Wykład1T:Rolnictwo i biotechnologia rolna – Trendy rozwojowe w XXI wieku w ujęciu historycznym

1.Biotechnologia jest to dziedzina jednocząca biologię molekularną, cytologię, genetykę, biochemię, technologię chemiczną i ekonomię w celu uzyskania użytecznych fragmentów, elementów struktur komórkowych i samych komórek.

Biotechnologia w ujęciu klasycznym rozwijała się razem z rolnictwem.

Początki rolnictwa to okres udomowienia roślin i zwierząt jako źródła żywności i innych surowców. Spowodowało to przejście z okresu zbieractwa do rolnictwa. Przejście to było stopniowe i rolnictwo zastępowało zbieractwo jako źródło żywności. Cywilizacje starożytne posiadają już dobrze udokumentowane dowody postępu rolniczego uzyskanego poprzez stopniową hodowlę (selekcję) roślin i zwierząt.Udomowienie roślin i zwierząt było ściśle związane ze zmianami w przechowywanej żywności – spowodowane głównie przez mikroorganizmy – pojawiają się produkty fermentacji – wino, piwo, sery, ocet.

Stopniowe ulepszanie odmian i gatunków roślin i zwierząt poprzez intuicyjną hodowlę doprowadziło do powstania nowych genotypów lepiej dostosowanych do środowiska i o lepszych parametrach użytkowych. Odkrycie w 2-giej połowie XIX w. praw Mendla i ich zastosowanie w XX w. umożliwiło planową hodowlę roślin i zwierząt. Szybki rozwój nauki i technologii doprowadził do znacznego postępu w rolnictwie. Zastosowanie metod hodowlanych opartych na genetyce mendlowskiej poprawiło wydajność i jakość produkcji rolniczej owocując tzw. „zieloną rewolucją”, która zaspokoiła podstawowe potrzeby żywieniowe na olbrzymich obszarach głodu, poprzez wprowadzenie karłowych odmian zbóż i wysokowydajnego ryżu. Zwiększona została produktywność roślin i zwierząt. Klasyczne metody hodowli zostały zrewolucjonizowane na początku lat 70-tych poprzez pierwsze klonowanie DNA. W ciągu lat 70-tych i 80-tych osiągnięto szereg klonowanych mikroorganizmów i wraz z postępem technik również roślin i zwierząt. Te nowoczesne techniki zostały określone jako „nowa biotechnologia”

2.Ograniczenia rozwoju tradycyjnego rolnictwa. Przejście od produkcji na rynek lokalny do produkcji na rynek globalny – powoduje istotne zmiany cen – jej wahania są uzależnione od światowego popytu i podaży. Rolnictwo jest ściśle uzależnione od dostępności naturalnych źródeł umożliwiających produkcję – takich jak ziemia uprawna, woda.

Obydwa główne środki produkcji są ograniczone i ich dostępność ulega zmianie. Zmiany czystości wód i powietrza także wpływają na jakość produkcji rolniczej. Na dostępność dla określonej produkcji wpływają zmiany klimatyczne, stepowienie gleb, ich „pustynnienie”, zanieczyszczenie i wykorzystanie na cele nierolnicze – urbanizacja i industrializacja. Wiele regionów o bardzo dobrych glebach szczególnie przylegających do dużych rynków zbytu produktów rolnych jest wykorzystywanych przez budownictwo (real estate), przemysł. Częściowym rozwiązaniem tzw. „zielone pasy” wokół dużych aglomeracji.

Możliwość obejścia technologicznego problemów klimatycznych stwarzają szklarnie, wykorzystanie energii słonecznej, nowoczesna techniki irygacji, zastosowanie odsalania wody i jej wielokrotnego użycia. Te metody mają zastosowanie wyłącznie w celu produkcji „poza sezonem”. Klasyczne metody hodowli mające na celu opracowanie odmian odpornych na niekorzystne warunki środowiska umożliwiają częściowe zagospodarowanie terenów zasolonych i suchych. Takie wytrzymałe na stres odmiany będą wykorzystywane na obszarach o dotychczas marginalnym znaczeniu. Powyżej wymienione możliwości będą głównie wykorzystane w produkcji ogrodniczej i chronionej produkcji zwierzęcej z zastosowaniem komputerowo sterowanego środowiska. Koszt takich systemów jest tak wysoki, jest on czynnikiem limitującym jego zastosowanie i co więcej wymaga wysokokwalifikowanej kadry.

3.Zastosowanie biotechnologii w rolnictwie- Podstawowym zastosowaniem biotechnologii w rolnictwie jest włączenie jej do programów hodowlanych. W tym układzie metody biotechnologiczne są i będą bardzo przydatne. Najczęściej stosuje się metody analizy DNA, RNA lub białek jako markerów określonych cech wskazujących czy pożądana cecha znajduje się w analizowanym materiale czy nie. Można zastosować analizę DNA metodą RFLP, markery powtórzeń sekwencji DNA, analizę syntetyzowanych RNA oraz stosunkowo najstarsza metoda analizę izoenzymów.

Techniki rekombinacji DNA i techniki in vitro zastosowano jako:

1. narzędzie w klasycznej hodowli,

2. tworzeniu transgenicznych roślin, zwierząt i innych organizmów

3. jako metody diagnostycznej.

