1

W1

Biotechnologia- jedna z kluczowych nauk XIX wieku.

Biotechnologia jest nauką interdyscyplinarną skupiającą:

-

chemia

-

biologia

-

biofizyka

-

matematyka

-

inżynieria chemiczna

-

inżynieria środowiskowa

Biotechnologia: wykorzystanie możliwości organizmów żywych oraz pochodzących z nich
biokatalizatorów do produkcji i ulepszania dóbr konsumpcyjnych.

Inspiracją dla rozwoju biotechnologii jest podpatrywanie przyrody i wykorzystywanie jej
mechanizmów metabolicznych oraz regulacyjnych w celu polepszenia życia człowieka.

Podział biotechnologii:

-

klasyczna

-

nowoczesna

BIOTECHNOLOGIA KLASYCZNA

Ø Procesy fermentacyjne:
-

produkcja piwa

-

produkcja wina

-

produkcja octu

-

produkcja fermentowanych napojów mlecznych

-

wytwarzanie chleba z użyciem zakwasu

Ø Metabolity pierwszorzędowe: są to niewielkie cząsteczki chemiczne, które mogą być

produktami końcowymi podstawowych procesów metabolicznych lub ich produktami
pośrednimi

Ważne przemysłowo metabolity pierwszorzędowe:
-

alkohole: alkohol etylowy

-

alkohole wielowodorotlenowe: glicerol

-

aminokwasy: Lys, Thr, Phe, Trp

-

kwasy organiczne: kwas octowy, kwas propionowy

-

cukry: fruktoza

-

polisacharydy: ksantan, gellan

-

witaminy: B

2

, B

12

Ø Biokonwersja (biotransformacja): aktywność mikroorganizmów w zakresie enzymatycznych

przekształceń różnych związków chemicznych, które nie wykazują zazwyczaj żadnej funkcji
metabolicznej i z dużą wydajnością gromadzone są pozakomórkowo.

W1

-

procesy biotransformacji nie dostarczają energii

-

nie dostarczają prekursorów do syntez komórkowych

-

przebiegają z udziałem niewielkiej ilości enzymów

-

są stereospecyficzne

-

np. biokonwersja steroli

Ø Metabolity wtórne: wszystkie procesy przemiany materii o nieznanej lub drugorzędowej

funkcji biologicznej określane są mianem metabolitów wtórnych a przemiany których są
wynikiem metabolizmem wtórnym; charakteryzują się wielokierunkową aktywnością
biologiczną

2

Produkcja metabolitów wtórnych jest silnie uzależniona od warunków środowiskowych (skład
podłoża, sposób hodowli).

Faza intensywnego wzrostu mikroorganizmów TROFOFAZA. Metabolity wtórne produkowane są
w IDIOFAZIE.

Grupa ważnych idiolitów:
-

antybiotyki

-

czynniki nieantybiotyczne (leki)

-

toksyny

-

biopestycydy

-

czynniki stymulujące wzrost roślin i zwierząt

Ø Antybiotyki: małocząsteczkowe substancje naturalne, najczęściej pochodzenia

drobnoustrojowego lub ich półsyntetyczne modyfikacje albo syntetyczne analogi

Replikacja DNA:
-

aktynomycyna,

-

ryfamycyna

Translacje:
-

chloramfenikol

-

tetracykliny

-

streptomycyny

Transport przez błony:
-

polimyksyny

-

jonofory

-

nystatyna

Synteza składników ściany komórkowej:
-

penicylina

-

cykloseryna

-

bacytracyna

Procesy energetyczne:
-

antymycyna

-

oligomycyna

W1

Przyczyny poszukiwania antybiotyków:
-

oporność drobnoustrojów

-

poprawa właściwości farmakologicznych

-

działanie toksyczne

Ø Leki o działaniu nieantybiotycznym:

POLIETERY (używane jako promotory wzrostu u przeżuwaczy):
-

Monensin

-

Lasalocid

-

Salonomycyna

AVERMYKTYNY (makrocykliczne laktony produkowane przez Streptomyces avermitilis)
wykazują aktywność p/pasożytniczą

STATYNY (pochodzenia grzybowego, czynniki obniżające poziom cholesterolu u ludzi i
zwierząt):
-

Lovastatyna

-

Parastatyna

-

Kwas klawulanowy (inhibitor penicylaz)

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

3

AKARBOZA (Actinomycetes) : inhibitor jelitowej glukozydazy, hiperglikemia i synteza
trójglicerydów w wątrobie i jelicie u pacjentów z cukrzycą, otyłością i hiperlipidemią IV


Ø Ukierunkowana biosynteza: manipulacje warunkami hodowli mikroorganizmów pozwalają na

pewną kontrolę ich metabolizmu

Stosuje się odpowiednie czynniki:
-

prekursory: biosynteza penicyliny G w podłożu z fenylooctanem

-

induktory: Met w syntezie cefalosporyn

-

mutagenezę: szczepy o wysokiej wydajności i wybiórczości produkcji

BIOTECHNOLOGIA NOWOCZESNA

Ø Technologie rekombinacji DNA

Technologia pozwalająca na manipulowanie materiałem genetycznym na najniższym poziomie
strukturalnym genu w sposób całkowicie kontrolowany przez eksperymentatora (swoiste
techniki).

Najczęściej wykorzystywane szczepy:
-

Escherichia coli

-

Bacillus subtilis

-

Sacharomyces cerevisiae

-

Aspergillus niger

W1

Otrzymujemy:
-

szczepionki

-

hormony

-

enzymy

-

przeciwciała

-

czynniki wzrostu

Ø Biosynteza kombinatoryjna

Technologie rekombinacji DNA używane są aby wprowadzić geny odpowiedzialne za syntezę
odpowiednich związków do materiału genetycznego mikroorganizmów, które wcześniej nie były
zdolne do produkcji tych związków; dalsze postępowanie jest analogiczne do biosyntezy
ukierunkowanej.

Ø Biopestycydy jako alternatywa dla klasycznych pestycydów

-

posiadają wąski i specyficzny zakres działania

-

działają powoli

-

powstrzymują a nie eliminują populacje chwastów

-

krótki czas półtrwania

-

bezpieczniejsze dla środowiska

-

brak problemu zalegania

Istnieją dwa typy biopestycydów:
1. „biochemiczne”: struktura i funkcja podobna do naturalnie występujących związków

chemicznych; nietoksyczne (analogi owadzich feromonów- kontrola owadzich populacji)

2. „mikrobiologiczne”: związki wytwarzane przez naturalnie występujące lub zmodyfikowane

genetycznie bakterie, grzyby i inne.

Ø Bioinsektycydy

-

Agrobacterium tumefaciens

4

-

Bacillus thuringiensis

ANALIZA ILOŚCIOWA MIKROORGANIZMÓW

1. Metody mikroskopowe:

•

liczenie drobnoustrojów przy użyciu komór (Thoma, Burkera)

•

liczenie drobnoustrojów w preparacie przeżyciowym

•

metoda Breeda

•

metoda DEFT

2. Metody hodowlane (tylko żywe komórki):

•

metoda rozcieńczeń

W1

•

metoda płytkowa Kocha

•

modyfikacje metody płytkowej Kocha:

o

metoda filtrów membranowych

o

metoda posiewów spiralnych

o

metody kropelkowe

o

metoda mikrohodowli Frosta

o

„plate loap”

o

„roll tube”

o

gotowe zestawy z podłożami nani9esionymi na plastikowe paski

3. Metody wagowe (mokra lub sucha biomasa).
4. Metody optyczne (turbidymetria, nefelometria).
5. Metody biochemiczne:

A. pomiar zawartości pirogronianiu (340 nm) : kwas pirogronowy

→ kwas mlekowy

- enzym: dehydrogenaza mleczanowa

- NADH

+

+ H

+

→

NAD

+

- reakcja redukcji
- zasada: obniżenie ilości zredukowanego NAD-u jest proporcjonalna do ilości

mikroorganizmów

B. bioluminescencja w wykrywaniu ATP:

metodę można stosować do badania stanu higienicznego zakładu, linii produkcyjnych czy pomiaru
ilości drobnoustrojów w środowisku
I ETAP: ekstrakcja ATP (związki zwiększające przepuszczalność błon komórkowych).
II ETAP: dodatek substratu (lucyferyny) i enzymu (lucyferazy).
Enzym w obecności ATP katalizuje reakcję oksydatywnej dekarboksylacji lucyferyny

lucyferyna

→ AMP, CO

2

, fotony światła, utleniona lucyferyna

- enzym: lucyferaza
- dodatkowo: jony Mg

2+

- zasada: światło które jest wydzielane jest równoważne stężeniu ATP; ilość emitowanego

światła jest proporcjonalna do ilości żywych komórek

C. oznaczanie poziomu ergosterolu

pomiar ilości grzybów w produktach żywnościowych

D. testy reduktazowe

6. Metody biofizyczne:

•

System Bioscrean: uniwersalny robot mikrobiologiczny (rozcieńczenia, nanoszenia,
mieszanie, kinetyczny pomiar zmętnienia hodowli); określanie zanieczyszczeń
mikrobiologicznych drożdży piwowarskich, skrobi, mleka.

