Biotechnologia - wykład 1 ( 26.02.2003 r. )

Co do egzaminu :

1. 4 pytania na każde około 10 minut ( co 10 minut dyktuje następne pytanie ).

2. 2 pytania dotyczą materiału seminarium, a 2 dotyczą materiału wykładu.

3. Za każde pytanie można dostać od 0 do 5 punktów ( w sumie 20 ).

4. Za wszystkie obecności na seminariach +1 punkt, a za 3 nieobecności - 1 punkt.

5. Za referowanie tematu na seminarium można dostać od 0 do 5 punktów.

6. Na zaliczenie trzeba mieć minimum 10 punktów.

Polecane książki :

1. „Biotechnologia” pod redakcją Rem ( 12 tomów ) w czytelni

2. „Bakterie w biologii, biotechnologii i medycynie” P.Singleton

3. „Mikrobiologia techniczna” Lubisz, wydawnictwo Politechniki Łudzkiej

***

BIOTECHNOLOGIA jest to zintegrowanie nauk biologicznych ( przyrodniczych ) i inżynieryjnych w celu zastosowania mikroorganizmów w różnych gałęziach przemysłu, rolnictwa i medycyny. Zajmuje się różnymi sposobami technologicznego wykorzystania materiałów i procesów biologicznych BIOSYNTEZ i BIOTRANSFORMACJI (wykorzystanie biokatalizy). Biosyntezy prowadzą do otrzymania konkretnego produktu, a w biotransformacjach wykorzystuje się żywe komórki jako katalizatory.

Biotechnologiczne firmy wykorzystują systemy biologiczne do wytwarzania produktów.

Dwa rodzaje biotechnologii :

• biotechnologia tradycyjna

• biotechnologia nowoczesna

i coraz bardziej obserwujemy, że biotechnologia tradycyjne zaczynają wchodzić w metody charakterystyczne dla biotechnologii nowoczesnej.

BIOTECHNOLOGIE TRADYCYJNE opierają się na zastosowaniu biokatalizatorów naturalnych (szczepy dzikie), pochodzących ze środowiska i w żaden sposób nie zmodyfikowane, ewentualnie wyselekcjowane pod kątem jakiejś właściwości. Są to głównie mikroorganizmy naturalne.

BIOTECHNOLOGIE NOWOCZESNE to wszystkie technologie, które wykorzystują biokatalizatory, enzymy i komórki wytwarzające ( zawierają ) te enzymy i prowadzą procesy biosyntezy w ich wnętrzu. Komórki te są często zmodyfikowane metodami inżynierii genetycznej, biologii molekularnej w określonym kierunku, co pozwala znacznie ulepszyć właściwości biokatalizatorów.

Podstawowe kierunki działań biotechnologii

1. Przemysł fermentacyjny = wykorzystujący technologie, które wykorzystują fermentację w ujęciu biotechnologicznym. Biotechnologia historycznie najważniejsza i historycznie najstarsza. Całkowita biotechnologia, wykorzystuje metabolity wtórne i pierwotne produkowane przez mikroorganizmy.

Należą tutaj także technologie jak :

• Browarnictwo

• Produkcja antybiotyków i innych związków dla medycyny

• Produkcja białka paszowego i konsumpcyjnego

• Produkcja odczynników chemicznych i innych substancji biologicznych

FERMENTACJA W SENSIE BIOTECHNOLOGICZNYM to każdy proces wykorzystujący biomasę mikroorganizmów ( komórek ), którą hoduje się i obrabia w reaktorach o dużej pojemności. Czasem fermentacja w sensie biotechnologicznym może polegać na wykorzystaniu fermentacji w sensie biologicznym, czyli w takich procesach gdzie uzyskuje się produkt będący najczęściej metabolitem powszednim a powstającym na drodze beztlenowego metabolitu, który jest uzyskiwany przez fermentację.

2. Technologia enzymów kierunek biotechnologii, który wykorzystuje i produkuje na skalę przemysłową enzymy, przygotowując je w różnych formach, w takich jakie są one wykorzystywane później w procesach przemysłowych. Technologia ta ma zastosowanie w produkcji L - aa ( w formie optycznie czynnej ), półsyntetycznych antybiotyków (gdzie wykorzystuje się enzymy jako biokatalizatory ), w specyficznych procesach hydrolizy skrobi czy celulozy.

