźnić ewentualną autolizę grzybni w fazie stacjonarnej należy nie dopuścić, żeby zabrakło w podłożu laktozy, czy azotanów - w pożywce są precyzyjnie dozowane i stężenie laktozy jest utrzymywane na poziomie 1g/l.

• Od drugiego dnia hodowli precyzyjnie dodawany jest prekursor syntezy antybiotyków, w przypadku Penicyliny G jest to fenylooctan, w przypadku Penicyliny V jest to fenoksyoctan.

• Precyzyjnie kontrolowana hodowla może trwać nawet 8 dni. Moment wzrostu pH zawiesiny hodowlanej wymusza natychmiastowe zakończenie hodowli.

1

---