•

metoda impedymetryczna: impedancja jest opornością przepływu prądu przez
przewodzącą pożywkę; rozwój mikroorganizmów prowadzi do obniżenia impedancji
podłoża podczas gdy siła jonowa i przewodnictwo zwiększają się; określanie
zanieczyszczeń mikrobiologicznych surowego i mrożonego mięsa, mleka, soków,
kosmetyków, itp.

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

5

•

cytometria przepływowa: metoda wykorzystywana do kontroli prawidłowości
przebiegu procesu biotechnologicznego opartego na hodowli mikroorganizmów

W1

PRZECHOWYWANIE MIKROORGANIZMÓW

Podstawowym źródłem szczepów są kolekcje drobnoustrojów.

1. ATCC- drożdże, bakterie, pleśnie;
2. NRRL- drożdże, bakterie, glony, grzyby strzępkowe
3. CBS- drożdże, porosty, grzyby strzępkowe; możliwość zdeponowania materiału genetycznego

drobnoustrojów

4. DSMZ- drożdże, pleśnie, plazmidy, wirusy
5. NCTC- bakteria
6. NCIMB- bakterie dla przemysłu i medycyny
7. CCM- bakterie, grzyby strzępkowe
8. CCY- drożdże i promieniowce

Kolekcje światowe są zrzeszone w Światowej Federacji Kultur z siedziba w Japonii.

Polskie kolekcje należące do WFCC:

1. PCM- Polska Kolekcja Mikroorganizmów (Wrocław)
2. DMVB- Państwowa Kolekcja Szczepów Oddziału Weterynarii (Puławy)
3. LOCK- Ośrodek Czystych Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych (Łódź)
4. IAFB- Kolekcja Mikroorganizmów Przemysłowych (Warszawa)
5. LCC- Laboratorium Kolekcji Kultur (Olsztyn)
6. IBA- Warszawa
7. KOS- Gdynia
8. CPPPPI- Kolekcja Patogenów Roślin (Poznań)

Rosja : 1979 rok; ochrona patentowa na szczepy
Polska: proces technologiczny może podlegać opatentowaniu ale szczep nie może.

METODY PRZECHOWYWANIA SZCZEPÓW

-

okresowe przesiewy mikroorganizmów na pożywki stałe lub płynne i przechowywanie w
40

°

C

-

skosy agarowe zalane warstwą jałowej parafiny

-

opracowana indywidualnie metoda przechowywania (suszenie, liofilizowanie, mrożenie)

Kolekcje o charakterze przemysłowym zajmują się ponadto przygotowaniem i dostarczaniem czystych
kultur do zakładów przemysłowych.

PRODUKCJA SZCZEPIONEK PRZEMYSŁOWYCH

1. Namnożenie szczepów składanych w optymalnych środowiskach hodowlanych
2. Uzyskanie dużej liczby komórek w stanie pełnej aktywności biochemicznej
3. Standaryzacja składu gatunkowego (zestawienie właściwych proporcji gatunkowych)
4. Zabezpieczenie żywotności komórek i ich właściwości biochemicznych przez odpowiednie

utrwalanie szczepionki

W1

Przemysł winiarski, browarniczy, gorzelniczy- drożdże na skosach agarowych, w pożywkach
płynnych, zagęszczane hodowle, suszone, granulowane preparaty w ochronnej polewie.

Przemysł piekarski- kultury liofilizowane lub mrożone.

Szczepionki grzybów są przygotowywane jako:

6

-

hodowle na skosach agarowych

-

hodowle na słupach przygotowanych ze świeżych skrawków roślin

-

wodna zawiesina zarodników

-

liofilizaty zarodników lub grzybni wegetatywnej

POZYSKIWANIE I DOSKONALENIE MIKROORGANIZMÓW:

Procesy biotechnologiczne prowadzone z udziałem drobnoustrojów izolowane ze środowiska
przebiegają najczęściej z wydajnością niewystarczającą opracowania ekonomicznie procesów
biotechnologicznych.

Znaczącą poprawą ich wydajności można uzyskać poprzez zmiany mataboliczno-fizjologiczne
powstałe w wyniku modyfikacji genotypu drobnoustrojów.

MUTACJE:

Warunki naturalne: mutanty spontaniczne.

Mutacje indukowane: czynniki mutagenne.

Mutacje punktowe: odwracalne, nieodwracalne (przesunięcie ramki odczytu).

Mutacje to główna droga pozyskiwania szczepów dla przemysłu.

Produkcja penicyliny: Penicylium chrysogenum (1945)

Szczepy przemysłowe, które charakteryzuje wybiórczość produkcji:
-

produkcja L-lizyny Corynebacterium glutamicum :

a. mutacja genu kodującego dehydrogenazę homoserynową (nie wytwarzają Thr)
b. zmiana charakteru kinazy asparaginowej (nie reaguje na duże stężenia L-Lys)

Hybrydyzacja:

a. hybrydyzacja naturalna: przekazanie informacji genetycznej dawcy do komórki biorcy w

wyniku fizycznego kontaktu obu komórek i polega na wymianie odcinków DNA między
chromosomami lub genoforami

b. fuzja protoplastów: do otrzymywania protoplastów stosuje się:
-

bakterie G(+)- lizozym

-

bakteria G(-)- lizozym, EDTA, warunki jonowe

-

grzyby- sok żołądkowy ślimaka Helix pomatia lub enzymy lityczne pochodzenia
drobnoustrojowego (Cytophaga, Arthrobacter, Trichoderma)

W1

Zbliżenie protoplastów, inicjacja fuzji (PEG)- rekombinacja wewnątrz i międzygatunkowa;
rekombinacja więcej niż dwóch genotypów.

Technologie rekombinacji DNA:
Technologia rekombinacji DNA polega na przenoszeniu genów z jednego organizmu do drugiego
i otrzymywaniu tzw. klonów komórek, które są zdolne do syntezy nowego białka.

Narzędzia pozwalające na wycinanie i łączenie fragmentów DNA, syntezę DNA, itp.:
-

enzymy endonukleazy restrykcyjne: rozpoznają specyficzne zazwyczaj palindronowe
sekwencje w dwuniciowym DNA i hydrolizują wiązanie fofsodiestrowe w obu niciach w
miejscu rozpoznania sekwencji lub w niewielkiej odległości od tego miejsca;

-

metylazy: towarzysza restryktazom; system chroniący komórki przed inwazją obcego DNA;

-

egzonukleazy: nukleaza S

1

(endoegzonukleaza) hydroliza jednoniciowego DNA lub RNA;

-

alkaliczna fosfataza

-

polimerazy DNA: synteza DNA

a. polimeraza I DNA- holoenzym
-

odwrotna transkryptaza

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

7

-

ligaza- łączy polinukleotydy ufosforylowane w pozycji 5’ do polinukleotydów posiadających
wolną grupę 3’-OH

-

rybonukleazy- enzymy z trzustki cielęcej

-

enzymy lityczne- lizozym, celulazy, chitynazy

Do klonowania genów i ich wprowadzania do komórek gospodarzy służą wektory.