3. Technologia odpadów i śmieci (biodegradacja) oparta jest na procesach naturalnych w celu biologicznej utylizacji odpadów i ścieków np. jako surowców wtórnych, przemysłowych. Wynajdywanie takich metod biologicznych, które pozwoliłyby przetworzyć to co pochodzi z różnego rodzaju produkcji przemysłowych ( lub to co my wyrzucamy ) w coś co jest użyteczne np. biogaz otrzymywany z fermentacji śmieci lub przez innego rodzaju technologie.

4. Biologia środowiska naturalnego badania nad kontrolą skażenia środowiska ( BIOMONITORING = wykorzystanie żywych organizmów do monitorowania stanu środowiska ) oraz usuwanie zanieczyszczeń - związków toksycznych ze środowiska poprzez wykorzystanie metod biologicznych. Także BIOKOPALNICTWO specyficzna dziedzina wykorzystywania aktywności mikroorganizmów na skalę całego środowiska. Ta dziedzina to biotechnologia środowiska naturalnego.

5. Biotechnologia materiałowa i surowcowa zajmuje się wykorzystaniem materiałów pochodzenia roślinnego i zwierzęcego do produkcji dóbr niezbędnych człowiekowi. Najczęściej są to surowce wtórne np. celuloza wykorzystywane do produkcji energii lub odczynników chemicznych. Np. produkcja wodoru na drodze biologicznej poprzez utylizację odpadów roślinnych, metanu czy etanolu. Jest on potem wykorzystywany jako paliwo.

• Alkohol etylowy jako najstarszy z produktów uzyskiwany na drodze biotechnologicznej, ma dwustronne zastosowanie i w zależności jakie ma zastosowanie otrzymuje się go różnymi metodami.

1. Alkohol etylowy spożywczy - kierunki biotechnologii które nie tylko produkują alkohol w czystej postaci, ale także różnego rodzaju napoje alkoholowe

2. Alkohol etylowy przemysłowy - jako rozpuszczalnik, odczynnik chemiczny, substrat do różnych syntez.

3. Alkohol etylowy jako paliwo - alternatywa dla benzyny, produkowany innymi metodami, ale miej opłacalny niż uzyskiwanie energii przez przemysł naftowy z ropy naftowej.

Wszystkie te kierunki biotechnologii rozwijają się przede wszystkim dzięki działalności mikroorganizmów i dzięki umiejętnemu wykorzystywaniu ich aktywności.

„ jeśli odpowiednio potraktujesz swoich mikroprzyjaciół , wtedy oni zadbają o twoja przyszłość ”

***

• L. Pasteur - uważany za ojca mikrobiologii . Stwierdził, że mikroorganizmy są odpowiedzialne za procesy fermentacji ( głównie te, które psuły i jakość pewnych produktów np. wina) a także, że można zastosować ciepło dla zabicia tych niepożądanych mikroorganizmów. Twórca jednego z procesów umożliwiających zabicie mikrobów - pasteryzacja.

• R. Koch - zastosował po raz pierwszy podłoże stałe co umożliwiło izolację czystych kultur bakterii. Jako pierwszy zaczął interesować się mikrobami chorobotwórczymi.

• P.Elrich - zaczął prowadzić pierwsze systematyczne badania nad mikrobami, które wykorzystują coś co jest szkodliwe dla innych mikroorganizmów. Dał podwaliny badań związków o aktywności przeciwbakteryjnej ( selekcja specyficznych substancji).

• H.W.Beijerinck - wprowadził koncepcje kultur wzbogaconych i zajmował się rolą mikrobów w naturze.

• A.J.Klujrer - podstawy badań fizjologii mikrobów, stworzył koncepcję biochemii porównawczej.

• S.Winogrodzki - zajmował się geochemiczna rola mikrobów, dał fundamenty pod biokopalnictwo.

Mikroorganizmy przez wiele tysięcy lat dostarczały produktów człowiekowi np. chleb ( wypiekano przy zastosowaniu drożdży), piwo, wino. Podczas II wojny światowej produkowano na drodze biologicznej , wykorzystując naturalne produkty fermentacji : aceton, etanol, glicerol ( składniki do naboi). W tym samym czasie rozwinęła się produkcja kwasu cytrynowego, antybiotyków i witamin. W latach 70-tych, kiedy rozwinęła się biologia molekularna zaczęła ona wspierać metody tradycyjnej biotechnologii przemysłowej. Udało się wzbogacić metodami inżynierii genetycznej właściwości wykorzystywanych mikroorganizmów, w takim stopniu, że dzięki ich działalności udało się otrzymać 40 produktów fermentacyjnych. A w późniejszym okresie biotechnologii nowoczesnej, także produkty: erytropoetynę (sportowcy), ludzki hormon wzrostu i interferony. Biotechnologia w obecnych czasach jest głównym uczestnikiem globalnego przemysłu farmaceutycznego, spożywczego, chemicznego.

