Prof. dr hab. Inż. Krzysztof Żyła Biotechnologia Żywności wykład 1 13.10.2008r

Najstarsze biotech. : piekarnictwo, piwowarstwo, winiarstwo.

Zintegrowane zastosowanie biochemii, mikrobiologii oraz inżynierii biochemicznej, genetycznej i

procesowej do produkcji żywności ( z użyciem mikroorganizmów).

Cele biotechnologii:

- podniesienie jakości

-przedłużenie okresu przechowywania żywności

- analiza składu żywności

Pierwszy zobaczył mikroorganizm Antoni van Lewenhook.

Zajmował się tym Ludwik Paster

Bios – życie harmonia technologii i natury

Alternatywne biotechnologie, różne rozwiązania problemu. Biotechnologia korporacyjna i

globalistyczna.

A→B a). hodowla mikroorganizmu, wykorzystanie

b). preparat np. enzymatyczny

c). wykorzystanie technik inżynierii genetycznej

•nauka zajmująca się otrzymaniem produktu przy pomocy mikroorganizmów, wirusów….

•pomaga przy pozyskiwaniu dodatków i czynników wspomagających produkcje żywności (zamiast

dodatków chemicznych)

Dodany biokatalizator organizm rozkłada do aminokwasów które są przyswajalne. Związek chemiczny

dodany do żywności może wywołać w organizmie pożądane bądź nie pożądane właściwości

• obniżenie kosztów przetwórstwa

• dostarczenie szybkich takich metod analitycznych dla medycyny i ochrony środowiska

• przedłużenie trwałości produktów

• obniżenie kosztów obróbki odpadów przez stosowanie biodegradalnych materiałów do pakowania

produktów

•otrzymanie cech terapeutycznych np. hormonów

•i w wielu innych dziedzinach m. In. Ochronie środowiska, nowych metodach leczniczych

Zastosowanie współczesnej biotechnologii w produkcji żywności

*przemysł spożywczy

- tradycyjne metody fermentacji- produkcja pieczywa, piwa, wina, drożdże, ferment. napoje mleczne

-nowe technologie mikrobiologiczne wytwarzania jednokomórkowców (SPC), aminokwasów,

witamin, nukleotydów, kwasów organicznych, polisacharydów

- zastosowanie enzymów do wytwarzania wyrobów mleczarskich, owocowo-warzywnych, napojów

fermentowanych, przetworów skrobiowych

- utrwalenie żywności: oksydaza glukozowa (antyutleniacz), nizyna

Aspergillus niger – kumulacja w komórce wysokiej zawartości oksydazy glukozowej

Dokonuje ona konwersji β-D-glukoza + O2→ kwas glukonowy + H2O2

↓ katalaza

H2O + ½ O2

Wykazuje specyficzność do β-D-glukozy (anomeru) wyłącznie ją utlenia w reakcji:

1

H2O2 +protodianidyzyna (ODA) red. → H2O + (ODA)utlen.

Bezbarwny peroksydaza intensywna barwa

Metody analizy stężenia glukozy:

W hodowlach A. niger towarzyszy katalaza, wtedy system analityczny jest bez sensu. Do celu

analitycznego ten enzym jest oczyszczany.

Oksydaza glukozowa:

-do wytwarzania kwasu glukonowego

- do przekształcania glukozy

- zahamowania reakcji Maillarda

-ten sam system może usuwać tlen, czyli zachowuje się jako przeciwutleniacz, wykorzystywane do

utrwalania napoi

*rolnictwo (produkcja roślinna i zwierzęca)

-produkcja pasz i preparaty białkowe, witaminowe aminokwasowe, antybiotyczne, stymulatory

wzrostu, kiszonki roślinne

- nowoczesne techniki hodowli tkanek i komórek In vitro oraz metody inżynierii genetycznej

-ochrona roślin i antybiotyki, bioinsrktycydy, biopestycydy

- leczenie zwierząt i szczepionki

OSIĄGNIĘCIA BIOTECHNOLOGII:

•6000 lat p.n.e. stosowanie drożdży do fermentacji wina (naturalne organizmy bytujące na owocach)

•1865r Grzegorz Mendel – ustalenie zasad przekazywania cech dziedzicznych

•1869r Friedrich Mischner wyizolował DNA

•1883r – wprowadzenie czystej kultury do technologii piwowarskiej

•1894r – uruchomienie w USA produkcji amylazy grzybowej na skalę przemysłową Takamine

(Japończyk), inokulacja biomasy, spreparowanej grzybem, rozwinięta populacja przerasta podłoże i za

razem z nim przechodzi do produktu. Przerośnięte podłoże Aspergillus, wysuszone, poddane

rozdrobnieniu, zalane woda bądź buforem, mieszana dla ekstrakcji enzymów grzybowych i

oczyszczanie ekstraktu. W takim koncentraciku oprócz amylazy grzybowej było mnóstwo innych

enzymów.