Proces klonowania genów składa się z kilku etapów:

1. izolacja lub synteza genu (cięcia losowe DNA, synteza cDNA)
2. łączenie genu z wektorem
3. wprowadzenie rekombinowanego DNA do komórki gospodarza
4. selekcja klonów komórek zawierających zrekombinowany DNA
5. produkcyjne wykorzystanie otrzymanych klonów komórek

WYKORZYSTANIE REKOMBINOWANYCH SZCZEPÓW W BIOTECHNOLOGI:

-

hormon wzrostu- somatotropina

o

wytwarzana przez przysadkę mózgową

o

191 aa

o

niedobór- karłowatość przysadkowa

o

usunięcie sekwencji sygnałowej HGH cDNA, wprowadzenie kodonu start, miejsce
wiązania rybosomów, promotora lac- sztuczny gen

o

Escherichia coli- 2 mg/dm

3

-

insulina:

o

pochodzenia zwierzęcego mniej efektywna niż ludzka

o

aktywna insulina- 2 polipeptydy połączone mostkami siarczkowymi

o

chemiczna synteza genów odpowiedzialnych za produkcję polipeptydów,
wklonowanie do plazmidu- aktywny promotor, transkrypcja, translacja- białko
fuzyjne (zawiera fragment jednego z łańcuchów polipeptydowych)

-

czynniki krzepliwości krwi

o

czynniki VII, VIII, IX- krzepliwość krwi

o

hemofilia- brak jednego z czynników

o

produkcja z Escherichia coli

-

immunoszczepionki:

o

białka otoczkowe wirusów, białka powierzchniowe bakterii o właściwościach
antygenowych

o

wirusowe zapalenie wątroby typu B, wścieklizna, grypa

o

Lactococcus lactis z plazmidem ekspresyjnym (jadalna szczepionka p/tężcowa)

-

inne:

o

klonowana podpuszczka

o

enzymy hydrolityczne, pochodzenia mikrobiologicznego środki piorące

W2

BIOKATALIZA

Biokatalizator- podstawowe narzędzie procesu biotechnologicznego.

Najobszerniejsza klasa naturalnych substancji katalitycznych to enzymy.

CECHY ENZYMÓW:

1. Selektywność enzymów:

o

selektywność substratowa

o

stereoselektywność

o

regioselektywność

o

chemiselektywność

S E L E K T Y W N O Ś Ć S U B S T R A T O W A

Zdolność do tolerancji dużej grupy substratów (ale enzym katalizuje tylko określony typ reakcji).

8

O

R

COOH

L- KETOKWAS

R

COOH

N

H

2

H

L-AMINOKWAS

HO

2

H

2

CC

COOH

H

N

H

2

COOH

O

HO

2

CH

2

C

KWAS L-Asp

KWAS SZCZAWIOOCTOWY

grupy aminowej z donora na akceptor

przeniesienie

Substraty transaminazy:

-

2-ketoglutaran

-

β

-fluorofenylopirogronian

-

4-tiometylo-2-ketomaślan

-

fenylopirogronian

-

indylopirogronian

-

3-imidazolopirogronian

Im bardziej skomplikowany enzym tym mniej substratów toleruje.

S T E R E O S E L E K T Y W N O Ś Ć (enancjoselektywność, diastereoselektywność)

Zdolność do odróżniania pojedynczych enencjomerów lub diastereoizomerów.

W2

A. Produkcja herbicydów pochodnych kwasu fenoksypropionowego:

CH

3

CHCl

COOH

kwas R,S-

2

-chloropropionowy

R-dehydrogenaza

C

H

3

Cl

H

HOOC

kwas S,

2

- chloropropionowy

pochodne kwasu

R-fenoksypropionowego

C

H

3

OH

H

HOOC

kwas S-mlekowy

Substratem R-dehydrogenazy jest izomer R.

B. Produkcja aspartamu:

C

C

H

O

2

C

CO

2

H

+ NH

aspartaza

C

H

2

CO

2

H

N

O

2

C

kwas fumarowy L-Asp

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

9

C

H

2

CO

2

H

N

O

2

C

L-Asp

+

H

N

H

2

CO

2

CH

3

termolizyna

H

CO

2

CH

3

HN

O

N

H

2

HOOC

aspartam

40.00 ton L-Asp / rok

Biosynteza aspartamu- enzym w postaci enzymatycznej lub całej komórki, zawsze immobilizowany; 1
kg enzymu

→

10.000 kg produktu (3$/1 kg).

R E G I O S E L E K T Y W N O Ś Ć

Zdolność odróżniania grup funkcyjnych znajdujących się w różnych regionach tej samej cząsteczki.

W2

Hydroksylacja steroli:

O

O

Aspergillus niger

O

O

O

H

progestreon 1,1-alfa-hydroksyprogesteron

C H E M I S E L E K T Y W N O Ś Ć

Zdolność do rozróżniania określonych grup funkcyjnych spośród grup o podobnej lub wyższej
reaktywność.

Hydroliza nitryli:

CN

H

3

COOC

COOH

H

3

COOC

nitrylaza

2. Enzymy pracują w łagodnych warunkach- minimalizacja niepożądanych reakcji ubocznych

(dekompozycja, racemizacja, izomeryzacja).

Produkcja akrylamidu:

10

-

proces chemiczny

-

temp: 80-180

°

C

-

produkt uboczny (kwas akrylowy)

-

katalizator miedziowy (toksyczność)

C

C

CN

hydrataza nitrylowa

akrylonitryl

C

C

O

NH

2

akrylamid

3. Kataliza enzymatyczna jest „przyjazna środowisku”.
4. Przyspieszanie reakcji chemicznej o wartość 10

-9

-10

-10

W2

ZARZUTY WOBEC ENZYMÓW:

1. Działają tylko w środowisku wodnym (kłamstwo- biokataliza w układach dwufazowych i

niewodnych).

2. Cena enzymów.
3. Stabilność enzymów:

BIOKATALIZATOR

OKRES PÓŁTRWANIA

Aspartaza

6 m. – 2 l.

Fumaraza

180 dni

Deaminaza Arg

140 dni

Transaminaza

90 dni

Amidaza penicylazy

>

6 m.

Proteaza

>

60 dni

Izomeraza glukozy

>

60 dni

4. Wydajność reakcji katalizowanych przez enzymy:
-

reakcje wysokowydajne:

o

produkcja L-Asp przez immobilizowaną aspartazę

o

produkcja L-Phe przez amidazę lub transaminazę

o

produkcja L-tert-Leu przez dehydrogenazę leucynową w reaktorze membranowym

o

produkcja kwasu 2-chloropropionowego z użyciem lipaz

5. Regeneracja kofaktorów:
-

metoda regeneracji NAD

+

:

o

dodatkowa reakcja chemiczna

O

CO

2

OH

CO

2

dehydrogenaza

fenylopirogronianu

fenylopirogronian

NADH 2000 cykli NAD+

S- fenylomleczan

HOCCH

3

dehydrogenaza

alkoholowa

CH

3

CH

3

OH

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

11

W2

o

reaktor membranowy (zwiększenie masy kofaktora), np. otrzymywanie

L-tert-Leu:

(CH

3

)

2

C

CO

2

O

+ NH

dehydrogenaza Leu

(CH

3

)

2

C

N

H

2

H

CO

2

PEG-NADH 6000 cykli PEG-NAD+

CO

2

dehydrogenaza

mrowczanowa

HCOO-

o

zastosowanie całych komórek:

§ źródło węgla napędzające komórkę
§ alkohole wykorzystywane do produkcji leków benzodiazepinowych
§ 2 kg glukozy / kg produktu

O

O

CH

3

O

Z. rouxii, glukoza

O

O

CH

3

H

OH

izomer S

o

stereoselektywna redukcja 2-podstawionych-

β

-ketoestrów

R1

O

O

OEt

R

2

Cl

R1

O

O

OEt

R2

H

R. arrbizzus

ATTC 1145

OEt

O

OH

H

R2

H

NH

2

NH

2

R1

OH

H

NH

2

NH

2

R2

O

H

NH

2

R2

H

OH

H

R1

12

W2

6. Enzymy nie katalizują przemysłowo atrakcyjnych reakcji:

a. kwasy tłuszczowe
b. syropy fruktozowe
c. aspartam
d. akrylamid
e. 6-APA
f. aminokwasy
g. cyklodekstryny
h. S-2-chloropropionian