Metody te mają jedną wadę – są drogie. Wymagają dużych nakładów inwestycyjnych i na badania i rozwój (około 20% kosztów) oraz funduszy inwestycyjnych (31%). Zyski wahają się od 50 do 100% w stosunku do wartości rynkowej firmy.

4.Regulacje prawne i klimat społeczny. Decydują o zastosowaniu praktycznym produktów modyfikowanych genetycznie na rynku. Jednak niezależnie od klimatu społecznego organizmy te będą miały coraz większy udział w produkcji żywności oraz w medycynie. Próby powstrzymania rozwoju biotechnologii, włącznie z GMO, na drodze prawnej, przypominają prawo brytyjskie z początków XX wieku nakazujące poprzedzanie samochodu przez człowieka z flagą oznaczającą niebezpieczeństwo (czas pokazał, że mieli rację – ale nie ta droga). Istniejący w Polsce niekorzystny klimat społeczny do zastosowania roślin genetycznie modyfikowanych w mojej opinii wynika z jednostronnej informacji o potencjalnych niebezpieczeństwach ekologicznych bez podania prawdopodobieństwa wystąpienia zagrożenia. Tzw. „Protest Berga” w latach 70-tych XX wieku zwrócił uwagę na możliwe niekorzystne konsekwencje inżynierii genetycznej mikroorganizmów. Efektem było wprowadzenie odpowiednich regulacji prawnych, które nie zatrzymując postępu badań, umożliwiły uzyskanie mikroorganizmów produkujących substancje o wyższej wartości terapeutycznej za znacznie niższą cenę. Jednocześnie nie spotkałem się z informacjami o zwiększonym zagrożeniu przez te mikroorganizmy. Podobnie przegląd literatury na temat tzw. alergenności soji modyfikowanej genetycznie wskazuje, że wyniki nie są jednoznaczne.

5.Podstawowe dziedziny zastosowania biotechnologii w rolnictwie

1. rośliny nasienne i zwierzęta dla przemysłu farmaceutycznego – cytokiny i białka produkowane przez tytoń, czynniki krwi w tym białko serum, czynnik VIII produkowane do mleka przez kozy, erytopoetyna i laktoferyna przez bydło.

2. techniki hodowli roślin

   1. mikropropagacja – produkcja wysokiej klasy ujednoliconych roślin.

   2. Genetyka komórek somatycznych – produkcja roślin haploidalnych i somatyczna hybrydyzacja – uzyskanie roślin haploidalnych z mikro i makrospor do celów hodowlanych.

   3. Rośliny transgeniczne – wprowadzone są na rynek w USA, Kanady, Ameryki południowej i Środkowej, Azji Dalekowschodniej, Australii i ostatnio Unii Europejskiej – odmiany niedojrzewających bananów, pomidor o grubej skórce, soja, kukurydza odporne na środki ochrony roślin, ryż zawierający karoten itp.

   4. Wielkoskalowa produkcja in vitro materiału roślinnego

   5. Zachowanie bioróżnorodności zarówno w aspekcie odmian i ras hodowlanych jak i w aspekcie biologicznym (ochrona rzadkich gatunków).

3. Kontrola zagrożeń biologicznych, diagnostyka. Możliwość szybkiego

wykrycia rodzaju czynnika inwazyjnego i jego precyzyjnej identyfikacji – dotyczy chorób roślin i zwierząt oraz człowieka.

1. Oczyszczanie środowiska – wykorzystanie roślin i alg do absorpcji metali

ciężkich. Rozwój tzw. biofiltrów – detoksyfikacja, odsalanie wody

i oczyszczanie ścieków.

Biotechnologia, włącznie z organizmami genetycznie modyfikowanymi, już znalazła szerokie zastosowanie w szeroko pojętej produkcji żywności i w farmacji. Nie można powstrzymać jej coraz szerszego zastosowania praktycznego. W bieżącym roku metody te dokonały ostatecznego przełomu, na miarę transplantacji serca przez dr Barnarda, poprzez wyhodowanie całego organu ludzkiego i wprowadzenia go do człowieka. Wyk2

Mikropropagacja- zalety i wady mikropagacji metody mikcropropagacji, wybór ex plantu, pożywki, stadium I- sterylizacja, stadium II- namnożenie stadium III-IV- ukorzenienie zahamowanie i przeniesienie do szklarni

Zalety i wady mikropropagacji- prędkość- około 10 krotny wzrost- możliwa produkcja miliona roślin z jednej w ciągu roku, Axenic- zapewnia że explant jest wolny od jakichkolwiek zanieczyszczeń tak więc i otrzymane rośliny są niezabueczyszczone, rozmnażanie przez klonowanie, cena 0,15e/ expalnt

Metody mikropropagacji- pochwa liściowa (>95% całości micro propagacji, genetycznie stabilna, nieskomplikowana i powtarzalna, formowanie pędów- wydajny ale często genetycznie stabilny somatyczna embriogeneza- rzadko stosowana, potencjalnie bardzo wydajna

Wybór ex plantu- pożądane właściwości ex plantu, łatwa sterylizacja, młoda sterylizacja, dobra odpowiedź na kulturę, fragmenty łodygi, zawiązek liścia, nasiona Hypocotyl (z kiełkującej rośliny), liście

