BIOTECHNOLOGIA wyklady


BIOTECHNOLOGIA

Różne kolory biotechnologii i ich rola.

Podziały tradycyjne:

NOWOCZESNA BIOTECHNOLOGIA

To zastosowanie metod i technik:

  1. Inżynierii genetycznej

  2. Kultur „in vitro”

  3. Technik bioreaktorowych

Inżynieria genetyczna

Kultury „in vitro”

Techniki bioreaktorowe

DROGA DO ORGANIZMU O NOWYCH WŁAŚCIWOŚCIACH:

Gatunki introdukowane mogą zachowywać się w sposób nieprzewidywalny, np. opuncja w Australii.

Na ile jest to zagrożenie poważne, odpowiedź daje reguła 10-10-10 odnosząca się do wszystkich organizmów. W wypadku roślin można ją sformułować następująco:

- Spośród gatunków celowo sprowadzonych lub zawleczonych 10% jest w stanie żyć w nowym środowisku bez szczególnej opieki, około 10% z nich tworzy stabilne duże populacje - nazywamy je naturalizowanymi i wreszcie 10% spośród gatunków naturalizowanych w sposób znaczący modyfikuje naturalne systemy niekiedy z poważnymi konsekwencjami gospodarczymi - ostatnią grupę możemy nazwać chwastami.

Pod pojęciem odmiana miejscowa rozumie się populacje lokalnie rozmnażane i uprawiane, ale nie figurujące w urzędowych rejestrach i tym samym nie mające oficjalnej nazwy.

Obecnie w rolnictwie krajów o wyższym poziomie, odmiany miejscowe mają jedynie niewielkie, lokalne znaczenie (np. niektóre odmiany owsa uprawiane na Podhalu oraz soczewica i drobnonasienny groch na Lubelszczyźnie).

Odmiany lokalne stanowią przykład odmian ekstensywnych, w odróżnieniu od odmian intensywnych, uzyskanych w wyniku długotrwałej hodowli prowadzonej w warunkach zaawansowanej technologii produkcji rolniczej i dających wysokie plony jedynie w korzystnych warunkach agroekologicznych.

Prymitywne odmiany miejscowe, podobnie jak gatunki dzikie, stanowią zatem cenne źródło cech odpornościowych, utraconych w procesie intensywnej hodowli ukierunkowanej przede wszystkim na podwyższenie plonu i cech jakościowych. Zjawisko to nosi nazwę erozji genów.

Bank Nasion, zbudowany niedaleko wioski Longyearbyen na wyspie Spitsbergen, 1000 km od Bieguna Płn został otwarty 26.02.2008r.

Zwiększanie różnorodności biologicznej pokarmu

Dominuje 6 gatunków (pszenica, ryż, kukurydza, jęczmień, soja i maniok), dostarczających łącznie 90% żywności pochodzenia roślinnego.

Może to stanowić obok skażenia środowiska i społecznych czynników stresogennych przyczynę wielu chorób cywilizacyjnych, które pojawiły się lub nasiliły w XX i XXI wieku.

SELEKCJA - wybór z populacji pewnej jej części charakteryzującej się pewnymi właściwościami.

Wyróżniamy dwa podstawowe typy selekcji:

W przypadku pozytywnej wybiera się formy (rośliny, linie) wykazujące cechy pożądane (a więc zgodne z zamierzonym celem) i tylko te przeznacza się do reprodukcji, a wszystkie pozostałe odrzuca się (ewentualnie przeznacza na cele paszowe lub konsumpcyjne).

Przykładem pośredniej selekcji jest wykorzystanie korelacji pomiędzy cechami siewek i młodych drzewek a produktywnością dojrzałych jabłoni w sadzie. Wysoki wigor w stadium młodocianym umożliwia wczesną selekcję bez oczekiwania aż drzewo wejdzie w stadium owocowania.

RÓWNOCZESNA REAKCJA NA KILKA CECH

Często trzeba prowadzić równocześnie selekcję na większą liczbę cech,. Nie stanowi to przeszkody w uzyskiwaniu pozytywnych wyników, jeżeli są to cechy genetycznie niezależne. Bardzo często występuje jednak współzależność czyli korelacja cech.

Jeżeli korelacja między cechami jest pozytywna (dodatnia), to ułatwia pracę, natomiast jeżeli jest ona negatywna to znacznie je utrudnia lub wręcz uniemożliwia.

Na przykład przy ujemnej korelacji pomiędzy plennością a wczesnością roślin konieczny jest kompromis w stosunku do wymagań.

GRANICE SELEKCJI

Selekcja prowadzi do ukierunkowanych zmian frekwencji pożądanych alleli. Ze wzrostem skuteczności selekcji następuje genetyczne wyrównanie populacji. Przy ciągłej selekcji określonym kierunku może zostac osiągnięta granica, poza którą dalsza selekcja pozostaje bezskuteczna. Wytworzona populacja będzie korzystnie odróżniać się od wyjściowej pod względem cechy będącej przedmiotem selekcji, ale zmienność w jej obrębie będzie bardzo mała.

Dlatego dalsza selekcja może okazać się nieskuteczna.