Forma katalizatora

ZALETY

WADY

prosta aparatura,
tolerancja na wysokie
stężenia substratów i
produktów

niezbędny system
regeneracji kofaktora

reakcja w roztworach
wodnych

wysoka aktywność

produkty uboczne,
substraty
nierozpuszczalne w
wodzie, ekstarkcja

reakcja w
rozpuszczalnikach
organicznych

łatwa procedura,
substraty
rozpuszczalne w
rozpuszczalnikach
organicznych, łatwe
odzyskanie enzymu

niska aktywność

ENZYMY

immobilizowane

łatwe odzyskanie
enzymu

utrata aktywności
podczas procesu
immobilizacji

brak systemów
regeneracji kofaktora

sprzęt, obróbka dużych
objętości, niższa
tolerancja na reagenty-
niższa produktywność,
niska tolerancja na
rozpuszczalniki
organiczne, reakcje
uboczne

kultury rosnące

aktywność

duża biomasa,
produkty uboczne

kultury spoczynkowe

łatwa obróbka, mniej
produktów ubocznych

niska aktywność

KOMÓRKI

immobilizowane

wielokrotność użycia

niska aktywność

W2

WYKORZYSTANIE ENZYMÓW W PRZEMYŚLE

1. Optycznie czynne:

a. D-p-hydroksymetyloglicyna (prekursor semisyntetycznych penicylin i cefalosporyn)

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

13

CHO

COOH

+

NH

2

CO

NH

2

+

OH

amidoalkilacja

N

H

CO

NH

CO

O

H

racemizacja spontaniczna

N

H

CO

NH

CO

H

O

H

D-hydantoinaza

O

H

H

NHCOSH

2

HOOC

D-karboamylaza

O

H

H

HOOC

NH

2

2. Produkcja akrylamidu.

akrylonitryl

woda

usuniecie CO

2

hydratacja

oddzielenie katalizatora

nierozpuszczalny akrylonitryl

odzyskanie katalizatora

zageszczenie

usuniecie Cu
(dekoloryzacja)

W2

proces mikrobiologiczny:

14

woda

hydratacja

oddzielenie katalizatora

dekoloryzacja

produkt

hodowla i immobilizacja mikroorganizmow

CH

2

CH

2

CH

hydrataza nitrylu

woda

CH

2

CH

2

CHNH

2

amidaza

woda

CH

2

CH

2

COOH

akrylonitryl

- Rhodococcus rhodochrous (również produkcja nikotynamidylu z 3-cyjanopirydyny)
-

H-NHaza 520 kDa- mocznik jako induktor, substraty alifatyczne

-

L-NHaza 130 kDa- cykloheksanokarboksyamid, substraty aromatyczne

-

Krotonamid- obie formy

3. Produkcja kwasu D-pantotenowego.

O

O

H

OH

O

O

OH

H

O

O

OH

O

D-P
L

L-PL

DL-PL

L-specyficzna
hydroliza

D-specyficzna
hydroliza

O

COOH

OH

H

O

COOH

H

OH

L-PA D-PA

PL- lakton pentyloway
PA- kwas pantoteinowy
DL-PD- hydroliza enzymatyczna

→

ekstrakcja

→

D-PA

→

obróbka

→

D-PL

↓

L-PL

→

obróbka

→

DL-PL

-

suszona mycelia Fusarium oxysporum

-

70% roztwór form L i D PL w pH 7 przez 20 h izomer D jest całkowicie hydrolizowany

W2

4. Produkcja hydroksyproliny.
-

trans-4-hydroksy-Pro

-

hydriksylacja Pro (8 izomerów)

-

hydroksylaza z Dactylosporangium sp. (RHI-trans-4-hydroksy-1-Pro)

-

hydrolaza z Streptomyces sp. (TH2-cis-3-hydroksy-1-Pro)

-

dioksygenazy, askorbinian

SPOSOBY ZASTOSOWANIA ENZYMÓW W R. CHEMICZNYCH

1. Typowe reakcje w roztworach wodnych.
2. Enzymy immobilizowane.
3. Reakcje w układach dwufazowych.
4. Reakcje w rozpuszczalnikach organicznych.

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

15

ENZYMY W ROZPUSZCZALNIKACH ORGANICZNYCH

Zastosowanie układów niewodnych:
-

umożliwia rozpuszczanie hydrofobowych substratów

-

przesuwa równowagę reakcji w stronę reakcji syntezy a nie hydrolizy (synteza estrów,
peptydów, laktonów)

-

daje możliwość uniknięcia niepożądanych reakcji ubocznych zachodzących w obecności
wody

-

daje możliwość uniknięcia procesu immobilizacji (łatwy odzyski nierozpuszczalnych w
rozpuszczalnikach organicznych enzymów

-

w przypadku, gdy immobilizacja jest niezbędna wystarczy immobilizacja na porowatych
powierzchniach

-

łatwy odzysk produktu

-

wzrost termostabilności enzymów

-

obniżone ryzyko zakażenia mikrobiologicznego

Badania zastosowania enzymów w roztworach organicznych rozwijały się w kilku etapach:
-

woda / rozpuszczalnik organiczny mieszający się z wodą

-

układy dwufazowe

-

środowisko niewodne

Woda jest niezbędna enzymom do przyjęcia odpowiedniej konformacji.

Enzym musi być otoczony molekularną cząsteczka wodą.

PROBLEM pH
Enzymy liofilizowane bądź wytrącone z roztworów o pH optymalnym- dla ich aktywności „pamięć
pH” (najlepiej liofilizować ze środowiska o pH optymalnym, bo to pH enzym „zapamięta”).

W rozpuszczalnikach organicznych nie da się zmierzyć pH- enzym będzie w takim stanie w jakim był
liofilizowany (grupy jednogenne enzymu odpowiedzą na to w jakim są środowisku).

W2

P R Z Y G O T O W A N I E B I O K A T A L I Z A T O R A

-

modyfikacja kowalencyjna, np. przyłączenie PEG

-

modyfikacja niekowalencyjna:

o

„the ion pairing” (parowanie jonów)- niezbędne niskie stężenie surfaktantu

o

liofilizacja z roztworów wodnych w obecności:

§ soli nieorganicznych (KCl), np. subtylizyna Carlsberga była liofilizowana w

obecności KCl, uzyskano enzym, którego aktywność w heksanie była 4000
razy wyższa

§ związków organicznych (etery koronowe, cyklodekstryny)
§ substratów- zmiany w specyficzności substratowej („molecular imprinting”-

analog stanu przejściowego jest zmieniony tak, że uzyskuje aktywność
kataliyczną)

W P Ł Y W R O Z P U S Z C Z A L N I K A N A P R O C E S B I O K A T A L I Z Y

-

bezpośredni wpływ na enzym- obniżenie aktywności katalitycznej lub stabilności

-

oddziaływanie na reagenty

-

oddziaływanie na warstwę molekularną otaczającą enzym

J A K W Y B R A Ć R O Z P U S Z C Z A L N I K?

1. Kompatybilność rozpuszczalnika z planowaną reakcją:
-

np. modyfikacja cukrów- cukry rozpuszczają się w hydrofilowych, mieszalnych z wodą
rozpuszczalnikach; zastosowanie rozpuszczalnika niepolarnego jest niekorzystne ponieważ nie
dojdzie do kotaktu pomiedzy substratem a enzymem

16

-

np. oksydaza polifenolowa- w heksanie podane produkty (chinony) dążą do pozostania blisko
enzymu (utrata aktywności, reakcje uboczne); zamiast heksanu stosue się chloroform.