Składniki pożywki- sole nieorganiczne, źródła węglowodanów, witaminy, woda, roślinne hormony- auksyny cytokininy GA’s, czynniki zestalający, niezdefiniowane składniki

Węglowodany- rośliny w kulturze zwykle nie mają warunków do fotosyntezy zwykle stosuje się 2-3% sacharozy w/v, niekiedy stosuje się glukoza albo mieszanina glukozy i fruktozy, w wielkoskalowej produkcji stosuje się tańsze źródła cukrów (syrop kukurydzy, melasa)

Kultury fotoautotroficzne- wzrost bez źródło węgla wymaga wzmożonej fotosyntezy, wysoka intensywność światła (90-150uMole/m2/s) normalna (30-50), najczęściej podwyższone stężenie CO2 (1000ppm) normalne 369.4ppm, znacznie zredukowane zakażenie ułatwię przeniesienie roślin do szklarni

Zawartość składników nieorganicznych- zawiera Seroki zakres makro-elementów (>mg/l) i mikroelementów (<mg/l), wiele gotowych pożywek jest przygotowanych przez suszenie rozpyłowe, najbardziej popularna jest pożywka Murashige and Skoog Medium (1965) Pożywka Gamborga B5 jest szeroko stosowana z hodowli zawiesinowej (-NH3)

Hormony roślinne (regulatory wzrostu)- auksyny, cytokininy, kwas giberelinowy, etylen, kwas Abscyzynowy, „Plant Growth Regulator-like compounds” Witaminy- stosuje się szeroki zakres witamin, ogólnie- im mniejszy ex plant tym bardziej sprecyzowane wymagania zawartości witamin, często używa się witamin (kwas nikotynowy, glicyna, tiamina, pirydoksyna), Inozytol jest normalnie dostarczany w wysokich stężeniach (100mg/l)

Auksyny- absolutnie wymagane (brak znanych mutantów), tylko jeden składnik kwas indolili-3-octowy dużo syntetycznych analogów (NAA, IBA, 2,4-D, 2,4,5-T, Pichloran)- tańsze i bardziej stabilne, stymulują wzrost korzenie, syntetyzowane w merystemach głównie pędów i transportowane po całej roślinie

Cytokininy- absolutnie wymagane (brak znanych mutantów), pojedynczy naturalny hormon Zeatyna Analogi syntetyczne Benyzladenine (BA) kinetin, stymulują podziały komórkowe (with auksynami), wywołuj formowanie się bocznych pędów, produkowane w merystemie korzeniowym i transportowane jako rybozy zeatyny we floemie.

Gibbereliny (GA)- rodzina 70 związków wszystkie formują kwas giberelinowy, handlowo dostępne GA3 i GA4+9, stymulują etiolowanie pędów, ułatwiają uśpienie nasion i przerwanie wzrostu pędów, wytwarzanie młodych liści

Etylen- zaangażowany w odpowiedź na zranienia, produkowany we wszystkich komórkach powoduje wzrost na grubość łodygi i utratę liści, ogranicza wzrost pędów bocznych, oddziaływuje z białkiem wiążącym etylen (EBT) w błonie komórkowej, wiąże AgNO3 albo norborden EBTalbo norbornadienie do EBP obniżając wpływ etylenu

Kwas abscyzynowy (ABA)- tylko naturalnie, powoduje utratę liści i uśpienie nasion, bierze udział w zamykaniu epidermi w odpowiedzi na stres wodny, stres w embriogenezie w przygotowania zarodka di wysuszenia pomaga w tworzeniu „normalnego” nasiona,

Roślinne regulatory wzrostu- poliamidy istotna rola zarodka, kwas Jasmonowy- włączone odpowiedź na zranienie, kwas salicylowy, nie są uważane za hormony roślin- działają w wysokich stężeniach

Suplementy niezdefiniowane- źródła hormonów witamin i poliamin, np.: mleczko kokosowe, ekstrakt z kukurydzy cukrowej, nie powtarzalne, pracują

Stadium I sterylizacja- bakterie grzyby przerosną ex plant jeżeli nie zostaną usunięte z pożywek, zabiegi wstępne w celu przygotowania explantu, detergenty, sterilazacja i antybiotyki, Zabiegi wstępne- transfer rośliny do szklarni w celu zredukowania skażenia endemicznego, wspomaganie wzrostu pędów bocznych, przemycie usuwające powierzchniowe skażenie,

Zastosowanie detergentów- bąbelki powietrza wokół włosków skórki powierzchnia liścia. Pęcherzyki powietrza na powierzchni explantu mogą chronić bakterie i grzyby przed roztworem sterylizującym, mieszanie może być użyte w celu redukcji liczby bąbelków powietrza, detergenty (np.: Triton, Tween20) redukują napięcie powierzchniowe woskowej kutykuli umożliwiając zwilżenie powierzchni liścia

Czynniki sterylizujące- 3 podstawowe grupy czynników sterylizujących powierzchnię expantu: utlenienie, aktywne chlorowce, zatrucie ciężkimi metalami, silne chemikalia (kwas siarkowy) mogą być użyte do sterylizacji nasion. Zawsze jest zagrożenie, że zabijając zanieczyszczenie zabijemy tez explant, powierzchnia explantu musi być natychmiast chroniona . stosowane czynniki sterylizujące- antybiotyki są rzadko stosowane- wiele jest bakterio statykami i mogą niekiedy wywoływać wadliwy wzrost kultury po ich usunięciu, nie ma fungicydów dla których istnieje pewność, że są nieszkodliwe.