Mikroorganizmy - dlaczego tak często stosowane w biotechnologii?

1. Stosunkowo najprościej jest hodować je, ze względu na swoją budowę są oporne na traktowanie sztucznymi warunkami, w odróżnieniu od komórek roślinnych czy zwierzęcych.

2. Zróżnicowany i bogaty metabolizm. Są więc w stanie wytworzyć to co jest dla nas wartościowe ( nawet te naturalne mikroby).

4. Stosunkowo łatwo zwiększyć ilość metabolitów przez nich wytwarzanych. Poszukuje się szczepów zajmujących się nadprodukcją danej substancji ( np. szczepy po mutacjach lub po manipulacjach warunkami hodowli )

Biotechnologia tradycyjna głównie funkcjonująca do tej pory w dziedzinie przemysłu spożywczego ( biotechnologia żywności ) wykorzystuje z mikroorganizmów zarówno metabolity pierwszorzędowe (białka, kw. nukleinowe, witaminy) jak i wtórne.

BIOTECHNOLOGIA TRADYCYJNA

• Metabolity pierwszorzędowe ( pośrednie) to wszystko to, co powstaje podczas metabolizmu komórki i co powstaje zawsze. Wynika to z normalnych przemian metabolicznych, jakie w tej komórce się odbywają, związki, które powstają na drodze utleniania biologicznego lub w czasie realizacji różnych szlaków biosyntez, tego co komórce jest potrzebne. My również mamy metabolizm pośrednie.

• Metabolity wtórne u roślin - są to szlaki metaboliczne, bez których komórka może się obyć , ale jeżeli zachodzą , to dają one komórce ogromną przewagę selekcyjną , dlatego że metabolity wtórne to często substancje antybiotyczne ( czyli substancje pozwalające w środowisku usunąć konkurenta). Metabolitami takimi są alkaloidy, garbniki. Nie zawsze takie metabolity wtórne powstają , nawet jeżeli komórka ma zdolność do ich wytwarzania, ponieważ w warunkach laboratoryjnych zapewnia się optymalne warunki, a metabolity wtórne produkowane są jako odpowiedź na zmianę środowiska wtedy kiedy trzeba walczyć o przeżycie. Dlatego produkcja metabolitów wtórnych jest o wiele trudniejsza i wymaga odpowiednich procedur, które zmuszą mikroorganizm lub biokatalizator, żeby produkował to co nas interesuje.

Biotechnologia żywności :

1. Alkohole - alkohol etylowy jest produktem pośrednim fermentacji cukru albo polisacharydu, który trzeba zhydrolizować do takich cukrów, które staja się przedmiotem utleniania przez komórkę ( polisacharyd poddaje się depolimeryzacji , która spowoduje otrzymanie substratu dla organizmu).

• Alkohol etylowy spożywczy - przy jego produkcji wykorzystujemy drożdże , ich przyswajalność cukrów jest ograniczona do heksoz, a różnego rodzaju grzyby potrafią wykorzystywać pentozy lub laktozę ( disacharyd ). W zależności jaki alkohol produkujemy, spożywczy czy przemysłowy stosujemy do tego inne mikroorganizmy. Wszystkie alkohole, napoje alkoholowe są otrzymywane na drodze fermentacji czyli biotechnologicznej. Etanol przemysłowy = bioetanol ( np. jako rozpuszczalnik) otrzymuje się także na drodze fermentacji z wykorzystaniem nieczystych substratów lub na drodze chemicznej z etylenu ( petrochemia). Etanol jako paliwo powstaje z biomasy. Wykorzystanie go umożliwiłoby uniknięcie zanieczyszczenia środowiska powstałego z wykorzystania z benzyny, co za tym idzie efektu green house. Produkcja ta stanie się opłacalna, kiedy skończą się pokłady ropy naftowej.