2. Rozpuszczalnik musi być obojętny dla reakcji:
-

reakcja transestryfikacji- zastosowanie rozpuszczalnika o charakterze cukru lub alkoholu-
estry rozpuszczalnikowe

Miarą hydrofobowości rozpuszczalnika jest log P (P- współczynnik podziału pomiędzy etanol a
wodę).
log P wysoki- rozpuszczalniki niepolarne (proszki enzymatyczne)
log P niski- rozpuszczalniki polarne

R E A K C J E E N Z Y M A T Y C Z N E Z A C H O D Z Ą C E W
R O Z P U S Z C Z A L N I K A C H O R G A N I C Z N Y C H:

a. utlenianie steroidów- sterole charakteryzują się niską rozpuszczalnością w H

2

O;

Nocardia rodocrous; 3-

β

-hydroksy-

δ

5

-steroid

→

3-keto-

δ

4

-steroid, np.: utlenianie

cholesterolu do cholestenonu (heksan:benzen 1:1)

b. reakcja epoksydacji i hydroksylacji

W2

c. reakcja katalizowanaprzez dehydrogenazę alkoholową, np. HLADH (wątroba

końska); optycznie czynne alkohole, ketony; enzym immobilizowany na szklanych
kulkach, eter izopropylowy, racemiczny alkohol lub keton, regeneracja kofaktora-
aldehyd izomasłowy

d. polimeryzacja fenoli
e. depolimeryzacja lignin
f. synteza estrów- lipazy jako proszki enzymatyczne lub całe komórki, estryfikacja

kwasów tłuszczowych;

i. wysuszone mycelia Rhizopus arrhizus w mieszaninie oktanolu + kwasu

olejowego + sita molekularne (wiążą wodę ze środowiska)

ii. reakcja interestryfikacji (wymiana grup acylowych) ważna komercyjnie;

produkcja masła kakaowego, niskotopliwe margaryny (topią się już w 30

°

C)

iii. lipaza z Rhizopus nivens- przekształcanie POP (pochodna glicerolu) przy

udziale stearynianu w mieszaninę związków, które są skałdnikami masła
kakowego; modyfikacja triglicerydów wykorzystywana do otrzymywania
niskotopliwych margaryn

g. synteza peptydów- udział wody 50% lub układ niewodny; hydrofobowe pochodne

aminokwasów

i. chymotrypsyna immobilizowana na Sepharose

ii. ester N-acetylo-L-Phe-o-metylowy + amid Ala (Gly) w butanodiolu (10%

wody)

iii. chymotrypsyna immobilizowana na chitynie katalizuje syntezę

HOOC-Tyr-Gly-NH

2

95% acetonitrylu

h. rozdział mieszanin recemicznych- lipaza ze szczepu Candida cylindracea

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

17

OH

(+) mentol

lipaza
C. cylindracea

OCO(CH

2

)

10

CH

+

CH

3

(CH

2

)

10

COOH

(-)

W przemyśle rozdział mieszaniny racemicznej kwasów 2-halogenokarboksylowych (2-
chloro i 2-bromopropionian) przy pomocy butanolu, w heksanie.

Rozdział racemicznych alkoholi przy pomocy świńskiej lipazy trzustkowej, otrzymuje się
2-oktanol, 2-dodekanol, transestryfikacja z trichloroetylomaślanem (izomer R reaguje
dając czysty R-ester, izomer S wydzielony)

W2

PERSPEKTYWY BIOKATLIZY

1. Dostosowanie biokatalitycznej cząsteczki do procesu:

-

poszukiwanie nowych biokatalizatorów pochodzących z ekstremofili

-

wprowadzanie zmian w molekularnej strukturze biokatalizatora (modyfikacje chemiczne,
mutacje punktowe, ukierunkowana molekularna ewolucja in vivo)

-

odpowiednia postać biokatalizatora

-

inżynieria warunków fizycznych procesu

-

inżynieria środowiska reakcji (środowisko niewodne, dwufazowe, ciecz nadkrytyczna)

2. Katalityczne biocząsteczki:

-

rybozymy (RNA-zymy)- niektóre domeny natywnych cząsteczek RNA o właściwościach
katalitycznych, opisane na poczatku lat 90

-

deoksyrybozymy (DNA-zymy)- katalityczne DNA znalezione w kombinatoryjnych
bibliotekach fragmentów jednoniciowych syntezowanych chemicznie i wyselekcjonowanych
za pomocą metody Selex

-

abzymy- p/ciała katalityczne; immunizacja zwierząt doświadczalnych przy pomocy analogu
stanu przejściowego jakiegoś substartu (p/ciała katalityczne); droga produkcja, około 100
różnych reakcji (hydroliza, kondensacja, inne)

W3

ABZYMY (dodatkowo seminarium)

Są to katalityczne przeciwciała występujące w naturze.

-

mleko kobiet karmiących- abzymy o aktywności kinazy białkowej, rybonukleazy,
deoksyrybonukleazy,

α

-amylazy.

-

mikrozymy

-

masy molowe niższe niż 10 kDa

-

najmniejszy opisany enzym to mikroesteraza z Bacillus stearothermophilus

(problemy z procedurą izolacji i oczyszczania)

18

-

mikroesteraza z Candida lipolytica (5,7 kDa)

-

mikroproteaza z termofilnego szczepu Actinomyces sp.

-

mikrozym z archeabakterii Sulfolubus sulfataricus

-

metaloproteinaza z Grant Kurthia spirofornie (alkalofilna, termostabilna)

-

mikroesterazy z termofilnych grzybów (1530-5257 kDa)

Mikrozymy są alternatywą dla rybozymów i abzymów.

Jaka jest różnica między ekstermofilami a ekstremozymami? (EGZAMIN)

EKSTREMOZYMY

Enzymy pochodzące z mikroorganizmów ekstremofilnych.

Termofile : T

opt

>

45

°

C

-

hipertermofile : T

opt

>

85

°

C

-

psychrofile : T

min

<

0

°

C

-

acidofile : pH

<

2

-

alkalofile : pH

>

10

-

barofile : p

>

1 atm

-

halofile : NaCl 4-5 M

-

metalofile : odpowiednie metale ciężkie

-

mikroaerofile : O

2

<

21%

-

enetektofile : mikroorganizmy żyjące w eutektycznej warstwie lodu (lód typu 4)

Badania zaawansowane prowadzone są na termozymach.

Komercyjny sukces: fag polimerazy z Thermus agnaticus (Pyrococcus furiosus):
termofilne amylazy, ksylanazy, proteazy (produkcja glukozy i fruktozy ze skrobi, bielenie mas
papierniczych, browarnictwo, detergenty piorące).

Etap wdrażania:
-

pullulanaza z Thermococcus aggregans

-

hydrataza nitrylowa z Bacillus pallidens

W3

-

termoacydofilna esteraza z Bacillus acidocaldavirus

-

termostabilne lipazy z Bacillus thermocatemulants

Badane psychrofile:
-

lipaza z Candida autarctica

-

antarktyczna mletylizyna z TA41 (muteina 3G7-3 cykle ukierunkowanej ewolucji

in vitro, wymiana 7 aminokwasów, 500-krotny wzrost termostabilności w 60

°

C, przesunięcie

T

top

)- detergenty piorące

-

psychrofilne oksydorektuazy- biosensory, bioremedacja skażonych ropopochodnymi
związkami środowisk

-

lipazy i esterazy w środowiskach niewodnych (gęstość cząsteczki)

-

glikozydaza - w niskotemperaturowych roztworach hydrolizy (hydroliza laktozy w mleku i
ściekach o dużej zawartości serwatki

Enzymy eutektofili- badanie metagenomu („środowiskowe DNA”).

Ukierunkowana ewolucja enzymów in vitro

-

opiera się na wykreowaniu dużej liczby wariantów wyjściowego białka katalitycznego i
znalezienie wśród nich docelowego ulepszonego enzymu;

-

stworzenie biblioteki wariantów genu enzymów (10

8

– 10

12

wariantów) i sprawdzenie czy

każdy wariant ulega ekspresji;

a. Tworzenie biblioteki genów:
-

metody nierekombinacyjne

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

19

o

Ep-PCR (error-prone PCR)

o

mutacje chemiczne wyjściowego DNA

o

techniki inżynierii białkowej (ukierunkowane punktowe mutacje, mutacje poprzez
nasycenie punktowe)

o

pasaże genów przez mutatorowe szczepy Escherichia coli

-

metody rekombinacyjne

o

„tasowanie genów” (DNA shuffling)

o

STEP (Stagered Extention Process)

o

RACHITT (Random Chimera Genesis On Transient Template)

b. Wiązanie genotypu z fenotypem:
-

ekspozycja na fagu (białko fuzyjne z białkiem płaszcza wirusa)

-

ekspozycja na powierzchni komórki drożdżowej (2002 r.)