Należy podkreślić fakt, że:

KRZYŻOWANIE

Krzyżowanie różnych form w obrębie gatunku, a niekiedy także pomiędzy gatunkami i rodzajami, stanowi najbardziej skuteczną metodę znacznego rozszerzenia zakresu zmienności genetycznej materiału. Dzięki rozszczepianiu się cech rodzicielskich można wśród mieszańcowego potomstwa wyselekcjonować pożadane rekombinanty.

Krzyżowanie jest więc najczęściej stosowanym zabiegiem. O jego skuteczności decyduje dobór, takich komponentów rodzicielskich, w potomstwie których można spodziewać się wystąpienia kombinacji zgodnych z zamierzeniami.

Krzyżowanie wewnątrzgatunkowe udaje się z reguły łatwiej, niż krzyżowanie między roślinami należącymi do różnych gatunków lub rodzajów (tj. krzyżowanie oddalone).

Krzyżowanie międzygatunkowe i międzyrodzajowe udaje się z reguły rzadziej niż wewnątrzgatunkowe i dlatego trzeba kastrację i zapylanie przeprowadzać na liczniejszym materiale. Znane są jednak pewne grupy systematyczne, w obrębie których takie krzyżowanie jest stosunkowo łatwe, podczas gdy w innych nie udało się jak dotąd otrzymać mieszańców międzygatunkowych.

Schemat powstania śliwomoreli i jej mieszańców

Śliwy japońskie (Prunus Salicina) x Morele Prunus armeniaca) -> Śliwomorele (Plumcot)

x Śliwy japońskie lub amerykańskie -> Pluot (Śliwomorele)

x Morele -> Atrium (Morelośliwy)

Układ pojedynczy

Dla 10 odmian można utworzyć 5 kombinacji:

Senga Sengana x Polka

Calypso x Salut

Midway x Elat

Jota x Felina

Pastel x Elsanta

Ze względu na bariery należy:

Przyczyny utrudniające krzyżowanie oddalone możemy podzielić na:

Wynikające z:

Zatem wyizolowanie zarodka i przeniesienie go do nowych stymulujących rozwój warunków daje szanse na przejście przez dalsze stadia rozwojowe i otrzymanie rośliny.

Należy przy tym uwzględnić:

  1. Stadium rozwojowe zarodka - wiek - (kuliste, sercowate, torpedo), izolować przed wystąpieniem oznak zamierania lub procesów obniżających ich żywotność

  2. Skład pożywek dostosować do:

    1. wymagań gatunków rodzicielskich

    2. wieku i kondycji zarodków

    3. uzupełnić dodatkami organicznymi (mleczko kokosowe, ekstrakty), uwzględnić ciśnienie osmotyczne.

Stosuje się dwie drogi postępowania z zarodkami mieszańcowymi:

  1. Zabiegi prowadzące do dalszego normalnego rozwoju i powstania rośliny (jeden zarodek -> jedna roślina)

  2. Postępowanie prowadzące do regeneracji roślin przez fazę kalusa lub bez niej (jeden zarodek -> wiele roślin).

Przykład: uzyskiwanie zarodów mieszańcowych z krzyżowania dyni zwyczajnej z dynią olbrzymią.

  1. Izolacja zarodków 25-30 dniowych.

  2. Wykładanie na pożywkę MS z dodatkiem etaminy

  3. Regeneracja roślin

  4. Efektywnośc kultury 1-50% wynikająca z:

Jednym z głównych celów biotechnologii roślin jest uzyskanie nowych genotypów roślin, przewyższających swoimi cechami genotypy dotychczas uprawiane.

To ulepszenie uzyskujemy od dawna, posługując się znanymi tradycyjnymi metodami hodowlanymi tj. selekcja, krzyżowanie, rekombinacje, mutacje.

W przypadku tradycyjnych metod hodowlanych wyszukane formy o korzystnych właściwościach, ocenia się i selekcjonuje w warunkach polowych, szklarniowych.

Uzyskanie nowej odmiany roślin o określonych cechach w takich warunkach z zastosowaniem tradycyjnych metod uwarunkowane jest:

KULTURY IN VITRO - to specyficzny sposób uprawy w pojemnikach (np. szklanych) w sterylnych warunkach przy kontrolowanej temperaturze, oświetleniu i wilgotności, na pożywce stałej lub płynnej.

Za pomocą kultur in vitro możliwe stało się opracowanie następujących metod pozyskiwania roślin o nowych cechach:

SELEKCJA - jedna z najstarszych i najprostszych metod hodowlanych, która polega na identyfikacji i wyłonieniu z danej populacji roślin samo lub obcopylnych pożądanych osobników tzw. pojedynków czy biotypów charakteryzujących się określonymi, poszukiwanych przez człowieka cechami.

Selekcja jest rodzajem filtru, który ocenia i klasyfikuje rośliny zgodnie z wymaganiami hodowcy.

SELEKCJA W KULTURACH IN VITRO:

Polega na identyfikacji i wyłonieniu określonych wartości, co do których spodziewamy się, że mogą być reprezentowane w materiale roślinnym i które chcemy uzyskać.

Zalety:

Wady:

Zadania selekcji:

Selekcja in vitro ma na celu uzyskanie roślin o nowych cechach, czyli poszerzenie istniejącej w naturze różnorodności biologicznej.

Duże znaczenie praktyczne selekcji in vitro polega na stosunkowo szybszej i prostszej niż transformacje metodzie uzyskiwania nowych genotypów roślin.