• Niektóre beztlenowe mikroorganizmy, są w stanie fermentować celulozę. Celuloza to polimer glukozy, nie jest przyswajany dla dużej ilości mikroorganizmów. Ale dzięki tym które mogą utleniać celulozę świat nie jest pokryty szczątkami roślin i dzięki temu można myśleć o tym aby w sposób biotechnologiczny wykorzystać te zdolności do utlenienia celulozy i jej składników, z których jest ona zbudowana. Wykorzystuje się również metody rekombinacyjne - szczep E. coli po rekombinacji DNA wytwarza z 50% wydajnością etanol z celulozy.

2. Aminokwasy - otrzymywane metodami fermentacyjnymi to kw.glutaminowy ( w postaci glutaminianu sodu ), lizyna, tryptofan, fenyloalanina, treonina. Muszą być dostarczane z pokarmem.

• Aminokwasy są to metabolity pośrednie, czyli związki, które w komórce nie mają prawa nagromadzić się. Każda komórka jest zbudowana na zasadzie maksymalnej ekonomii ale ta zasada najlepiej realizuje się w świecie mikroorganizmów. Nie ma możliwości aby jakiś aa występował w komórce w takich ilościach, żeby można go było otrzymać a jakąś sensowną wydajnością. Stosuje się zatem zabiegi, które umożliwiają ominięcie kontroli produkcji aa ( działa mechanizm sprzężenia zwrotnego i działa mechanizm na poziomie operonów anabolicznych - gdzie nagromadzenie się jakiegoś produktu powoduje że zostaje wyłączony szlak metaboliczny ). Albo stosuje się mutanty auksotroficzne tzn. takie które nie są w stanie wytwarzać jakiegoś produktu, a skoro go nie wytwarzają to on się nie pojawi w komórce w takiej ilości, która mogłaby wyłączyć działanie operonu albo wyłączyć cały rozgałęziony szlak biosyntezy.

• PRODUKCJA KWASU GLUTAMINOWEGO - w tym przypadku spowodowano metodami genetycznymi, że błona komórkowa mikroorganizmu, który go produkuje staje się przepuszczalna dla kwasu glutaminowego i ten kwas z tych komórek ucieka. Zatem nie ma możliwości zablokowania biosyntezy przez nagromadzający się kwas glutaminowy, bo on się nigdy nie nagromadzi ( to co powstaje wycieka na zewnątrz)

• KWASY ORGANICZNE : kwas octowy, propionowy, bursztynowy, fumarowy i mlekowy

• POLIALKOHOLE : glicerol, mannitol, ksylitol, erytrytol.

• POLISACHARYDY : ksantan, gellan

• CUKRY : fruktoza, ryboza, sorboza.

• WITAMINY : ryboflawina ( .B₂), aneuryna ( B₁₂) . Ryboflawina produkowana jest przez pleśnie ( niższe grzyby) : Erenethecium ashbta, Ashbya gossypii. Witamina B₁₂ przez bakterie Pseudomonas denitryficans i Propionibacterium shermanii

• NUKLEOTYDY „ zapachowe” - metabolity pośrednie w syntezie kwasów nukleinowych, o specyficznych zapachach np. jako same nukleotydy wykorzystane jako prekursory witamin, głównie kwas 5'- guanylowy ( GMP) i kwas 5'-inozylowy ( IMP). Glutaminian sodu również ma specyficzny zapach ( zupki knorra) - ulepszacze żywności.

Do biotechnologii tradycyjnej należy także wykorzystanie mikroorganizmów jako całych komórek , które traktuje się jako swojego rodzaju katalizator ( biokatalizator) . Wykorzystuje się wtedy te mikroorganizmy w procesie BIOKONWERSJI - ma ona główne zastosowanie w przypadku produkcji sterydów ( dla przemysłu farmaceutycznego) . Do tej pory stosowane leki sterydowe otrzymuje się wykorzystując jeden albo dwa stopnie na których modyfikacje całego układu pierścieni sterydowych wykorzystują odpowiednie mikroorganizmy. Za pomocą odpowiednio dobranych komórek Można przeprowadzać każdy typ reakcji chemicznych a głównym atutem takiego wykorzystania mikroorganizmów jest to że reakcje które one katalizują przebiegają STEREOSPECYFICZNIE ( produkty optycznie aktywne) . Reakcje te zachodzą z dobrymi wydajnościami i w wysoce łagodnych warunkach, jeśli porównać z synteza chemiczna. Wymagane STEREOSELEKTYWNE, RADIOSELEKTYWNE reakcje syntezy sterydów - różne aktywności biologiczne stereoizomerów.