Stadium II namnożenie- wykonaj cięcie w węźle. Usuwa to hamujący wzrost wpływ szczytu pędu na wzrost paczka (dominacja szczytu), GA”s może być użyte w celu etiolacji głównie jeżeli gatunek formuje rozetę, cytokininy mogą być użyte w celu zwiększenia wzrostu pączka (antagonista auksyn), namnażanie jest bardzo pracochłonne

Stadium III i IV ukorzenianie i przeniesienie do szklarni- roślina musi wytworzyć korzenie przez kulturę na pożywce z auksynami lub zanurzenie podstawy explantu w roztworze auksyny, następnie roślina musi zostać zahartowana poprzez wzrost intensywności światła redukcję ilości cukru soli nieorganicznych i wilgotności, pożywka musi zostać usunięta prze przeniesieniem alby zapobiec zakażeniu

Micropropagacja poprzez tworzenie pędów bocznych- pędy powstają w wyniku rozwoju de Novo grupy komórek pędów jeżeli nie ma istniejącego merystemu. Niektóre gatunki (fiołek afrykański) dają aż 3000 pedów z jednego liścia.Inne gatunki (kawa) jes konieczna indukcja niezróżnicowanej masy mnożących się komórek (kalkus) przed tworzeniem pędów.

T:Konserwacja in vitro roślinnego materiału genetycznego

Celem jest zabezpieczenie materiału genetycznego zarówno z punktu widzenia ochrony gatunkowej jak i zabezpieczenia zasobów genetycznych dla zastosowań praktycznych.

Grupy roślin ze względu na rozmnażanie w odniesieniu do przechowywania i tworzenia banków:

-rośliny produkujące suche nasiona, które można przechowywać w niższej temperaturze,

-rośliny produkujące heterozygotyczne nasiona, rozmnażane wegetatywnie – ziemniaki, trzcina cukrowa, kasawa,

-produkujące najczęściej duże nasiona z dużą ilością endospermy, nie nadające się do przechowywania – kokos, awokado, mango, kakao,

Tradycyjne banki genów rozwinęły metody zachowania roślin poprzez ich wysiewanie. Zaletami są: łatwy dostęp do roślin, łatwość obserwacji. Wady to przede wszystkim zależność od pogody i jej zmian oraz bardzo duże koszty utrzymania i wrażliwość na kryzysy ekonomiczne. Techniczne problemy łączą się z przynależnością roślin do poszczególnych grup. Najłatwiejsze w przechowywaniu są rośliny I grupy. Występują problemy z ich sterylnością i czystością. W przypadku pozostałych grup bardzo istotnym elementem jest ich czystość mikrobiologiczna. W przypadku kultur in vitro zakłada się, że po odpowiednim traktowaniu jak stosowanie kultur merystemów wierzchołkowych, odwirusowywanie podwyższoną temperaturą i dodatek antybiotyków i fungicydów do pożywek zabezpiecza przed patogenami. Sprawdzianem czystości mikrobiologicznej mogą być testy na ich wykrywanie.

1.Podstawowe etapy wprowadzenie rośliny do kolekcji in vitro:

1.pobór rośliny i polowa kultura in vitro

uzależniony od przynależności rośliny do w/w grup. Przykład orzecha kokosowego jako rośliny najtrudniejszej przy pobieraniu zarodków. Podobnie cytryna, awokado, kakao. Sterylizacja owocu otwartym płomieniem i dopiero potem można izolować nasiona, pamiętając o zachowaniu sterylności. Trawy można pobierać materiał z źdźbła – pobiera się duży fragment i potem jest on poddawany właściwej obróbce w laboratorium.

Trzeba pamiętać, że jedna metoda nie może być stosowana wszędzie. Należy zachować odpowiednią elastyczność

2. Wymiana zarodków Wyprowadzone kultury często podlegają wymianie pomiędzy laboratoriami, wysyłane są do testów na obecność patogenów. Opracowane są odpowiednie techniki, bazujące na standardowych tokach postępowania w masowym rozmnażaniu roślin. Stosowanie zwiększonego stężenia substancji żelującej może ułatwić przesyłanie kultur na płytkach. Rośliny mogą być przesyłane zgrzewanych torebkach polietylenowych – lepsze od szklanych lub plastikowych pojemników.

1.Przechowywanie w warunkach wolnego wzrostu.

Dotyczy tylko czasu przechowywania około 1 roku. Istotnym elementem są wszystkie czynniki redukujące szybkość wzrostu. Najczęściej stosowana jest obniżona temperatura. Wartość jej zależy od rośliny. Coffea arabica jest przechowywana w temperaturze , Jabłko w , truskawka w . Innym sposobem jest zmiana oświetlenia – jego redukcja – truskawka w ciemności. Modyfikacja pożywki – zmniejszenie zawartości minerałów

-eliminacja cukru -dodatek osmotycznych inhibitorów wzrostu – mannitol

-dodatek hormonalnych inhibitorów wzrostu – kwas absyzynowy

-Zmiana pojemników, w których znajduje się roślina i objętości pożywki.