•1944r Avery opisał budowę genów i funkcję DNA

•1923r pierwsza na świecie fabryka kwasu cytrynowego metodą tlenowej fermentacji

powierzchniowej z A. niger Koncern Pfizer

A. niger wzrastał na cienkiej cieczy (roztwór melasy) na początku słodka

•1941r opracowanie produkcji penicyliny (Florey i Choin)

•1985r nasiona i kultury tkankowe mogą być przedmiotem ochrony patentowej

•1994r Calgene- sprowadziła genetycznie zmodyfikowane pomidory bez enzymu poligalakturonazy( –

enzym rozmiękczający owoce ) flavr savr

•Polska – dodatki do pasz w formie zmodyfikowanej kukurydzy czy też soi

•26 czerwca 2000r skończył się wstępny etap poznania genomu ludzkiego. Celeva Genomics ogłosili,

że udało się ustawic je we właściwej kolejności

•1953r przedstawienie modelu budowy cząsteczki DNA – Crick i Watson

•1970r H. Smith izolacja, charakterystyka enzymów restrykcyjnych dla fragmentu DNA i RNA

•1973r H. Boyer pierwsze klonowanie genów

•1983r wprowadzenie zgody do środowiska organizmów GMO

•1976r pierwsze normy prawne dotyczące inżynierii genetycznej

2

Wykład 2 20.10.2008r

GMO Genetically Modified Organism

Wg ustawy o organizmach genetycznie modyfikowanych z 22.06.2001r jest to organizm inny niż

człowieka, w którym materiał genetyczny został zmieniony w sposób niezachodzący w warunkach

naturalnych w skutek krzyżowania lub naturalnej rekombinacji.

Konwencjonalne i biotechnologiczne konwersje substancji:

Surowce: węgiel, ropa, gaz skrobia, glukoza, lignina, odpady przemysłu rolno- spożywczego Reakcje: wysokie T-P , kataliza heterogeniczna fermentacje, biokataliza

Separacja: destylacja chromatografia, filtracja membranowa Przemysł bazujący na biotechnologii: wymaga stosowania wcześniej zdobytych zestawów

umiejętności do rozwiązania nowych problemów.

Biotechnologia dominuje w produkcji niektórych dóbr konsumpcyjnych:

Rynek mld USD

Kwas cytrynowy 100% 2,5%

Kwas glukonowy 50 0,2

Kwas mlekowy 100 0,3

Witaminy: C 100 0,5

B2 95 0,2

Aminokwasy:

Kwas glutaminowy 100 1,3

Lizyna 100 1,1

Fenyloalanina 100 0,2

Inne: nukleotydy 100 0,4

Enzymy 80 1,8

Guma ksantanowa 100 0,4

Ryboflawina :

95% synteza chemiczna

100%

5%

biotechnologia

1994r 1998r

Reguła aminokwasów egzogennych: soja → olej to co zostaje 46-48% białka, śruty poekstrakcyjnej,

za mało tam Liz i Met. Podawane do paszy po wytworzeniu biosyntezy.

Guma ksantanowa- polisacharyd

Biotechnologia hodowla tkanek

Człowiek diagnostyka

Biomedycyna

rolnictwo transgeniczne rośliny

transgeniczne zwierzęta

przemysł biopaliwa

ochrona środowiska

królik z zieloną sierścią – transgeniczne zwierze

fluoryzujące kolorowo ryby – organizmy wskaźnikowe czystości wody •I klasa fluoryzują na zielono

•II klasa fluoryzują na żółto

3

Wykorzystywanie tkanek zwierzęcych w medycynie

skrawek tkanki w sterylnych warunkach hodowany na pożywce, tkanka kallusowa powstaje z której

może być wytworzona nowa roślina, szybkie przygotowanie dużej ilości takich samych egzemplaży.

Potem zaczęto wprowadzać nowe geny

Biotechnologia czerwona- medycyna

Biotechnologia biała- przemysłowa

Biotechnologia zielona- rolnicza

Wytwarzanie insuliny (biomedycyna, z mikroorganizmu).