  1. Zidentyfikowana i wyłoniona cecha występuje tylko w kulturach komórek lub tkanek (kalus, kultura zawiesinowa)

  1. określona cecha przejawia się także w zregenerowanych roślinach, już po przeniesieniu ich do uprawy polowej, aby była to cecha dziedziczna, tzn. przekazywana w sposób reproduktywny na następne pokolenia.

Znaczenie selekcji:

Zatem wykorzystanie selekcji obejmuje:

RODZAJE ZMIENNOŚCI - prowadzony w kulturach in vitro materiał roślinny może być stabilny genetycznie, w efekcie kolejne pokolenia powstające w wyniku rozmnażania klonalnego są identyczne pod każdym względem z osobnikiem macierzystym

Stosunkowo często obserwuje się występowanie zmian, w pokoleniach potomnych pojawiają się inne cechy niż w organizmie wyjściowym. Zmiany pojawiające się w materiale roślinnym prowadzonym w warunkach in vitro mogą mieć podłoże genetyczne (dziedziczne), oraz epigenetyczne (pozagenetyczne) i niedziedziczne.

Jeżeli zmiany dotyczą komórek generatywnych, to wśród powstałych z nich roślin obserwuje się zmienność gametoklonalną.

Natomiast jeżeli zmiany dotyczą komórek somatycznych, to zmienność wśród zregenerowanych roślin określa się jako zmienność somaklonalną.

Stosunkowo często obserwuje się występowanie zmian, w pokoleniach potomnych pojawiają się inne cechy niż w organizmie wyjściowym. Zmiany pojawiające się w organizmie roślinnym prowadzonym w warunkach in vitro mogą mieć podłoże genetyczne (dziedziczne) lub epigenetyczne (pozagenetyczne) i niedziedziczne.

Jeżeli zmiany dotyczą komórek generatywnych, to wśród powstałych z nich roślin obserwuje się zmienność gametoklonalną.

Natomiast jeżeli zmiany dotyczą komórek somatycznych, to zmienność wśród zregenerowanych roślin określa się jako zmienność somaklonalną.

ZMIENNOŚĆ GAMETAKLONALNA - bada się w kulturach in vitro izolowanych mikrospor (ewentualnie pylników) lub ziaren pyłku. Z mikrospor powstają zregenerowane rośliny haploidalne odznaczające się daną cechą, natomiast wyselekcjonowane ziarna pyłku służą do zapylania.

ZMIENNOŚĆ SOMAKLONALNA - obiektem selekcji są głównie zawiesiny komórek, kalus, zarodki somatyczne lub fragmenty organów. Rzadziej stosuje się zarodki zygotyczne czy uzyskane z nich siewki.

Podstawą selekcji w kulturach in vitro jest zmiennośc somaklonalna.

Zmienność somaklonalna jest klasyfikowana jako suma różnych zjawisk genetycznych, takich jak mutacje genomu jądrowego i plazmatycznego powstające pod wpływem warunków kultury, oraz zmiany będące skutkiem stresu, takie jak zwiększenie amplifikacji genów, uaktywnienie transpozonów, zmiany metyzacji DNA i stresowe zmiany metaboliczne w merystemach szlaku płciowego.

Podział zmienności somaklonalnej:

Zmienność somaklonalna powstająca w kulturach spontanicznie może być kontrolowana tylko w ograniczony sposób. Zmienność ta może być wynikiem genetycznego zróżnicowania tkanek, z których składał się eksplantat pierwotny.

Eksplantaty mogą zawierać tkanki o różnej poliploidalności i zmutowane komórki somatyczne, które poza kulturą nie miałyby możliwości przekazania zmienionych cech drogą generatywną. Oprócz zmienności wniesionej z eksplantatem, na powstanie zmienności somaklonalnej wpływa istotnie sposób regeneracji roślin oraz niektóre czynniki kultury.

Indukowanie zmienności somaklonalnej

SKUTKI DZIAŁANIA MUTAGENÓW NA KOMÓRKI ROŚLINNE:

ABY WYELIMINOWAĆ NIEPOŻĄDANE MUTACJE JUŻ W TRAKCIE TRWANIA KULTURY NALEŻY PROWADZIĆ SELEKCJĘ

ZASADY PROWADZENIA SELEKCJI

Selekcję prowadzi się w obecności czynnika selekcyjnego, tzn. dodaje się go do pożywki, na której znajduje się materiał roślinny.

Czynnikiem selekcyjnym w zależności od poszukiwanej cechy mogą być elicytory (sygnalizujące roślinie konieczność wytwarzania substancji obronnych), wyciągi i koncentraty z mikroorganizmów, filtraty pokulturowe, związki chemiczne oraz czynniki fizyczne.

PRZYKŁADY CZYNNIKÓW SELEKCYJNYCH W ODNIESIENIU DO OKREŚLONEJ CECHY

Czynnik selekcyjny

Cecha

Substancje chemiczne:

  • Streptomycyna

  • Herbicydy

  • Jony metali

  • NaCl

Wyciągi i koncentraty z kultur mikroorganizmów patogennych (np. Fusarium oxysporum)

Inaktywowane elisytory bakterii Erwinia carotovora

Czynniki fizyczne:

  • Obniżona temperatura

  • Wysokie ciśnienie osmotyczne pożywki

Odporność na:

  • Antybiotyk

  • Środki ochrony roślin

  • Metale ciężkie

  • Zasolenie

Odporność na Fusarium oxysporum

Odporność na daną bakterię

Mrozoodporność

Tolerancja na suszę

O skuteczności selekcji decydują:

Parametry selekcji każdorazowo należy ustalać doświadczalnie dobierając najbardziej korzystne warianty.