Innymi technikami spowalniającymi wzrost są:

zmiana środowiska gazowego – obniżenie dostępności tlenu pokrycie parafiną kultury, olejem – dotyczy kalusa.

Otoczkowanie eksplantów – nasiona somatyczne.

Przesuszenie roślin – zmniejszenie zawartości wody niekiedy do 10 – 15%

Krioprezerwacja- Polega na przechowywaniu kultury, somatycznych zarodków, tkanki w niskiej temperaturze – od –78 do . Warunek - bardzo szybkie zamrożenie i powolne odmrażanie – musi być prowadzone umiejętnie.

odwodnienie i otoczkowanie. Opracowane do produkcji tzw. syntetycznych nasion. Krioprezeracja stosowana dla merystemów wierzchołkowych, nasion somatycznych i mikrosporowych embrionów. Przed otoczkowanie materiał jest przygotowywany w celu podniesienia zdolności przeżycia – traktowanie obniżoną temperaturą – zwiększa zawartość nienasyconych kwasów tłuszczowych. Otoczkowanie prowadzi się najczęściej w alginianie , karaginianie. Po otoczkowaniu następuje odwodnienie – przepływ suchego sterylnego powietrza albo z silikażelem 13% embriony somatyczne, 30 – 35% wierzchołki wzrostu.

Zamrożenie – szybkie poprzez zanurzenie w ciekłym azocie, lub powolne - 2°C/min do . Rozmrażanie – zwykle próby umieszczane są bezpośrednio na stałej pożywce. Niekiedy przechowuje się je w ciemności w medium zawierającym regulatory wzrostu. Przeżycie rozmrażania zależy od reżimu procedury. Otoczkowane próby muszą zostać wyekstrahowane z otoczki. Krioprezerwacja często jest poprzedzona procedurą tzw. wzrostu i wysuszenia (pregrowth-desiccation)

Polega na dodatkowych etapach przed zamrożeniem.

wzrost próby (10 - 48 godz.) z dodatkiem krioprotektorów – substancje obniżające krystalizację wody. Odwodnienie – osuszenie sterylnym powietrzem lub silikażelem.

Wydajność metody przechowywania około 40 – 60% roślin wykiełkowało po zastosowaniu tego systemu po 4 latach.

Witryfikacja – metoda polegająca na zamrożeniu próby z lodem bezpostaciowym – szkło.

Bardzo istotne jest zastosowanie wstępnego traktowania w wysokim stężeniu substancji zapobiegających krystalizacji wody następuje szybkie odwodnienie, zamrożenie i rozmrożenie. Krioprezerwanty – gliceryna, glikol etylenowy, glikol propylenowy, DMSO, sorbitol, albumina z krwi bydlęcej. Przeżywalność około 95%.

T:Bezpłciowa genetyka komórek

Jest to ogromne narzędzie biotechnologii. Obejmuje pracę z:

Komórkami somatycznymi, Komórkami generatywnymi, Fuzję komórek somatycznych Umożliwia bezpłciowe zwiększenie zróżnicowania genetycznego, modyfikację somatycznych genomów i selekcję każdego uzyskanego drogą bezpłciową genotypu. Z punktu widzenia technicznego stwarza możliwości: -Analizy dużej ilości indywidualnych genotypów na bardzo małej powierzchni – płytka Petriego, -Traktowanie haploidalnych komórek tak jak sporofitów,- analizy prostszych genomów haploidalnych, umożliwiając wykrywanie genów recesywnych i po podwojeniu genomu uzyskiwanie linii homozygotycznych

Komórki mogą służyć do izolacji informacji genetycznej, wymiany fragmentów genomów na drodzy fuzji komórek, przeniesienia za pomocą wektorów albo przez bezpośrednie przeniesienie DNA. Tylko bezpłciowa genetyka umożliwia rekombinację genomów cytoplazmatycznych. Kultury tkankowe nie są uzależnione od zmian środowiska naturalnego.

Zawsze warunkiem sukcesu jest włączenie technik biotechnologii w klasyczne metody hodowli. Ułatwiają one znacznie selekcję i w przyszłości gwarantuję lepsze parametry produkcyjne, jeżeli zostały właściwie włączone do programu hodowlanego. Skracają czas niezbędny do wyprowadzenia nowych odmian.

1.Typy wariancji somatycznych

-Zróżnicowanie somaklonalne – są to spontaniczne zmiany w fenotypie u roślin regenerowanych z kultur tkankowych i komórkowych. Szczególnie często występują przy szybkim namnażaniu roślin z kultury kalusowej, Sprzężona jest często z chromosomowymi i genomowymi mutacjami. Są one najczęściej nietrwałe, rośliny przeniesione do warunków polowych mogą zginąć lub zmienić szlaki metaboliczne dostosowując się do warunków, i dlatego można niektóre wykorzystywać w hodowli.

-Protoklonalne zróżnicowanie – jest to zróżnicowanie protoplastów. Występuje bardzo często w hodowli protoplastów ziemniaków. Skrócenie fazy kalusa znacznie zmniejsza, lecz nie eliminuje zróżnicowania. Poliploidy łatwiej przeżywają zmiany somaklonalne od diploidów a szczególnie wrażliwe są haploidy.