-

ekspozycja na rybosomie (rybosom – m-RNA – białko = kompleks)

-

ekspozycja na m-RNA

-

kompertmentacja in vitro (jeden gen w kropelce wody; inertny)

c. Sortowanie biblioteki wariantów zmutowanego genu fizycznie związanego z enzymem jako

produktem jego ekspresji

-

selekcja (ważna)

-

skrining wysokorpzepustowy

o

QUEST (obecny polimeryczne aktywator transkrypcji)

o

FAS (pomiar fluorescencji klonów zawierających różne warianty genów enzymu)

d. Dotychczasowe osiągnięcia DE:
-

zmieniona peroksydaza cytochromowu C

W3

-

Escherichia coli

β

- galaktozydaza

→

β

- glukozydaza

-

lipaza Staphylococcus aureus

→

fosfolipaza

-

dehydrogenaza 3-izopropylojabłczan (zwiększenie aktywności)

-

fragment DNA (biblioteka genów hipertemofilnego Pyrococcus furiosus)

o

aktywność

β

-laktamazy

-

inżynierowanie szlakami metabolicznymi (biosynteza karotenoidów)

-

modyfikacje DE (3-indolo-glicerol)

o

izomeraza fosforybozylo antranilanu

Nowe postacie preparatów enzymów

-

biokatalityczny plastik złoża do bioreaktorów

-

enzymy zamykane w hybrydowych kompozytach organiczno- nieorganicznych

-

biokatalizator zamykany w sieci polimeru wraz z cząsteczkami magnetytu (złoża do reaktorów
fluidalnych)

-

sieciowanie kryształów enzymów (CLESs)

-

usieciowane agregaty białek enzymatycznych (CLEAs)

Inżynierowanie środowiskiem reakcji

-

ciecze jonowe- sole występujące w temperaturze otoczenia w stanie ciekłym (ciekłe w
temperaturze T

>

300

°

C, rozpuszczają się w nich różne związki, organiczne i nieorganiczne

polimery; wysoka polarność, znikome ciśnienie par, doskonała kwasowość Lewisa Bronsteda,
recykling) stosowane w laboratorium w procesach transestryfikacji, alkoholizy, amonolizy,
rozdziale racematów P-chiralnych hydroksymetanofosfonatów, syntezie aspartamu (przy
udziale termolizyny)

-

rozpuszczalniki nadfluoranowe

Biokataliza i biosynteza kombinatoryjna

-

biokataliza kombinatoryjna jest techniką stosowaną w celu stworzenia bibliotek produktów
naturalnych lub syntetycznych

o

lipaza z Candida antarctica (biblioteka 24 estrów; 4 alkohole + 6 estrów)

-

biosynteza kombinatoryjna to przetwarzanie lub inżynierowanie naturalnymi szlakami
metabolicznymi aby otrzymać analogi produktów naturalnych

20

o

nowe makrolidy- manipulacje na poziomie syntezy poliketydylowej

o

karotenoidy

ANTYBIOTYKI

1928 r. – początek ery antybiotyków
1942 r. – definicje antybiotyków S.A.Waksman „... antybiotyki są to substancje chemiczne
wytwarzane przez mikroorganizmy i mające w dużych rozcieńczeniach zdolność zabijania lub
hamowania wzrostu innych drobnoustrojów...”

W3

DEFINICJA WSPÓŁCZESNA

Makrocząsteczkowe substancje naturalne, najczęściej pochodzenia drobnoustrojowego lub ich
półsyntetyczne modyfikacje albo syntetyczne analogi, które w małym stężeniu działają wybiórczo
na struktury i procesy biologiczne hamujące wzrost lub rozmnażanie komórek.

PODZIAŁ ZE WZGLĘDU NA BUDOWĘ CHEMICZNĄ

-

pochodne aminokwasów, np.:

o

β

-laktamy

o

antybiotyki polipeptydowe

o

antybiotyki glikopeptydowe

o

antybiotyki lipopeptydowe

-

pochodne cukrów, np.:

o

aminoglikozydy

o

glikolipidy

-

antybiotyki makrocykliczne

-

chinony i ich pochodne, np.:

o

antracykliny

-

inne (pochodne cykloalkanów, nukleozydy, polietery aromatyczne, fosfoniany, steroidy)

PODZIAŁ ZE WZGLĘDU NA WŁAŚCIWOŚCI BAKTERIOBÓJCZE I

BAKTERIOSTATYCZNE

Antybiotyki

β-laktamowe – penicyliny

TYP PENICYLINY

ŁAŃCUCH BOCZNY

PREKURSOR

benzylowa (penicylina G)

CH

2

CO

kwas fenylooctowy

hydroksybenzylowa (X)

CH

2

O

H

CO

kwas hydroksyfenylooctowy

pentylowa (F)

CO

kwas 3-heksynowy

fenoksymetylowa (V)

O

CH

2

CO

kwas fenoksyoctowy

n-heptylowa (K)

CO

kwas karpylowy

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

21

Penicylina G - pierwszy naturalny antybiotyk

β

-laktamowy o bardzo dobrej aktywności wobec

ziarenkowców, Gram (+), wywiera działanie bakteriobójcze; nie jest stabilna w roztworach
wodnych, więc nie może być podawana doustnie.

W3

Penicylina V- podobne spectrum aktywności- nieaktywna w stosunku do gronkowców; podawana
doustnie.

AKTYWNOŚĆ:

Penicyliny degradowane są przez

β

-laktamazy.

Inhibitory

β

-laktamaz: kwas klawulanowy, sublaktam, tiazolaktam.

JAK DZIAŁA PENICYLINA?

Blokuje ostatni etap biosyntezy bakteryjnej ściany komórkowej (tworzenie poprzecznych wiązań
pomiędzy różnymi łańcuchami peptydoglikanu). Jej bezpośrednim celem jest transpeptydaza
glikopeptydowa (mimikra molekularna).

PROCES PRODUKCJI PENICYLIN:

1. Liofilizowane spory szczepu produkcyjnego.
2. Hodowle na skosach agarowych.
3. Kultury wegetatywne w kolbach stożkowych.
4. Namnażanie biomasy.
5. Właściwy proces syntezy (dozowanie odpowiednich składników i prekursorów,

izolacja, oczyszczanie).

PROCES BIOSYNTEZY PENICYLIN (II fazy):

I.

trofofaza- namnażanie grzybni (30-40 h), szybka asymilacja składników
podłoża, temperatura 27-24

°

C;

II.

idiofaza- właściwa faza produkcji

WYODRĘBNIANIE PRODUKTU I OCZYSZCZANIE:

A. oddzielenie grzybni od płynu pohodowlanego, filtracja;
B. ekstrakcja rozpuszczalnikami w układzie ciecz-ciecz;
C. chromatografia kolumnowa (węgiel aktywny);
D. krystalizacja, suszenie i inne czynności prowadzące do otrzymania

farmaceutyku

Penicyliny semisyntetyczne

Penicyliny półsyntetyczne zostały wprowadzone do lecznictwa pod koniec lat 50. Niektóre z nich
mają wąski zakres działania, np.:
-

p/gronkowcowe (Oksacylina, Kloksacylina, Metycylina, Nafcylina)

-

szeroki zakres (Ampicylina, Amoksycylina, Piperacylina)

Najbardziej znanym antybiotykiem tej grupy jest Ampicylina, która jako pierwsza była
wprowadzona do lecznictwa. Następcą Ampicyliny jest Amoksycylin, która wykazuje znacznie
lepszą aktywność i korzystniejsze właściwości farmakokinetyczne.

W3

W ostatnich latach pojawiły się skuteczne preparaty, łączące penicylinę półsyntetyczną z
inhibitorem

β

-laktamaz.

Penicylina G

1667 mg

-1

Penicylina V

1595 mg

-1

22

Połączenie to rozszerza zakres działania penicylin na bakterie wytwarzające

β

-laktamazy.