Najprostszą metodą selekcji in vitro jest metoda bezpośrednia. Umieszcza się analizowane obiekty na dwóch pożywkach różniących się brakiem (kontrola) lub obecnością czynnika selekcyjnego. Te obiekty, które przeżyją w obecności czynnika selekcyjnego, prawdopodobnie mają poszukiwaną cechę. Selekcję należy powtarzać kilkakrotnie.

Wyselekcjonowane linie pasażujące się na pożywkę bez czynnika selekcyjnego. Po kilku subkulturach na „czystych” pożywkach obiekty ponownie przenosi się na pożywki selekcyjne celem sprawdzenia, czy zmiany są trwałe.

Jeśli tak, należy dążyć do regeneracji i testować całe rośliny pod względem poszukiwanej cechy oraz sposobu jej przekazywania (dziedzina czy nie).

CHARAKTERYSTYKA WYBRANYCH TYPÓW KULTUR

KULTURY KALUSA

Tempo formowania się KALUSA zależy m.in. od BUDOWY EKSPLANTATU

Powstające w kulturach in vitro kalusy różnią się:

Różnice te wynikają m.in. z pochodzenia i rodzaju eksplantatu, wieku kalusa, składu chemicznego pożywki oraz warunków prowadzenia kultury.

HABITUACJA (alergizacja)

WYKORZYSTANIE KALUSA:

KULTURY ZAWIESIN KOMÓREK

Zawiesina komórek to populacja pojedynczych komórek lub niewielkich agregatów komórkowych intensywnie rosnąca w rytmicznie wytrząsanej pożywce płynnej, charakteryzująca się powtarzalnymi parametrami wzrostu.

Do inicjacji kultur zawiesinowych wykorzystuje się:

Kultury zawiesinowe prowadzi się zwykle w kolbach stożkowych umieszczonych na wytrząsarce rotacyjnej zarówno w ciemności, jak i na świetle o niezbyt dużym natężeniu.

ETAPY KULTURY ZAWIESINOWEJ:

Wzrost liczby komórek - parametr pozwalający ocenić zachowanie komórek w zawiesinie. Tempo wzrostu liczby komórek w ciągu całego cyklu, od pasażu do pasażu, zmienia się w charakterystyczny sposób, tworząc krzywą wzrostu. Standardowa krzywa wzrostu ma kształt sinusoidalny i można w niej wyznaczyć 5 faz:

  1. spoczynkowa

  2. wykładnicza

  3. wzrostu liniowego

  4. obniżonego wzrostu

  5. stacjonarna

KULTURY ZAWIESIN KOMÓREK SĄ DOBRYM OBIEKTEM ROZMAITYCH BADAŃ:

W PRAKTYCE WYKORZYSTYWANE SĄ M.IN. DO:

KULTURY PROTOPLASTÓW

IZOLOWANIE PROTOPLASTÓW

Założenie kultury wyizolowanych protoplastów.

Czystą frakcję protoplastów zawiesza się w pożywce agarozowej lub w postaci cienkiej warstwy zawiesiny umieszcza się na powierzchni pożywki agarowej.

Protoplasty odtworzą ściany komórkowe i w wyniku podziałów powstaną mikrokalusy, dalszy etap jest uzależniony od założonego celu (proliferacja kalusa, morfogeneza przybyszowa, regeneracja roślin).

WSZYSTKIE ETAPY PRACY WYMAGAJĄ ZACHOWANIA MAKSYMALNEJ STERYLNOŚCI, DOKŁADNOŚCI I DELIKATNOŚCI - zapewnienie żywotności protoplastów.

CELE PROWADZENIA KULTUR PROTOPLASTÓW:

ROŚLINY TRANSGENICZNE

Organizmy genetycznie zmodyfikowane - są to organizmy, do których wprowadzono nowy gen (tzw. transgen) przy użyciu technik inżynierii genetycznej, w celu uzyskania roślin lub zwierząt o zupełnie nowych właściwościach.

Zakres manipulacji genetycznych:

Transformacja roślin

METODY TRANSFORMACJI

  1. Wektorowe (pośrednie) - polegają na wykorzystaniu bakterii z plazmidem zawierającym transgen;

  2. Bezwektorowe (bezpośrednie) - gen wprowadza się do komórek biorcy bez pośrednictwa bakterii.

Metoda wektorowa (z użyciem A.Tumefaciens)

Transformacja z użyciem A.Tumefaciens jest procesem zależnym od:

Jego istotą jest przekazanie przez bakterie komórkom roślinnym fragmentu zwanego T-DNA stanowiącego część plazmidu Ti (tumor induction).

Metody otrzymywania transgenicznych roślin

  1. Metody wektorowe

Wykorzystanie plazmidu Ti z bakterii A.tumefaciens (wywołującej guzowatośc korzeni roślin) posiadającego naturalną zdolność wbudowywania swojego DNA do genomu roślin, w celu wprowadzenia transgenów (proces ten nazywany jest TRANSFEKCJĄ). DNA wielkości 200kpz (kilo par zasad), replikująca się niezależnie od chromosomu bakteryjnego.