Wykorzystanie zróżnicowania bezpłciowego uzyskanego w populacji komórek

Selekcja na odporność na patogeny.

Przeprowadza się ją w kulturach komórkowych lub tkankowych w medium zawierających patogen lub jego ekstrakt albo toksynę produkowaną przez mikroorganizm. Jest szybka metoda uzyskiwania odporności – bardzo szybka selekcja. Problem z utrzymaniem odporności po regeneracji rośliny w uprawie polowej. Uzyskano odporność ziemniaków na Erwinia spp. w hodowli protoplastów. Inną rośliną była kapusta – selekcję prowadzono w obecności 1 μM sirodesminy. Uzyskano dodatnią korelację pomiędzy uzyskaną odpornością kultury i późniejszych roślin w uprawie polowej. Kukurydze selekcjonowano w medium zawierającym toksynę grzybową Helmitosporium - siringomycynę.

Selekcja na stres środowiskowy

-Tolerancja temperaturowa. Dotyczy ziemniaków – wytrzymują przymrozki i pszenicy – zwiększono wytrzymałość rośliny na niską temperaturę.

-Tolerancja zasolenia – otrzymano kultury ryżu wytrzymujące wysokie zasolenie gleby, ale regeneranty nie utrzymały tej cechy.

-Tolerancja wysokich stężeń metali – Cd, Zn, Al. Uzyskano kultury wytrzymujące wysokie stężenie glinu jednak próba regeneracji roślin odpornych się nie powiodły.

-Tolerancja herbicydów. Ziemniaki i jęczmień odporny na atrazin i diuron

Bezpłciowa produkcja linii homozygotycznych

Zasada – uzyskuje się najpierw linię komórek haploidalnych a następnie przeprowadza się ją w homozygotyczny dihaploid . Indukcja androgenetycznych haploidów. – najbardziej popularna metoda uzyskiwania haploidów. Wykorzystuje się mikrospory lub pylniki

Kultura mikrospor w pylnikach – jest łatwiejsza. Często stosuje się ją do hodowli jednoliściennych, jednak istnieje duże prawdopodobieństwo uzyskania roślin albinotycznych.

Kultura izolowanych mikrospor. Najpierw hoduje się pylniki i po kilku tygodniach izoluje się mikrospory. Stosowana w hodowli ziemniaków, jęczmienia. Zalety metody to: olbrzymia populacja haploidalnych komórek , niższy poziom somaklonalnych mutacji, selekcja jest przeprowadzana na najwcześniejszym poziomie hodowli, ekspresja genów recesywnych następuje po podwojeniu genomu.

b

Produkcja drugorzędowych metabolitów.

Wiele spośród produkowanych przez rośliny związków posiada dużą wartość handlową i dlatego opłaca się je produkować prawie niezależnie od kosztów.

Produkt roślina zastosowanie wydajność cena

Kwas rozmarynowy Coleus blumei 21 – 36

Antachinony Mirinda citrifolia 18

Szikonina Lithospermum

Erythrorhizon przeciwbakteryjne 12 4500

Berberyna Thalictrum minus lekarstwo 10,6 3250

Antocyjaniny Perilla frutescens 8,9

Diosgenina Dioscorea deltroidea steroid 3,8 1000

Morfina Papaver somniferum lekarstwo o,025 340K$

Sanguarine P. somniferum antybiotyk 2,5 4800

Paclitaxel Taxus brevifolia przeciwrakowy 0,06 0,6M$

Vincristina Catharanthus roseus przeciwbiałaczkowy 0 20M$

Pierwszorzędowe metabolity podtrzymują podstawowy metabolizm. Metabolity drugorzędowe pośredniczą w relacji roślina – środowisko. Należą do nich min. alkaloidy terpeny, flawonoidy, glikozydy. Uczestniczą one w chemicznej odpowiedzi rośliny na takie czynniki jak: patogeny, stress, czynniki zapylające. Manipulacja zawartością i składem drugorzędowych metabolitów wpływa na oddziaływanie rośliny ze środowiskiem np.: łubin o niskiej zawartości alkaloidów jest chętnie zjadany przez króliki.

Zawartość wtórnych metabolitów w roślinie i ich dostawy na rynek są ściśle skorelowane z klimatem występowaniem szkodników, czynnikami ekologicznymi i polityczną niestabilnością rejonów, w których występują. Z tego względu badania poszły w kierunku kultur in vitro.

Produkcja wtórnych metabolitów przez rośliny może być tylko lepiej zrozumiana poprzez poznanie szlaków ich syntezy i rozwoju roślin związanego z różnicowaniem metabolizmu oraz morfogenezą. Wytwarzanie wtórnych metabolitów znajduje się pod ścisłą kontrolą genomu. Grupa tych wtórnych metabolitów pojawi się okazjonalnie w odpowiedzi na stress albo choroby – fitoaleksyny

Inne metabolity produkowane w odpowiedzi na stress i choroby powstające jednak z istniejących pomocą istniejących, ale aktywowanych enzymów aktywnych w podstawowym metabolizmie – fitoatycypiny.