Przykładem takich połączonych leków jest amoksycylina z kwasem klawulanowym, ampicylina z
sublaktamem czy piperocylina z tazolaktamem.

N

S

O

CH

3

CH

3

COOH

N

C

R

H

O

acylaza, H

2

O

N

S

O

CH

3

CH

3

COOH

2

HN

6APA

metody chemiczne

S

CH

3

CH

3

COOH

O

N

N

RCO

RCO

diacylopenicylina

penicylina G (V)

Jak się otrzymuje semisyntetyczne penicyliny? (E)

NOWE ANTYBIOTYKI

β-LAKTAMOWE

Thienamycyna- Streptomyces cattleya szerokie spektrum działania (Gram +, Gram -); odporny na
działanie

β

-laktamaz.

COOH

O

N

SCH

2

CH

2

NH

2

H

H

O

H

3

HC

Kwas klawulanowy- Strepotmyces sp.; inhibitor

β

-laktamaz.

Epithienamycyny (kwas oliwanowy) Streptomyces olivaceus; aktywne wobec Gram (-);
inhibitory

β

-laktamaz.

W3

Nocardicyny- Nocardia sp.; monocykliczne

β

-laktamy, np.:

-

nocardicyna A (aktywna przeciwko Gram - , nietoksyczna, stabilna w roztworach wodnych,
odporna na

β

-laktamazy)

Cefalosporyny

Wzory strukturalne penicylin, Thienamycyny (E).

Antybiotyki aminoglikozydowe

Aminocukier + aminocyklitol

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

23

Produkty naturalne : Streptomycyna, Neomycyna, Kanamycyna, Gentamycyna
Produkty semisyntetyczne: Dibekacyna, Amikacyna

PODZIAŁ ANTYBIOTYKÓW AMINOGLIKOZYDOWYCH

-

aminocyklitol jest pochodną streptaminy- streptomycyna

-

aminocyklitol jest pochodną

Bardzo silne antybiotyki. Szerokie spektrum działania- działanie bakteriobójcze. Aktywne przeciw
Escherichia coli, Klebsiella sp, Proteus sp, Enterobacter enterococcus, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus. Nieaktywne wobec Streptococcus sp., bakterii beztlenowych, grzybów,
wirusów i pierwotniaków. Odporność na te antybiotyki powstaje powoli wśród bakterii

MECHANIZM DZIAŁANIA

Działają na poziomie biosyntezy białka – rybosom 70S.

Streptomycyna- podjednostka 30S, wiązanie terminalnego RNA z rybosomami (inicjacja biosyntezy
białka), błędna odczytanie m-RNA .

Gentamycyna, Neomycyna, Kanamycyna- dezorganizacja miejsca dekodowania, blokada splicingu
autokatalitycznego grupy I intronów.

TOKSYCZNOŚĆ: narządy słuchu, nerki.

Oporność na antybiotyki aminoglikozydowe może być spowodowana:

-

zmianami w przepuszczalności błony komórkowej

-

mutacjami 30S

-

enzymami modyfikującymi antybiotyki

W4

STREPTOMYCYNY

Rodzina antybiotyków:

-

Streptomycyna

-

Mannozylostreptomycyna

-

Dihydrostreptomycyna

-

Mannozylodihydrostreptomycyna

-

N-demetylostreptomycyna

-

Hydroksystreptomycyna

PROCES WYTWARZANIA STREPTOMYCYNY:

1967 r. –Singh et all opis procesu laboratoryjnego

-

Streptomyces griseus DTH

2

– liofilizowane spory zmieszane z ziemią zostają umieszczone na

płytkach Petriego lub butelkach Rouxa z agarem sojowym, inkubacja 2-3 tyg, w temp. 27

°

C

-

inokulum

o

I etap: kultury wegetatywne; 0,5-2 l kolby Erlenmayera, sojowe podłoże A

o

II etap: fermentator 5 l, sojowe podłoże B

-

proces właściwy- fermentator produkcyjny, podłoże B, pH 7-6,5-7,5, mieszanie,
napowietrzanie (trofofaza, idiofaza)

-

oczyszczanie:

o

zawiesina pohodowlana

o

filtracja lub odwirowanie – przesącz (50 m

3

, 5,5 g/cm)

o

+ 50 m

3

H

2

O

o

chromatografia jonowymienna

o

wymywanie związku EDTA, woda nasycona CO

2

, 2,5 M H

2

SO

4

o

wodny roztwór siarczanu streptomycyny (2700 l, 90 g/cm)

o

dekoloryzacja na węglu aktywnym

o

zagęszczanie pod próżnią

24

o

suszenie

o

275 kg siarczanu streptomycyny 98% czystości

POSZUKIWANIE NOWYCH AMINOGLIKOZYDÓW

-

skrining + inżynieria genetyczna

-

mutageneza

-

modyfikacje chemiczne lub enzymatyczne

-

synteza chemiczna

CEFALOSPORYNY

Antybiotyki

β

-laktamowe produkowane przez Cephalosporium (grzyb). Mechanizm działania

analogiczny do penicylin (hamuje syntezę białka...). Poszczególne generacje cefalosporyn różnią
się przenikalnością do OUN i odpornością w stosunku do

β

-laktamaz.

Proces wytwarzania FBC (Feed Batch Culture). W lecznictwie stosuje się ponad 50 cefalosporyn.

W4

N

S

COOH

O

CH

2

OCOCH

3

N

S

COOH

O

N

H

2

CH

2

OCOCH

3

H

2

NCHCOOH(CH

2

)

3

CCOHN

cefalosporyna

ACA

CEFAMYCYNY

N

S

O

COOH

CH

2

OCOCH

3

H

2

NCHCOOH(CH

2

)

3

COHN

OMe

Cefamycyna C- Nocardia lactamdurans, Streptomyces clavuligerus; trwałe

Gram (-)- oporne na

β

-laktamazy

Cefoksytyna- zmodyfikowana cefamycyna (grupa tienacetylowa).


LINKOZAMIDY

Linkomycyna- Streptomyces lincolnensis, metylotioaminocukier + aminokwas, Gram (+)
(Staphylococcus sp., Diplococcus sp. ) oraz beztlenowce; dobra przenikalność do tkanek i kości;
działanie- hamowanie biosyntezy białka 50S.


ANTYBIOTYKI PEPTYDOWE

Blastycydyna S- Pyricularia oryzae, Streptomyces sp., rolnictwo

Bleomycyna, Bestatyna – terapia p/nowotworowa

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

25

-

Bleomycyna- hamowanie syntezy białek kwasów nukleinowych

-

Bestatyna- hamuje aminopeptydazy

ZWIĄZKI P/NOWOTWOROWE

Rośliny, mikroorganizmy, ssacze kultury tkankowe. Trudności przy procesie produkcji:
toksyczność, wydzielanie, oczyszczanie; detoksyfikacja ścieków.

W4

1. Poszukiwanie i izolacja odpowiednich produktów- izolacja produktu.
2. Preskrining – linie P388 mysiej leukemii.
3. Testy in vitro sposób podania leku.
4. I faza badań klinicznych.
5. II faza badań klinicznych.
6. III i IV faza badań klinicznych.

Bezpieczeństwo przy produkcji leków cytotoksycznych- bariery biologiczne, filtry HEPA,
czujniki, blokady, detoksyfikacja ścieków.

ANTRACYKLINY

Należą do najszerzej używanych związków p/nowotworowych.
Budowa: chromofor antrachinowy podstawiony jednym lub więcej cukrem.

Dannorubicyna (Daunomycyna)- Streptomyces coeruleorubidus
Doksorubicyna (Adriamycyna)- mutant; Streptomyces peucetius; szerokie spektrum działania

PROCES PRODUKCJI DAUNOMYCYNY

Streptomyces peucetius, glikozyd, 60-70

µ

g/ml daunomycyny, 5-15

µ

g/ml adriamycyny.

METODA I:
Skosy agarowe (10 dni, 26-27

°

C), kultury w kolbach (2 dni, mieszanie, napowietrzanie), 800 l

fermentator (28

°

C, 67 h).