A.rhizogenes - plazmid Ri. Wywołuje powstawanie dużej liczby korzeni włośnikowych.

We fragmencie T znajdują się:

Geny fragmentu T są zaopatrzone w sekwencje rozpoznawane przez czynniki transkrypcyjne rośliny takie jak: TATA - będące sygnałem rozpoczęcia transkrypcji czy AATAAA stanowiące sygnał do terminacji i poliadenylacji.

Fragment T jest z obu stron otoczony sekwencjami granicznymi, składającymi się z prostych powtórzeń nukleotydów które biorą udział w procesie integracji fragmentu T z genomem biorcy. Każda z sekwencji granicznych ma długość 25 par zasad.

W rejonie wirulencji długości 30-40 kpz znajdują się geny wirulencji vir.

24 geny vir są ułożone w 8 operonach:

VirA - 1 gen

VirB - 11 genów

VirC - 2 geny

VirD - 4 geny

VirE - 2 geny

VirF - 1 gen

VirG - 1 gen

VirH - 2 geny

Rolą genów virA i virG jest aktywacja pozostałych genów vir.

Geny virB kodują białka błonowe przez które przedostaje się odcinek T.

Produkty genów virC i virE biorą udział w ochronie i transporcie odcinka T.

Geny virD są odpowiedzialne za wycięcie odcinka T.

Geny virF i virH są związane z podtrzymywaniem procesu rakowacenia m.in. kodują białka pełniące rolę detoksyfikatorów związków roślinnych utrudniających rozwój tumorów.

W procesie transformacji są też zaangażowane geny chvA, chyb i chvE leżące na chromosomie bakteryjnym. Białka kodowane przez dwa pierwsze geny są odpowiedzialne za połączenie bakterii z komórką, a trzeci bierze udział w aktywacji genów vir.

Dla bakterii sygnałem do infekcji są związki fenolowe lub/i cukry uwalniane ze zranionej tkanki roślin. Np. acetosyringon występujący u roślin z rodziny Solanaceae, alkohol koniferylowy, pochodne kwasu benzoesowego, cynamonowego.

Cząsteczki te wiążą się z receptorami błonowymi bakterii. W skłąd receptorów wchodzą produkty genów virA i chvE tworząc kompleks aktywujący gen virG.

Białko virG wiąże się ze specyficznymi miejscami promotorów pozostałych genów rejonu vir, stymulując ich transkrypcję.

Dwa geny operonu virD: virD1 i virD2 odpowiedzialne za wycięcie fragmentu T, kodują białka VirD1 i VirD2 o aktywności endonukleazy.

Wycięcie rozpoczyna się w specyficznym miejscu prawej sekwencji granicznej, a następnie lewej.

Do końca 5 wyciętego jednoniciowego fragmentu T wiąże się kowalencyjnie białko VIrD2 chroniąc go w ten sposób przed egzonukleazami.

Następnie białko VIrE2 łączy się z jednoniciowym fragmentem T i chroni go tworząc kompleks nukleoproteidowy.

W tej formie fragment T jest transportowany do komórek roślinnych. Oba białka tworzące kompleks z fragmentem T biorą udział w jego integracji genomem roślinnym.

W procedurach wykorzystujących Agrobacterium najczęściej wykorzystuje się kulturę in vitro biorcy, wybierając dobrze regenerujące eksplantaty. Procedura ta składa się z następujących etapów:

1. Inokulacja zwana także kokulturą, polega na umieszczeniu eksplantatów w roztworze bakterii

2. Wstępne pozbycie się nadmiaru bakterii przez wypłukanie eksplantatów w wodzie lub pożywce i/lub osuszenie na bibule filtracyjnej.

3. Umieszczenie eksplantatów na pożywce stymulującej regenerację pedów zawierającej jednocześnie antybiotyki, w celu eliminacji bakterii

4. Umieszczenie eksplantatów na podłożu z odpowiednim czynnikiem selekcyjnym

5. Regeneracja roślin.

Zalety transformacji za pomocą Agrobacterium:

- jest metodą wykorzystującą naturalne własności tej bakterii

- w czasie transformacji wprowadzany fragment (transgen) jest ochraniany

- jest to metoda o stosunkowo dużej wydajności wynikającej z wysokiej częstości integracji fragmentu T z genomem roślinnym

- istnieje możliwość jednoczesnego wprowadzania kilku szczepów bakterii zawierających różne geny.

W stosunku do roślin jednoliściennych metoda a okazała się mniej skuteczna i ograniczona tylko do kilku gatunków: Asparagus officinalis, Oryza sativa, Zea mays, Triticum aestivum.

Proces wprowadzania DNA do genomu komórki roślinnej obejmuje 3 podstawowe fazy:

1. Klonowanie i modyfikowanie DNA, dokonuje się w plazmidach z wykorzystaniem rekombinacji DNA.

Aby do plazmidu wprowadzić DNA przeznaczony do klonowania, oczyszczony plazmidowy DNA poddaje się działaniu nukleazy restrykcyjnej, która go przecina tylko w jednym miejscu, i z tak rozciętym plazmidem łączy się kowalencyjnie, za pomocą ligazy DNA, przeznaczony do klonowania fragment DNA (insert).