Diagnostyka- od chwili urodzenia będzie wiadomo z sekwencji genów na jakie choroby człowiek

będzie chory.

Z mikroorganizmów → drożdże, bakterie, komórki roślinne, zwierzęce, hodowla sztucznych tkanek

np. skóry dla ludzi z poparzeniem.

Obszary zainteresowań biotechnologii żywności:

-technologia rekombinowanego DNA, wprowadzenie nowego DNA- klonowanie

- enzymologia i technologia enzymów- katalityczne właściwości białek wykorzystane w postaci

rozpuszczonej lub unieruchomionej

-roślinne kultury tkankowe- w celu otrzymania żądanych substancji lub przeprowadzenia

biotransformacji

-technologia fermentacji i inżynieria procesowa

Inżynieria genetyczna

Inżynieria biochemiczna i

procesowa

Przedmiot biotechnologii

Biologia

Żywności to

wspólna cześć tego wszystkiego

Mikrobiologia

Procesy w biotechnologii:

Produkt surowiec mikroorganizmy Pieczywo mąka, ziarna zbóż Saccharomyces cerevisiae Piwo słód Saccharomyces cerevisiae Wino sok owocowy Saccharomyces cerevisiae Brandy/whisky wino/zboże Saccharomyces cerevisiae

Ser twardy mleko Streptococcus, Lactobacillus Ser pleśniowy mleko Penicillum camemberti Jogurt mleko Streptococcus, Lactobacillus Kefir mleko Candida kefir, Lactobacillus kefir Kawa ziarno kawy bakterie kwasu mlekowego Kiełbasa wołowina, wieprzowina

Lactobacillus, Staphylococcus

Sos sojowy ziarna soi Aspergillus oryzae Kwas askorbinowy Gluconobacter

Kwas cytrynowy napoje, produkty mleczne Aspergillus

Kwas fumarowy produkty mleczne Rhizopus sp.

4

Kwas glutaminowy poprawia smak Corynebacterium

Kwas mlekowy większość zastosowań Lactobacillus delbrueki

Kwas jabłkowy dżemy, galarety, napoje Aspergillus

Kwas mlekowy: produkty mleczne, mięsne, w farmacji też.

lizyna, metionina, tryptofan, SCP

Techniki biotechnologii żywności:

- inżynieria genetyczna

-hodowla komórek zwierzęcych i roślinnych In vitro

- inżynieria biotechniczna

-mutagenezy i selekcji

-unieruchomienie enzymów

-techniki biosensorowe

-fermentacji, projektowania bioreaktorów , powiększenie skali

Zasady purynowe A G i pirymidynowe C T U C G A T

Bardziej stabilne obszary mniej stabilne obszary

Struktura DNA

Na końcu nici mRNA końcówka adeninowa, aby wydzielić mRNA wykorzystujemy to i budujemy

sztuczny ogon polityminowy. Jeżeli wrzucimy do kolumny mnóstwo różnych związków to wszystko

wyleci z wyjątkiem mRNA (który połączy się z ogonem T-T-T-T-T-T-). Stosujemy czynnik, który

rozwiąże wiązania wodorowe między T-A np. siła jonowa. Obserwujemy wymywanie mRNA z

kolumny.

tRNA nie dostarcza aminokwasów syntezy białka w gruczołach mlecznych- tam jest glutation,

naturalny tripeptyd.

Aminokwasy: hydrofoby, hydrofile zjonizowane i niezjonizowane.

Struktura białka, funkcje białek: - motoryczna

- obronna (przeciwciała)

- katalityczna (enzym)

- energetyczna

- strukturalna (kolagen)

Wykład 3 27.10.2008r

Izolacja kwasów nukleinowych:

1). Otrzymanie homogenatu tkanki

2). Usunięcie białek zasocjowanych z kwasem nukleinowym

3). Ekstrakcja wodnych roztworów (rozpuszczalnik organiczny – fenol + chloroform) (fenol denaturuje

białka i rozpuszcza kwasy nukleinowe, chloroform dezaktywuje enzymy w tym nukleazy)

4). Odparowanie rozpuszczalnika

5). Kwasy nukleinowe wytrącone etanolem w temperaturze < 0⁰C w obecności kat. I-wartościowego

amonowy, litowy, sodowy

do wytrącenia DNA dajemy na jedna objętość DNA- dwie objętości etanolu,

do RNA- trzy objętości etanolu

6). Rozpuszczanie osadu w buforze

5

•znane są metody przez odsalanie białek bez użycia rozpuszczalnika organicznego z wykorzystaniem enzymu proteinaza K . Wysokocząsteczkowe DNA izolowany- destabilizujące wykorzystanie

izotiocjanianu g....dyny (nie mogę rozszyfrować tego) i strącając DNA alkoholem izobutylowym.