Metabolity wtórne

Metabolity wtórne występują in vitro

1. W czasie fazy stacjonarnej Alkaloidy indolowe akumulują się w czasie wzrostu Catharanthus roseus w kulturze zawiesinowej. W celu uzyskania odpowiedniego zysku należy najpierw przyspieszyć wzrost a następnie zachodzi akumulacja alkaloidów. Betacyjaniny powstają i akumulują się w czasie wzrostu i podziałów komórkowych Phytolacca americana. W przypadku zastosowania inhibitorów syntezy DNA ich zawartość znacznie spada. Podobnie betacyjaniny powstające w Beta vulgaris w kulturze kalusowej.

2. Kontrola hormonalna. Jej wpływ na poziom wtórnych metabolitów jest dobrze określony. Ogólnie spowolnienie wzrostu związane ze spadkiem poziomu auksyn w medium powoduje wzrost poziomu barwników i alkaloidów. Produkcja nikotyny w Nicotiana tabacum i indolowych alkaloidów w Catharantus roseus jest stymulowana przez cytokininy. Cytokininy w Thalictrum minus stymulują specyficzną 0-metylotransferazę katalizującą metylację norcoclauryny do cocklauryny podstawowego metabolitu w syntezie protoberberynowych alkaloidów.

3. Dojrzewanie komórek. U Papaver bracteatum usunięcie hormonów z pożywki prowadzi do różnicowania się rośliny i w konsekwencji podwyższenia poziomu alkaloidów morfinowych w tkance. Kultury P. somniferum rosnące na pożywce wolnej od hormonów mają zawartość 0,3% s.m. morfiny i 0,25% s.m. kodeiny. Stwierdzono zależność kształtu komórek i produkcji metabolity w przypadku C. Roseus. Komórki elipsoidalne o stosunku długości do szerokości produkowały znacznie więcej katarantyny i ajmaciliny, jeżeli ten stosunek był większy od 2,8. Dojrzewanie i specjalizacja komórek i związana z tym produkcja metabolitu może zostać osiągnięta poprzez odpowiedni dobór technologii prowadzącej do uzyskanie pseudokultury odpowiednich tkanek. Osiąga się to poprzez np. unieruchomienie komórek w fazie stałej, kulturę kontaktową komórek, odpowiednie składniki pożywki symulujące naturalne warunki dla danej grupy. Kultura wspólna komórek produkująch batalaninę (Chenopodium album) z komórkami „pielęgnującymi (Wollfia arrhiza) w wyniku dyfuzji nieznanej substancji z komórek pielęgnujący do produkujących znacznie podwyższa produkcję alkaloidu. Unieruchomienie komórek pieprzu chili (Capsicum annum) powoduje wzrost zawartości kapsikainy.

Adsorbenty stosowane w kulturach komórkowych

Gatunek materiał adsorbent produkt

Vitis vinifera zawiesina Amberlite IR 120 antocyjaniny

Eschscholtzia zawiesina dimetylo antratydyny

Californica siloksylan benzenowe

Lithospermum korzenie XAD-4 szikonia

Erythrorhizon

Coleus blumei komórki unier. DMSO kwas rozmarynowy

1. Rozwój organów. Wiele spośród metabolitów jest syntetyzowanych w korzeniach i później transportowanych do innych organów rośliny. Inne powstają w liściach. Morfinowe alkaloidy są produkowane w korzeniach P. somniferum a magazynowane w organach naziemnych i ich stężenie w nich jest 10x wyższe. Monoterpeny produkowane przez korzenie Artemisia absynthium. Jednak ich zestaw zapachowy jest różny dla roślin rosnących naturalnie i w kulturach in vitro

Produkty stresowe.

1. Komórki poddane stresowi osmotycznemu. Komórki lavandula latifolia poddane stresowi osmotycznemu syntetyzują znacznie więcej monoterpenów w łodygach.

2. Komórki poddane działaniu ultrafioletu. Wpływa znacząca na syntezę barwników.

3. Komórki poddane stresowi biotycznemu lub abiotycznemu. Komórki mogą być poddane bardzo różnym rodzajom stresu. Dodatek homogenatów grzybowych szczególnie patogenów dla danego gatunku roślin wpływa często korzystnie na produkcję metabolitów wtórnych. Kultura maku w pożywce zawierającej ekstrakt z grzybów podwyższa produkcję alkaloidu sanguaryny a nie morfiny. Dodatek homogenatów grzybowych do kultury catharanthus roseus prowadzi do wzmożonej syntezy catharntyny.

Zastosowanie inżynierii genetycznej. Może być wykorzystana w celu zmiany poziomu syntezy określonych białek istotnych w syntezie odpowiednich metabolitów. Wymaga to jednak doskonałej znajomości szlaków metabolicznych.

Ogólnie można stosować następujące drogi:

1. Uzupełnienie niepełnych szlaków metabolicznych

2. Zwielokrotnienie istniejących szlaków

3. Blokada szlaków konkurencyjnych

4. Zmiana regulacji metabolizmu

5. Obniżenie odpowiedzi kaskadowych

   1. Wprowadzenie heterologicznych genów. Polega na uzupełnieniu szlaków metabolicznych syntezy określonego związku. Wprowadzeni hydroksylazy z Hyoscyamus niger do Atropa belladonna znacznie zwiększyło syntezę skopolaminy

   2. Zwielokrotnienie szlaku – polega na wprowadzeniu dodatkowych kopii genu enzymu limitującego syntezę. Wprowadzenie dekarboksylazy tryptofanowej do petunii zwiększyło syntezę barwników. Wprowadzenie syntazy striktozydynowej do Aponaceae zwiększyło syntezę monoterpenów. Wprowadzenie dekarboksylazy ornitynowej do tytoniu zwiększyło dwukrotnie syntezę nikotyny w korzeniach.