Następnie bakterie poddaje się lizie i niewielkie cząsteczki plazmidowego DNA izoluje się i oddziela od pozostałych składników komórkowych, w tym od znacznie większego chromosomu bakteryjnego.

Oczyszczony preparat plazmidowego DNA zawiera miliony kopii wyjściowego fragmentu.

2. Przeniesienie plazmidu zawierającego skonstruowany gen do Agrobacterium na drodze koniugacji.

Proces transformacji komórki roślinnej zachodzi zarówno gdy funkcja vir oraz T-DNA ulokowane SA na tym samym lub na oddzielnych plazmidach w Agrobacterium. Cecha ta umożliwiła opracowanie dwóch systemów wektorowej transformacji.

      1. To system kointegracyjny (cis), w którym nowe geny wprowadzane są drogą homologicznej rekombinacji do T-DNA obecnego w plazmidzie Ti.

      2. To system binarny (trans), w którym nowy gen ulokowany zostaje w T-DNA plazmidu zdolnego do replikacji w Agrobacterium, i nastepnie wprowadzony do komórki Agrobacterium zawierającej tzw. rozbrojony (pozbawiony T-DNA) plazmid Ti (Ri). W tym przypadku plazmid Ti pełni funkcję plazmidu pomocniczego, indukującego przez geny wirulencji proces przenoszenia DNA z plazmidu binarnego.

Sklonowany gen najpierw wstawiamy w typowy wektor plazmidowy replikujący się w E.coli i zawierający T-DNA oraz geny selekcji w Agrobacterium i w komórkach roślinnych. Następnie plazmid taki (namnożony w E.coli), zostaje wprowadzony do Agrobacterium poprzez koniugację w której zostaje zintegrowany z plazmidem Ti w procesie homologicznej rekombinacji (ponieważ plazmidy pośredniczące nie mają zdolności do replikowania w A.t).

Plazmid pomocniczy jest modyfikowanym plazmidem Ti, nie ma on rejonu T ale zawiera region vir któ®ego geny aktywnie uczestniczą w wycinaniu fragmentu DNA zawartego pomiędzy sekwencjami LB-RB wektora binarnego.

2.Przenoszony fragment DNA ulega integracji z genomem rośliny podczas wspólnej inkubacji (kokultywacji) Agrobacterium z komórkami roślinnymi lub eksplantatami.

Dla dokonania selekcji transformantów, u których wprowadzony gen nie wywołuje łatwo dostrzegalnych zmian genotypowych, wymagane są konstrukty plazmidowe posiadające oprócz genu, którego ekspresję chcemy badać, także gen selekcyjny (markerowy) oraz gen reporterowy.

Przykładami są:

Obecnie najczęściej stosowany gen pochodzący z E.coli

Użyteczność GUS jako enzymu reporterowego wynika z jego małej endogennej aktywności u badanych dotychczas roślin.

Aktywność enzymu oznacza spektrofotometrycznie, fluorometrycznie a także poprzez testy histochemiczne umożliwiające lokalizację aktywności enzymatycznej w transformowanych komórkach i tkankach. W tym ostatnim przypadku po wprowadzeniu do roślin substratu X-glukuronid uzyskuje się barwę niebieską łatwą do histochemicznego oznaczenia.

Lucyferaza ze świetlików (Photinus pyralis) katalizuje zależne od ATP utlenienie lucyferyny (naturalny pigment występujący w komórkach niektórych bakterii i świetlików), któremu towarzyszy emisja światła. Enzym wykazuje dużą specyficzność w stosunku do lucyferyny. Brak układu enzym-substrat w roślinach oraz znaczna czułość reakcji powodują iż jest to dogodny enzym reporterowy.

Zielone białko fluoryzujące (ang. greek fluorescent protein, GFP)

GFP jest bardzo użytecznym białkiem w biologii molekularnej komórki. Jego łatwa wizualizacja i brak toksyczności wobec organizmów żywych sprawia, że znakomicie sprawdza się jako cząsteczka reporterowa, służąca do badania np. aktywności promotorów lub wydajności transfekcji komórek. Dodatkowo, metodami inżynierii genetycznej z GFP i badanego białka, co pozwala na uwidocznienie lokalizacji tego białka w komórce lub zmiany tej lokalizacji pod wpływem różnych czynników.

Geny selekcyjne:

  1. Odporność na antybiotyki

  2. Odporność na herbicydy

  3. Zdolność do rozkładu toksycznych związków chemicznych

  4. Stymulacja wzrostu i rozwoju in vitro

  5. Zdolność do przekształcania (rozkładu) określonych węglowodanów

Dla tworzenia bibliotek genomowych fragmentacji poddaje się caly DNA danego organizmu. Następnie łączy się powstałe fragmenty z określonym wektorem. Każda zatem cząsteczka wektora zaw. Wbudowany 1 fragment DNA organizmu, którego bibliotekę tworzymy. Biblioteka genomowi jest zatem reprezentacją całego DNA organizmu. Zawiera geny ale także introny, sekwencje regulatorowe itd. Stąd też wektor niekoniecznie musi zaw. fragment DNA odpowiadający genowi. Ale na pewno zawiera wszystkie geny danego organizmu.