Metabolity wtórne - ułatwiają selekcję organizmów w środowisku.

1. Antybiotyki ( mogą to też być u mikroorganizmów : hormony płci, jonofory, czynniki kompetycyjne w stosunku do innych bakterii, czynniki symbiozy). Wykorzystywane w chemoterapii ludzi i zwierząt, do wspomagania wzrostu zwierząt hodowlanych czy w ochronie roślin. Związki o charakterze przeciwbakteryjnym wytwarzane przez same mikroorganizm, są wykorzystywane w środowisku, żeby pozbyć się konkurentów.

• Antybiotyki działają na przeróżne procesy metaboliczne w komórkach mikroorganizmów, bo działają na poziomie replikacji DNA, transkrypcji, translacji, mogą działać na odpowiednią podjednostkę rybosomów, cała aktywną strukturę rybosomów , wpływać na syntezę ściany komórkowej lub błony komórkowej.

• Replikacja DNA : aktynomycyna, bleomycyna, gis.... (?)

• Transkrypcja : rifamycyna

• Translacja 70S : chloramfenikol, tetracyklina, linkomycyna, erytromycyna, streptomycyna

• Translacja (transkrypcja-tak było na folii!) 80S : cykloheksimid

• Transkrypcje 70S i 80S: puromycyna,

• Synteza ściany komórkowej : cyklosecyna, penicyklina, penicylina, bacitiacyna

• Błona komórkowa - biosurfaktanty ( środki powierzchniowo czynne wytwarzane przez mikroorganizmy ) np. polimeksyna , amfoteryksyna - środek przeciwgrzybowy, amfoteryczne jonofory ( tworzą tunele wbudowując się w błonę ) powodują wyciekanie z komórki różnych substancji np. granicydyna lub ruchliwe nośniki jonoforowe w obrębie błony np. monensyna

.

2. Inne leki ale nie przeciwbakteryjne : są to leki o charakterze „ nie-antybiotyków”(choroby nieinfekcyjne, niebakteryjne). Choroby nieinfekcyjne to zakażenia robakami ( robaczyce) lub grzybice powierzchniowe np. kokcylizy powodowane przez bakterie Cokcylium.

Kokcidiostatyki: monensyna, lasalolid, salinomycyna (polietery).

• Kalioceptyki - wykorzystywane w niebakteryjnych chorobach związki otrzymywane na drodze chemicznej ( dawniej) , badania nad ich aktywnością były prowadzone w skrylingu, który musiał obejmować tysiące struktur. Po tych badaniach eliminowano struktury nieaktywne i metoda prób i błędów , modyfikując te struktury otrzymywano nowe, które trzeba było przebadać czy działają. Wiele z takich związków nie jest obojętnych dla naszych komórek.

• Udało się otrzymać leki o charakterze kokcidiostatyków - hamują wzrost grzyba Cocylium , związki o charakterze polieterów, tj. moneusyna, kasalocid, salinomycyna, avermektyny

• Avermektyny związki stosowane przeciwko płazińcom i stawonogom ( np. na tasiemce).

3. Toksyny = inhibitory lub enzymy

• STATYNY - produkty wytwarzane przez grzyby. U ludzi chorych na miażdżycę stosuje się LEVASTATIN ( mevinolium) i PRAVASTATIN obniżający poziom cholesterolu.

• KWAS KLAWULONOWY podaje się go przy leczeniu penicyliną, chroni on penicylinę będąc inhibitore penicylinazy - enzymu rozkładającego penicylinę.

• ACARBOSE (akarboza) - otrzymywane z grzybów, stanowią inhibitor jelitowej glukozydazy u osób otyłych i chorych na cukrzycę, obniża poziom hyperglikemii i obniża poziom syntezy trigicerydów.