   3. Blokada konkurencyjnych szlaków. Glikozydy występujące w krzyżowych wpływają na niekorzystny smak. Strategia obniżenia zawartości glikozydów tiolowych polega na odprowadzeniu związków tiolowych do innych przemian poprzez wprowadzenie transferazy sulfonylowej razem z dekarboksylazą tryptofanowa.

   4. Użycie genów antysensowych. Polega na wprowadzeniu do rośliny fragmentu DNA komplementarnego do mRNA. Powstający dupleks sensowego i antysensowego RNA powoduje zablokowanie translacji sensowego genu i brak odpowiedniego enzymu. Powoduje to zablokowanie ekspresji genu i niepowstawanie produktu, którego obecność jest warunkowana obecnością tego białka. Tę drogę wykorzystuje się w celu eliminacji niekorzystnych składników takich jak np.: glikozydy u krzyżowych i ligniny w drewnie. W przypadku ligniny stosuje się antysensowy RNA komplementarny do fragmentu mRNA 0-metylotransferazy. Taki układ blokuje syntezę prekursorów lignin i one nie powstają.

   5. Minimalizacja odpowiedzi kaskadowej. Wiele systemów regulacyjnych działa na zasadzie kaskady – sygnał zostaje wzmocniony. Polega na nadekspresji genu – zbyt duża zawartość produktu genu powoduje, że przestaje on działać – supresja genu.

Krioprezerwacja różnych gatunków roślin

gatunek	System kultury	przygotowanie	krioprezerwacja	Zamrażanie, przechowywanie i rozmrażanie	odzysk
Sycamora	Zawiesina komórek	Kultura 3 – 4 dni w pożywce z 6% mannitolem	DMSO + gliceryna + sacharoza	-1°C/min do , 30 min, ciekły azot, rozmrażanie - łaźnia wodna	Warstwa komórek w zawiesinie nad półstałą pożywką
soja	protoplasty	Protoplasty z komórek z logarytmicznej fazy wzrostu	5% DMSO + 10% glukoza	-10°C/min do przeniesienie do ciekłego azotu, rozmrażanie jw.	Przemycie ciekłą pożywką i przeniesienie do standardowego medium
ziemniaki	Wierzchołki wzrostu	Wierzchołki wycięte z roślin w szklarni albo z kultury, inkubowane przez noc	10% DMSO	-0,2°C/min do , ciekły azot. Rozmrożenie 1 min w i przeniesienie do +	Przemycie pożywką, osuszenie i przeniesienie do półstałej pożywki
grusza	Wierzchołki wzrostu	Kultura in vitro 22°C/16dni, -1°C/8h, ciemność 7 dni, wycięcie wierzchołków i ich wzrost 48h w pożywce z 5% DMSO	10% PEG +10% glukozy + 10% DMSO	-1°C/min do , przeniesienie do ciekłego azotu, rozmrażanie + 1 min przeniesienie do +	Przemycie pożywką, osuszenie , przeniesienie do pożywki
rzepak	Wierzchołki wzrostu	Wycięte wierzchołki z roślin regenerowanych. Inkubacja 24 h w pożywce z 5% DMSO	15% DMSO	Zamrożenie w ciekłym azocie wierzchołków wzrostu. Rozmrażanie w pożywce ciekłej w temperaturze pokojowej	Bezpośrednie przeniesienie do pożywki ukorzeniającej.

Gatunek	eksplant	Sterylizacja powierzchniowa	Operacje początkowe	laboratorium
kokos	Zarodek izolowany z endospermy	Podchloryn wapna	Endosperma z zarodkiem wysiana do sterylnej pożywki 16,2 g/l KCl	Powtórna sterylizacja, zarodek wycięty i wprowadzony na pożywkę. Warunki standardowe
kakao	Wierzchołek wzrostu	Sterylizacja wodą pitną z dodatkiem sterylizatora (p-karbo-ksybenzenosulfono-dichloroamidu) 40 mg/l przegotowanej wody, dodatek fungicydu.	Wprowadzenie na półstałą pożywkę zawierającą fungicyd z lub bez antybiotyków (rifamycyna)	Standardowa kultura
Digitaria decumbens trawa	Fragmenty źdźbła	Sterylizacja jw.	Wprowadzenie na pożywkę zawierającą fungicyd i antybiotyk	Standardowa kultura, przeniesienie do gleby po 14 tyg.
bawełna	Fragmenty łodygi	20% wybielacz, w 30% etanolu na 45 s. Nie przemywa się	Kultura stała o połowie siły jonowej, 1% glukozy, antybiotyk – rifamycyna 15 mg/l, fungicyd Tilt MBC 1 mg/l hydrolizat kazeiny 0,5 g/l	Resterylizacja w 4% wybielaczu, hormonalne ukorzenienie i wyprowadzenie rośliny, przeniesienie do gleby

Warunki używane do tworzenia kolekcji in vitro różnych gatunków