DNA jest najpierw izolowany z próbki tkanki lub kultury komórkowej, a następnie rozcinamy nukleozą restrykcyjną, co pozwala uzyskać miliony różnych fragm.. DNA. Wprowadza się je następnie do wektorów plazmidowych w warunkach sprzyjających umieszczenie tylko jednego fragm. DNA w każdej cząsteczce plazmidu. Otrzymana kolekcja klonowanych fragm. DNA nazywa się „biblioteką DNA”. W tym przypadku jest to biblioteka genomowa, gdyż fragm. DNA pochodzą bezpośrednio z chromosomowego DNA.

Klony genomowi stanowią przypadkowe próbki wszystkich sekwencji DNA występujące w genomie danego organizmu i z niewielkimi wyjątkami zawierają jednakowe sekwencje niezależnie od typu komórek, z których pochodzi DNA. Ponadto klony genomowi otrzymane z organizmów eukariotycznych oprócz sekwencji kodujących białka zawierają duże ilości powtarzających się sekwencji DNA, intronów, rejonów regulatorowych różnych genów oraz „przerywnikowy DNA”.

Gen -> egzon - rejon kodujący -> intron - rejon niekodujący

Biblioteka cDNA

Przy jej tworzeniu wykorzystujemy fakt, iż inf genetyczna z genów aktywnych w określonym typie kom. Jest przypisywana na mRNA. To mRNA jest izolowane, a następnie przy pomocy enzymu odwrotnej transkryptazy informacja mRNA jest przepisywana na DNA komplementarne do mRNA określane jako cDNA, które jest następnie łączone z wektorem.

Natomiast klony cDNA zawierają tylko sekwencje kodujące i to tylko tych genów, które ulegają transkrypcji na mRNA w tkance, z której pochodzi RNA. Ponieważ komórki różnych tkanek wytwarzają różne zestawy cząsteczek mRNA, dla każdego rodzaju tkanki uzyskuje się inną bibliotekę cDNA. Biblioteki cDNA konstruuje się także w tym celu, by uzyskać obraz zmian ekspresji genów w kom. podczas różnych etapów ich rozwoju lub różnicowania się.

Najważniejszą zaletą klonów cDNA jest to, że zawierają one nieprzerwane sekwencje kodujące genów. Tak więc jeśli celem klonowania jest albo dedukcja sekwencji aminokwasowej białka na podstawie sekwencji DNA, albo produkcja dużej ilości białka przez ekspresję klonowanego genu w kom. bakterii lub drożdży (żadne z niech nie mogą uzyskiwać intronów zawierających mRNA, który jest produktem transkrypcji w kom. ssaków), istotne jest rozpoczęcie tych działań od cDNA. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) powiela wybrane sekwencje DNA. PCR opiera się na wykorzystaniu polimerazy DNA do kopiowania DNA (pełniącego rolę matrycy) w powtarzanych rundach replikacji. Polimeraza naprowadzana jest na sekwencje przeznaczone do skopiowania przez krótkie digonukleotydy starterowe, które ulegają hybrydyzacji z matrycowym DNA na początku i na końcu powielanej sekwencji DNA. Oligonukleotydy te są tak skonstruowane, by mogły stanowić startery do replikacji każdej z nici wyjściowego dwuniciowego DNA.

PCR można stosować do powielania (amplifikacji) tylko takiego DNA, którego sekwencja początkowa i końcowa są znane. Naprowadzana przez startery polimeraza DNA syntezuje wiele kopii (zazwyczaj ok. miliarda) potrzebnego odcinka DNA. PCR jest metodą niezwykle czułą, za jej pomocą można wykryć pojedynczą kopię jakiejś sekwencji DNA, gdyż PCR powiela ją tak mocno, że produkty amplifikacji stają się wykrywalne, na przykład przez barwienie po elektroforetycznym rozdziale w żelu.

Amplifikacji powinny być poddane te fragm.. które:

Aby powielić jakiś odcinek DNA metodą PCR, należy znać sekwencje nukleotydowe krótkich rejonów oskrzydlających odcinek przeznaczony do amplifikacji. Umożliwia to zaprojektowanie dwóch syntetycznych oligonukleotydów, z których jeden musi być komplementarny do sekwencji oskrzydlającej powielany odcinek DNA po jednej jego stronie, a drugi - po drugiej. Oligonukleotydy te służą jako startery do syntezy DNA In vitro, katalizowanego przez polimerazę DNA i równocześnie określają długość powielanego odcinka DNA.

Punktem wyjścia PCR jest dwuniciowy DNA i każdy cykl reakcji rozpoczyna się od krótkiego ogrzania 2-niciowej cząsteczki w celu oddzielenia od siebie obu jej łańcuchów (etap1) - denaturacja 950C.

Po oddzieleniu łańcuchów mieszaniną reakcyjną oziębia się w obecności dużego molowego nadmiaru obydwu oligonukleotydów starterowych, co powoduje ich hybrydyzację z komplementarnymi sekwencjami na końcach rejonu powielanego (etap2) - przyłączanie starterów 540C.

Mieszaninę inkubuje się następnie polimerazą DNA i czterema trifosforanami deoksyrybonukleozydów, dzięki czemu zachodzi synteza DNA rozpoczynająca się od każdego z dwóch starterów (etap3) - elongacja 720C.

Cykl reakcji powtarza się od termicznej dysocjacji nowo utworzonych dwuniciowych cząsteczek DNA. W metodzie tej wykorzystuje się specjalną polimerazę DNA, izolowaną z bakterii termofilnych; polimeraza ta jest trwała w temp. Znacznie wyższych niż eukariotyczna polimeraza DNA, dzięki temu nie ulega denaturacji podczas termicznej denaturacji DNA.