•do ekstrakcji DNA-zestaw odczynników razem z odpowiednia procedurą.

•RNA są mniej stabilne niż DNA – rybonukleazy bardziej aktywne niż deoksyrybonukleazy

Wszystkie odczynniki są traktowane niszczącymi związkami

Rybonukleazy- szkło sterylizuje się , materiał przechowywany w <70⁰C temperaturze

•izolacja mRNA – chromatografia powinowactwa, na końcu ogon poliadeninowy.

Tworzy się polityminowy nukleotyd , wada metody powinowactwa- przygotowanie nośników jest

zabiegiem drogim.

Endonukleazy destrykcyjne:

- z komórek bakteryjnych

-mechanizm obronny

-pierwotne funkcje: degradacja DNA z atakujących wirusów

- rozpoznają specyficzne sekwencje DNA zwykle wielkości 4-8 par zasad

- zawsze przecinają DNA w tym samym miejscu

-stosowane w celu wprowadzenia DNA do genomu z innego źródła

Wiedząc, że ten DNA jest wirusa, bo jest znaczony macierzysty DNA – wbudowane są reszty

metylowe- unika ataku endonukleaz restrykcyjnych.

Schemat akcji katalitycznej:

Enzym z E. coli

GAATTC → G AATTC

CTTAAG CTTAA G

↑

Enzym restrykcyjny w buforze KGB(potasowo-glutaminowym)

Aber, Nathans, Smith 1978 Nobel za to

Lepkie końce rozeszły się

Nazwa

Bam HI Bacillus amyloliquefaciens H G↓GATCC

Eco RI E. coli RY13 G↓AATTC

Hind III Heamophillus influenza Rd A↓AGCTT

Noe I Nocardia aerocolonigenes GCC↓GGC

Past I Providencia CTGCA↓G

Sma I Serratia marcesceus CCC↓GGG

Klonowanie DNA: końce cięcia

Lepkie końce każdy fragment DNA (niezależnie od pochodzenia) otrzymujemy w wyniku cięcia przez

ten sam enzym restrykcyjny na identyczną sekwencje zasad na dwóch przeciwległych końcach.

Palindrom- sekwencja rozpoznawana przez enzym restrykcyjny, czytany w kierunku 5”→3” na jednej

Identyczne jak czytany 5”→3” na nici komplementarnej.

Liczba par zasad w miejscu restrykcyjnym decyduje o odległości między miejscami restrykcji. Srednia

odległość 4n , gdzie n- liczba zasad w miejscu restrykcji.

Kb (kilo par zasad)= 1000 par zasad

Równe fragmenty restrykcyjne mogą się łączyć komplementarnie tworząc cząsteczkę DNA. Nie jest to

stabilne połączenie (bez fosfodiestrowego wiązania).

6

Mapowanie restrykcyjne DNA – elektroforeza w żelu poliakrylamidowym.

++++++++

++++++

+

na samej górze kawałek o najmniejszej masie

---------------

------------- linia startowa

Typy wektorów

Plazmidowe wirusowe chromosomowe(sztuczne)

Fagowe YAC BAC MAC

Hybrydowe wirusów (drożdży) (barteryjny) (sztuczny chromosom (kosmidy) eukariontów ssaków) Właściwości wektorów:

-mogą przyjąć obcy DNA bez zaburzenia funkcji

- umożliwiają rozróżnienie komórek sklonowanych od tych które ich nie zawierają (obce DNA)

-rozmiar wektora większa liczba kopii im mniejszy w pełni funkcjonalny tym lepiej może być

replikowana do większej ilości kopii i więcej przyłącza odcinków DNA

Kolisty DNA wektor, enzymy replikacji namnażanie się. Jeżeli większy wektor to tylko na przykład 2

się zrobią bo więcej się nie zmieści. Zazwyczaj jedna kopia niesie jeden gen, dlatego im więcej kopii to

więcej danego białka ta komórka będzie syntetyzować.