4. Biopestycydy - związki działające przeciwko szkodnikom

• BIOFUNGICYDY /grzyby/ - kasugamycyna, polyoksymy

• BIOINSEKTYCYDY / owady / - nikkomycyny, spinosyny

• BIOHERBICYDY /chwasty/ - bialadmos

• ANTYHETMINTYNY / robaki/ - avermektyna

5. Zwierzęce i roślinne czynniki wzrostu - regulatory wzrostu roślin - gibereliny otrzymywane na drodze fermentacji

Z zagadnieniem otrzymania metabolitów pośrednich czy wtórnych na drodze fermentacji wiąże się dodatkowe zagadnienie - każda komórka zachowuje się inaczej w warunkach takich , jakie oferuje jej środowisko naturalne, a inaczej w warunkach hodowli. Najczęściej w hodowlach większość metabolitów wtórnych jest produkowana w czasie hodowli, która następuje po fazie wzrostu. W związku z tym w czasie takiej produkcji mamy fazę (odżywiania), która nazywa się PROTOFAZA. Jest to faza przyrostu masy, wtedy kiedy mikroorganizmy przyzwyczajają się do środowiska ( adaptacja) i przygotowują się do fazy zwanej IDIOFAZA - to faza w której następuje produkcja tego co nas interesuje- metabolitów wtórnych.

Istnieje możliwość manipulowania długością proto- lub idiofazy , żeby uczynić produkcję pożądanego związku bardziej opłacalna. Zwykle manipuluje się składnikami odżywczymi, w ten sposób Można uzyskać przedłużenie lub nałożenie każdej z tych faz. Najczęściej przedłuża się idiofazę żeby jak najdłużej mikroorganizmy produkowały związek , który chcemy otrzymać. Bardzo często komórki producenta są drażliwe na to co same produkują. Wtedy opóźnia się wystąpienie idiofazy dla otrzymania większej ilości komórek i w ten sposób zwiększenie wydajności ( przedłużenie profazy).

MANIPULACJA PODŁOŻEM

Każdy proces rozwojowy, w tedy kiedy rozpoczyna się produkcję jakiegoś związku metodą fermentacji obejmuje testowanie setek różnego rodzaju dodatków do podłoża, które mają służyć jakie czynniki organiczające bądź stymulujące. Wszystkie te poczynania zawierają się w dziedzinie zwanej UKIERUNKOWANĄ BIOSYNTEZĄ , ponieważ mają w różny sposób doprowadzić do tego, że metabolizm będzie przebiegał w takim kierunku jaki nas interesuje. Bada się przede wszystkim :

• Prekursory - zwykle wiadomo w jaki sposób przebiegają szlaki metaboliczne prowadzące do otrzymania danego produktu, dlatego łatwo Można zauważyć co można zastosować jako prekursor danego związku , żeby rozpocząć produkcję . W ten sposób odkryto, że dodatek kwasu fenylooctowego ukierunkowuje biosyntezę penicylinę w kierunku otrzymania benzylopenicyliny. Specyficzne aminokwasy dodawane do podłoża powodują że otrzymujemy odpowiednie aktynomycyny , czyli tyrocyny

• Induktory - powodują rozpoczęcie syntezy metabolitu wtórnego. W ten sposób odkryto, że poszczególne aminokwasy powodują iż poszczególne komórki mikroorganizmów zaczynają produkować np. : Met - cefalosporyna C ( antybiotyk β- laktamowy) , Val - tyrozyna , Try - alkaloidy ergotowe

• Mutageneza - próby otrzymania w ten sposób zmiany proporcji syntezowanych metabolitów, w kierunku zwiększenia produkcji tego co nas interesuje lub badania szlaku biosyntezy tych metabolitów (produkcja nowych metabolitów, nowymi szlakami). Mutageneza ( w ujęciu tradycyjnym powoduje, że otrzymuje się szereg mutantów. Potem izoluje się je ( te które nas interesują pod względem wytwarzania przez nie żądanego metabolitu) i bada, co w takim mutancie jest defektywne - co można wydedukować i co dodać by zwiększyć syntezę . Można opisać dany szlak biosyntezy.

BIOTECHNOLOGIA NOWOCZESNA ( 25 lat )

Odbywa się na mniejszą skalę , przygotowuje materiał do produkcji przemysłowej. Wykorzystuje technologię : technologia rekombinowanego DNA i umożliwia w ten sposób otrzymanie rekombinowanych białek. Np. wykorzystuje się E.coli, B.subtilis. Są także wykorzystywane (rekombinowane) grzyby niższe i drożdżaki S.cerenisae, Pilcha postoris, Asparagillus niger, Hansemula polymaspho. Produkty inżynierii genetycznej - biotechnologii nowoczesnej zaaprobowane do użycia w USA :

• ludzka insulina i hormon wzrostu,

• erytropoetyna,

• epidermalny czynnik wzrostu,

• interleukina-2,

• interferon α- β- γ-,

• somatotropina wołowa

- są to związki otrzymane metodą fermentavcyjną, wykorzystujące biomasę zredukowanych komórek bakteryjnych .