Izolowanie genu jest to wyodrębnienie, sklonowanie i scharakteryzowanie fragmentu DNA stanowiącego jednostkę funkcjonalną w genomie.

Należy przy tym uwzględnić:

- strukturę pierwszorzędową (sekwencje)

- funkcje genu

- miejsce genu w genomie

- rodzaj kodowanego RNA i wzór jego ekspresji.

Klonowanie pozycyjne

Metoda poszukiwania genów na podstawie sporządzonych map gamet, uzyskanie kolekcji mutantów oraz badaniu sprzężeń pomiędzy markerem genetycznym, a poszukiwanym genem.

Gatunki modelowe: Zea mays, Arabinopsis thaliana, L.esculentum.

W metodzie tej po obu stronach genu poszukuje się możliwie blisko zlokalizowanej sekwencji, tzw. Markerów DNA, które byłyby miejscami startu do poszukiwań sekwencji leżących pomiędzy nimi.

Marker - poszukiwane sekwencje genu - marker

Klonowanie funkcjonalne

Metoda poszukiwania genów na podstawie ich produktów białkowych - zakłada analogiczność mechanizmów kontroli podobnych cech lub procesów w różnych organizmach nawet odległych taksonomicznie.

Ze względu na to gdzie gen będzie poszukiwany:

- biblioteka genomowi;

- izolacja bezpośrednio z genomu.

Izolacja genów z biblioteki genomowej

  1. oparte na analogii funkcji genów

Zakłada się, że sekwencji danego genu z jednego gatunku można użyć do izolacji genu z innych rodzajów czy rodzin.

Sonda heterologiczna to fragment genu lub jego cDNA z innego organizmu, może ona pochodzić z:

- sekwencji samego genu

- cDNA.

- jest możliwe jeśli białko czy mRNA pojawiają się w miejscu i czasie ekspresji podonych do wyizolowanych z innych gatunków, lub też są podobne strukturalnie i funkcjonalnie.

- konieczne jest uzyskanie wystarczającej ilości oczyszczonego białka lub mRNA (dla określenia sekwencji startera lub transkryptu).

Np.

Do izolacji genu kodującego białko ulegające specyficznej ekspresji w komórkach embrionalnych D.carota ale zanikające po rozpoczęciu embriogenezy (tzn. po przełożeniu na pożywkę bez auksyn).

cDNA genu kodującego to białko wyszukane w ten sposób, że na podstawie sekwencji aminokwasów zaprojektowano parę zdegenerowanych starterów PCR i wykonano przegląd biblioteki cDNA metodą PCR.

Gdy znana jest sekwencja heterologiczna, wtedy do przeszukania biblioteki na ogół wybiera się tylko jej fragmenty.

Z reguły jest on mniej lub bardziej konserwatywny i charakterystyczny dla danej klasy lub grupy genów.

Konserwatywność wybranego fragmentu zależy od oceny prawdopodobieństw znalezienia homologa dla DNA heterologicznego u formy analizowanej.

Np. Aktyny to białka biorące udział głównie w ruchach strumieniowych cytoplazmy.

Są one na tyle podobne, że do izolacji kodujących je genów u Glicyne max i Zea mays użyto fragmentów wielkości 1,1 kz z cDNA śluzowca Dictyostelinum discoideum.

Izolację prowadzono bezpośrednio z bibliotek genomowych obu gatunków.

  1. Oparte na wykorzystaniu inercji DNA (tagowanie genów).

Istotą metody jest zmiana lub zanik funkcji genu w skutek inercji zdefiniowanej sekwencji (sekwencja tagująca) do genu lub w jego pobliżu. Wywołana inercją mutacja pozwala zidentyfikować gen. Ponieważ sekwencja tagująca jest znana, używa się jej jako sondy do przeszukiwania biblioteki skonstruowanej na bazie tagowanego DNA i izoluje klony zawierające insert tagujący wraz z sekwencjami otaczającymi, które należą do tagowanego genu.


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
biotechnologia wykład
biotechnologia wykład pytania, Ogrodnictwo, Semestr VII, Biotechnologia
Biotechnologia wykłady
biotechnologia wykłady 2
Biotechnologia Wyklady lejczak id 89046
B II W03, studia, bio, 4rok, 8sem, biotechnologia2, wykład
BIOTECHNOLOGIA WYKŁADY
B II W12, studia, bio, 4rok, 8sem, biotechnologia2, wykład
B II W01, studia, bio, 4rok, 8sem, biotechnologia2, wykład
BIOTECHNOLOGIA wyklady przepisane, Ogrodnictwo, Semestr VII, Biotechnologia
biotechnologia wykład test - pytania nie powtarzajace sie, Ogrodnictwo, Semestr VII, Biotechnologia
Biotechnologia wykłady, Ochrona Środowiska pliki uczelniane, Biotechnologia środowiskowa
wykład 1, Biotechnologia - wykład 1 ( 26
Biotechnologia wyklad(1), Studia PŁ, Ochrona Środowiska, biotechnologia
metody dezintegracji komórek, studia, bio, 3rok, 6sem, biotechnologia, wyklad
Biotechnologia wyklady id 89045 (2)

więcej podobnych podstron