Podstawowe typy wektorów:

Plazmidy, wektory fagowe Najprostszy wektor = sekwencja ori + marker selekcyjny

Umożliwia automatyczną umożliwia odróżnienie komórki które mają

Replikacje wektora w komórce ten wektor ori i inne które go nie mają

Marker sekwencyjny = np. odporność na antybiotyki

Ori sekwencje startu replikacji + użyteczne miejsca restrykcji – sekwencje palindromowe

pBRSZZ sztandarowy wektor (plazmid) plazmidowego z genu antybioticR, cienkie miejsca cięcia,

10-15 kopi na komórkę, do klonowania E. coli, 4361 bp

EcoRJ (RAATTC)

Plazmidy od litery p potem skrót imienia i nazwiska kto to skonstruował

Klonowanie: cięcie wektora enzymem EcoRI (może być tylko jedno w DNA) i interesującego nas genu

w obcym DNA → lepkie końce łączą ten gen z DNA (dodany enzym ligaza wbudowuje wiązania

disulfidowe) → wprowadzenie do bakterii i namnażanie DNA , wzrost liczby komórek i replikacja DNA

w obrębie komórek → izolacja na pożywce zawierającej antybiotyk (eliminacja plazmidu nie

zawierających) bez genu oporności → wzrost na pożywce rekombinowanego organizmu z genem

opornościowym → namnażanie i oczyszczanie DNA w etapie skryningiem zwany izolacja tych

komórek co zawierają interesujący nas gen.

Transfer DNA / bakterie

Przenoszenie DNA, •transformacja – wprowadzenie natywnego bądź rekombinowanego DNA do

kompetentnych komórek bakterii (zdolnych do przyjęcia obcego DNA?)

•Transdukcja- fag wirusa wkomponowuje się do DNA komórki gospodarza

•Koniugacja- transfer DNA z donora na komórkę odbiorcy (naturalna wymiana)

Wykorzystanie bakteryjnych plazmidów:

7

Izolacja plazmidu z komórki bakterii (naturalne pozachromosomalne odcinki DNA przenoszące gen odporności na antybiotyk) z komórki interesujący gen izolowany DNA, podobnie jak wektor działanie

enzymu restrykcyjnego, łączenie tych rzeczy ze sobą (losowe), zrekombinowany plazmid

wprowadzany do bakterii, potem rekombinowana komórka bakteryjna wykorzystujemy jako źródło

wielu kopi genu który nas interesuje (gen oporności na herbicydy). Albo interesujące nas białko

syntetyzowane przez ten odcinek DNA. Po badaniu np. insulina wykorzystywanie w medycynie.

Klonowanie ludzkiego genu w bakteryjnym plazmidzie:

Wektor pUC

Po izolacji DNA wektora, wprowadzenie DNA ludzkiego, dodanie ligazy komórki E. coli. Szukamy na

podłożu selektywnym komórek z tym genem, potem tylko hodowla tych komórek aby zaczeły

syntetyzować białko.

Wektory fagowe:

Bakteriofagi – wirus infekujący bakterie, zawiera zewnętrzną otoczkę białkową, wewnątrz zawiera

DNA lub RNA, rozmiar 20-200 nm , występuje we wszystkich środowiskach.

Struktura : główka lub kapsyd (wewnątrz DNA lub RNA), szyjka , ogon, wrzecionka ogona (fiz.

Łączenie z komórką infekowaną).

Najbardziej znany bakteriofag lambda ok. 20 kb ( retrowirus – w otoczce nukleinowej jest RNA)

dsDNA

1/3 genomu może być wycięta bo nie jest istotna dla jego rozwoju.Bakteriofag nie jest retrowirusem!

Usuwa się odpowiednią cześć na fazę lizy, zostawia lizogenny(?). Pakowanie DNA sklonowanego do

kapsydów in vitro i komórka biorcy infekowana danym fagiem. Wysiew na szalce- tam gdzie łysinki

E.coli (martwe komórki)

Łysinki białe (z obcym DNA) i niebieskie

Izolacja łysinek z białym kolorem, potem kosmidowe wektory, hybrydowe faga λ(lambda) i plazmidu,

DNA replikuje jak u plazmidu i może być podany do kapsydu jak u faga

-może nosić trzy razy więcej DNA niż λ

- maja strukturę kolistą

-zawierają ori

-markery selekcyjne (Bam HI, San 3A)

-miejsca restrykcyjne

-geny odporności na antybiotyki

- takie sekwencje c-COS -ssDNA stąd nazwa kosmidy

8