Jedną z dziedzin wykorzystujących technologię rekombinowanego DNA jest produkcja immunoszczepionek ( szczepionek nowej generacji). Pierwszą w tej dziedzinie była szczepionka przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B ( wzw B ) , która była skonstruowana w ten sposób, że na powierzchni drożdży ekspresjonowano antygen powierzchniowy wirusa. Niwelują problem rewersji. W szczepionkach tradycyjnych wykorzystuje się atenuowane mikroorganizmy (osłabione ) albo zabite wirusy i stosowanie takiej szczepionki niesie za sobą problemy np. mikroorganizm atenuowany (osłabiony) bardzo często na drodze specyficznej REWERSJI staje się zjadliwy, taki jaki był na początku , i osoba szczepiona zamiast się uodpornić choruje. Stosowanie wirusów także nie jest bezpieczne nawet jeśli są one zabite. W przypadku immunoszczepionek nie ma rewersji , i nie ma problemu zakażenia . Szczepionka jest w pełni bezpieczna

Jako produkty biotechnologii nowoczesnej stosuje się również enzymy przemysłowe. ENZYMY PRZEMYSŁOWE to enzymy , które normalnie w zakładzie produkującym jakiś związek chemiczny są wykorzystywana jako katalizator. Głównie mają zastosowanie enzymy HYDROLITYCZNE ( proteazy, lipazy ) rekombinowane lipazy stosowane są jako dodatki do detergentów , a rekombinowana chymozyna wykorzystywana do produkcji serów twardych. Chymozyna ( renina, podpuszczka ) jest otrzymywana jako wyciąg solny z żołądków cieląt . Znalezienie źródła tego enzymu w postaci rekombinowanych bakterii znacznie obniża ilość zwierząt, które należałoby ubić. Rekombinowane enzymy znajdują także zastosowanie dla celów terapeutycznych, w leczeniu chorób układu pokarmowego , tam gdzie trzeba uzupełniać niedobór enzymu np. jeżeli ktoś ma chorą trzustkę ( lub jej nie ma ), w chorobach metabolicznych , rak , zatory, krzepnice. Enzymy rekombinowane tzn. enzymy otrzymane z rekombinowanych mikroorganizmów , są to aktywator plazminogenu, ludzka DNA-aza, crozyme ( cerozajn ) .

Bioinsektycydy:

• Agcobacterium tumefaciens

• Bacillus thuringiensis

• Bakulowirusy

Zastosowanie nowoczesnej biotechnologii w rolnictwie - wykorzystuje się rekombinacje dla wytworzenia specyficznych biopestycydów. CIEKAWOSTKA : wykorzystanie bakterii Agcobacterium tumefaciens (wektor Ti), która atakuje wybiórczo rośliny motylkowe i powoduje u nich powstanie narośli - tumorów. Wprowadza do zainfekowanych komórek swoistego rodzaju plazmid. Część tego plazmidu ( wektor Ti ) został wykorzystany w rekombinacji komórek roślinnych , ponieważ jest to naturalny plazmid ( wektor) , który ma powinowactwo do roślinnego materiału genetycznego- związku z tym wykorzystuje się go do rekombinacji roślin.

Wykorzystanie tego, co produkuje bakteria Bacillus thuringiensis - mikroorganizm , który atakuje owady . Ta bakteria , kiedy przechodzi w okres sporolacji , kiedy zaczyna wytwarzać endospory, produkuje specyficzne białko krystaliczne. To białko, jeżeli dostanie się do światła jelita owadziego powoduje jego destrukcję - rozpuszczenie się ściany jelita, wtedy zawartość wylewa się do jamy ciała i owad umiera. To białko jest ponad 300 x bardziej aktywne niż naturalne związki produkowane przez chryzantemy , które są insercytydami - pyretrioidy, ? a 80000 x bardziej efektywne insektycytydy fosforoorganiczne , które sa generalnie toksyczne również dla nas ( blokują acetylopoliesterazę ) . na tej zasadzie tworzy się transgeniczne rośliny, które mają możliwości wytwarzania takiego białka krystalicznego, mogą zatem chronić się przed owadami , które są szkodnikami.

Do wykorzystania jako boinsektycydy stosuje się wirusy owadzie - BAKULOWIRUSY - specyficzne wirusy modyfikowane tak , aby wytwarzały toksyny ukierunkowane w stosunku do określonych owadów . O ile te metody nazywane ukierunkowaną biosyntezą , zawierają się w obrębie tradycyjnych biotechnologii o tyle biotechnologia nowoczesna dysponuje BIOSYNTEZĄ KOMBINATORYJNĄ . Ponieważ jest to metoda nowoczesna , dlatego wykorzystuje ona procesy rekombinacji DNA. Większość szlaków biosyntez przebiega w komórkach bakteryjnych jako kodowane przez układy klasterowe. U bakterii są operony i biosynteza enzymów niezbędnych do przeprowadzenia określonego szlaku metabolicznego , do otrzymania określonego produktu, do rozkłady odpowiedniego substratu, unieruchomienie określonych genów jest pod wspólną kontrolą . Czasem też jest tak u grzybów niższych np.: Penicilium - grzyb produkujący penicylinę .

Technika rekombinowanego DNA w obrębie biosyntezy kombinatoryjnej polega na tym ,że sprawdza się układ klasteronowy i wprowadza się dodatkowy gen , powoduje się ,że komórka która produkuje określony związek produkuje dodatkowo jeszcze inny związek albo komórka która nie jest komórką producenta nabywa zdolności produkowania związku o aktywności biologicznej. Pochodzenie mikroorganizmów stosowanych w biotechnologii :

• środowisko naturalne ( istnieją metody poszukiwania )

• kolekcja szczepów

Znajdowanie mikroorganizmów w środowisku naturalnym - procedura obejmuje kilka etapów :

1. należy wybrać miejsce , w którym chcemy znaleźć określone mikroorganizmy

2. pobrać próbki i poddać je wstępnej obróbce

3. zwiększenie liczebności mikroorganizmów, które nas interesują . Można tego dokonać TECHNIKĄ NATURALNEGO WZBOGACANIA (wzbogacamy mikroorganizmy a nie podłoże!) - polega to na poszukiwaniu właściwego środowiska. Jeżeli poszukuje się określonego mikroorganizmu i będzie on miał właściwość wytwarzania w drastycznych warunkach , to szuka się go właśnie w takich drastycznych warunkach. Np.: bakterie Ekstermofilne - należą do oddzielnego królestwa mikroorganizmów , Archebakterii , dlatego, że ekstremalne środowiska to są środowiska, w których temperatura jest > 100⁰C (lub < 0⁰ C) , albo są to środowiska wysoce zasadowe lub bardzo kwaśne . Enzymy z takich mikroorganizmów (bo to od zawartości tych komórek zależy wytrzymałość na dane warunki środowiska) mają zastosowania w tej chwili np. bakterie hyperthermophilne ich enzymy mają zastosowanie w technologii PCR , która wymaga wysokich temperatur (pow. 110⁰ C). Enzymy z bakterii żyjących w niskich temperaturach ( poniżej 00C biorą udział w oczyszczaniu ścieków - psychophiles . Enzymy pochodzące acidofili i alkalofili służą jako dodatki do detergentów (proszki do prania) np. spieranie jeansów .

Techniki naturalnego wzbogacania obejmują również różnego rodzaju oddziaływania na środowisko . Wtedy trzeba wiedzieć jakie grupy mikroorganizmów poszukujemy. Np. Można wprowadzić herbicyd - atenazynę do środowiska i wtedy na pożywce rozmnażają się promieniowce , bo są mniej wrażliwe niż inne bakterie . Można próbkę poddać obróbce fizycznej lub mechanicznej , jeżeli poddaje się je działaniu 100 ⁰C, wtedy przeżywają bakterie zdolne do przetrwalnikowania . Przetrwalnikowanie bakterii w niskich temperaturach przez kilka tygodni powoduje, że namnażają się innego rodzaju drobnoustroje - grzyby i promieniowce, a bakterie właściwe nie namnażają się . Można zmieszać próbkę z kredą , wtedy grzyby, które są kwasolubne, w środowisku alkalicznym nie wyrosną , a wyrosną promieniowce.

Biotechnologia - wykład 1 ( 26.02.2003 r. )

10

---