METODA II:
Kultury w 4 l kolbach (zamrożone mycelia, 28

°

C, 2,5 dnia), 100 l fermentator (30

°

C, 24h), 1000 l

fermentator (12 dni), 10000 l fermentator (7-10 dni).

PROCES PRODUKCJI ADRIAMYCYNY

Agarowe skosy (26-27

°

C, 10 dni), homogenizacja zaszczepu i zawieszenie w wodzie, kultury w

kolbach (48 h), wytrząsanie (28

°

C), 800 l fermentator (27

°

C, 67-145

°

C).

ANTYBIOTYKI NUKLEOZYDOWE

Najsilniejsze czynniki cytotoksyczne, hamują biosyntezę kwasów nukleinowych i białek, wykazują
aktywność antybiotyczną, antywirusową, immunosupresyjną.

Produkcja: Streptomyces sp., Nocardia sp.

Enzymy cytotoksyczne:
L-asparaginaza- hamuje asparaginozależną biosyntezę białka i ewentualnie kwasów nukleinowych;
limfocytowa leukemia u dzieci.

W4

CO JESZCZE BIOTECHNOLOGIA DAJE MEDYCYNIE?

26

PRZECIWCIAŁA MONOKLONALNE

-

diagnostyka, terapia chorób zakaźnych

-

badanie właściwości antygenowych białek

-

charakterystyka wirusów

-

transplantacja organów

KONIUGATY PRZECIWCIAŁO-LEK

-

indukowane wirusem komórki nowotworowe (limfoma myszy)

-

produkcja przeciwciał kozich (infekcja co 5 dni)

-

surowica- wysalanie 33% siarczanem amonu

-

frakcje immunoglobulin- odwirowanie, rozpuszczenie w buforze

-

trawienie pepsyną, 0,1 M octan sodu, pH 4,5, 16 h, 37

°

C

-

fragmenty (Fab)

2

-

lek w postaci utlenionej, kowalencyjne wiązanie typu zasady Schiffa

-

redukcja i stabilizacja wiązania p/ciało-lek (HBr)

-

gotowy koniugat (2-10 moli leku / 1 mol p/ciała)

SIDEROFORY

Makroelementy – fosfor, wapń, magnez, potas, sód, żelazo.

Fe

3+

- warunki tlenowe Fe

2+

- warunki

beztlenowe

Rola żelaza w organizmach żywych (mikroorganizmy)

Skład komórki

niedobór żelaza powoduje zahamowanie wzrostu, zmniejszenie
syntezy kwasów nukleinowych, hamowanie sporulacji, zmiany
morfologii komórki

Metabolizm

procesy wymagające żelaza: CKT, transport elektronów, fosforylacja
oksydacyjna, wiązanie azotu, biosynteza aminokwasów
aromatycznych, fotosynteza

Produkty metabolizmu

biosynteza porfiryn, toksyn, witamin, antybiotyków, pigmentów,
kwasów nukleinowych (regulowane żelazem)

Białka i enzymy wymagające
żelaza

peroksydazy, dysmutazy nadtlenkowe, nitrogenazy, hydrogenazy
syntaza glutaminy, cytochromy, ferrodoksyna, flawoproteiny

Mikroorganizmy wykształciły specjalne mechanizmy umożliwiające pobieranie żelaza ze środowiska.

zewnątrz błona komórkowa wewnątrz

enterobaktyna



←



enterobaktyna (synteza de novo)

↓

Fe

3+

↓

Fe

2+

ferri-enterobaktyna



→



produkty hydrolizy

rozpuszczanie



transport



asymilacja

W4

CECHY SIDEROFORÓW

-

substancje niskocząsteczkowe (względna masa cząsteczkowa mniejsza 1500)

-

rozpuszczalne w wodzie

-

wiążą żelazo z wysoką swoistością i powinowactwem (stała stabilność 10

30

)

-

związki fenolowe lub hydroksomaty

enterobaktyna- bakteria jelitowe
ferichromy- grzyby
ferrioksoamina- promieniowce
egzochelina- bakteria śluzowe

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

27

Drobnoustroje wytwarzają siderofory zazwyczaj wtedy, gdy nikła dostępność żelaza ogranicza ich
wzrost. Siderofory mogą posiadać aktywność antybiotyczną: sideromycyna, albomycyna, ferrimycyna.
Produkcja przemysłowa sideroforów jest trudna. Siderofor produkowany na skalę przemysłową:
deksterioksamina (Desferal) produkowany przez Streptomyces pilosus.

WYKORZYSTANIE SIDEROFORÓW

-

zatrucia żelazem- terapia chelatowa (cechy dobrego chelatora: łatwość produkcji,
efektywność, specyficzność, toksyczność, dostęp do puli);

-

hemochromatoza

-

usuwanie toksycznych metali z organizmu

-

zastosowanie pozamedyczne: rolnictwo (Pseudomonas putida- pseudobaktyna; Rhizobium)

FERMENTACJA STEROLI

Steran- 4-pierścieniowy system cyklopentanoperhydrofenantrenu.

Hormony sterydowe – ważna funkcja metaboliczna.

Przemysł – leki.

STERAN

O

H

CHOLESTEROL

wypchnięte przez analogi półsyntetyczne

W4

Analogi półsyntetyczne:

-

diosgenina (Discorea mexicana, Discorea composita)

-

stygmasterol

-

β

- i

γ

- sitosterole (nasiona soi, bawełny i trzciny cukrowej)

O

H

O

O

CH

3

DIOSGENINA

28

O

H

SITOSTEROL

SITOSTEROL

HO

W4

O

H

STYGMASTEROL

MIKROBIOLOGICZNA KONWERSJA STEROLI OBEJMUJE:

-

dehydrogenację

-

epoksydację

-

estryfikację

-

izomeryzacje

-

hydrolizę acetali

-

hydrolizę estrów

-

hydrolizę epoksydów

-

hydroksylację

-

utlenianie alkoholi i ketonów

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

29

-

redukcja ketonów i podwójnych wiązań

REAKCJE O ZNACZENIU PRZEMYSŁOWYM

1. Hydroksylowanie w pozycji 11

α

i 11

β

, np. hydroksylowanie progesteronu w pozycji 11

α

O

O

PROGESTERON

O

O

HYDROKSYPROGESTERON

produkty uboczne: 6-

α

-, 11-

β

-dihydroksyprogesteron

Rhizopus arrhizus, Rhizopus nigricans, Aspergillus ochraceus

W4

O

OH

O

H

ZWIAZEK S

Currularia lunata, Cunninghamella blakestleeana

MECHANIZM REAKCJI HYDROKSYLOWANIA- polega na wprowadzeniu jednego atomu tlenu
cząsteczkowego do substratu przy udziale specyficznych oksygenaz i redukcji drugiego do H

2

O.

steroid steroid OH

enzym-FeO

2+

enzym - Fe

2+

NADP

+

NADPH + H

+

H

2

O O

2

2. Dehydrogenacja w pozycji

∆

1

Arthrobacter simplex, Bacillus sphaericus, Nocardia restricus, Septomyxa affinis, Fusarium solani

30

W4

3. hydroksylowanie w pozycji 16-

α

.

O

OH

O

H

O

F

OH

fluorohydrokortyzon

O

OH

O

H

O

F

OH

OH

hydroksy- -fluoro- -metylohydrokortyzon

Streptomyces argenteolus

4. Modyfikacje łańcuchów bocznych.

Nocardia sp., Streptomyces sp., Arthrobacter sp., Mycobacterium sp.

Grupa ketonowa (C-17) oraz grupa karboksylowa (C-20).

PROCES FERMENTACJI STEROIDÓW

Produkty o znaczeniu komercyjnym:
-

kortyzon

-

hydrokortyzon

-

testosteron

-

testolakton

-

flokortolon

-

preolnizon

-

preolnizolon

BIOTECHNOLOGIA SZTUCZNYCH KOMÓREK

Błony komórki sztucznej:

-

półprzepuszczalna

-

grubość 0,002

µ

m – 1,8 nm

-

uzyskuje się w procesie emulsyfikacji a następnie polimeryzacji międzyfazowej (silastik,
octan celulozy, nylon polietyloaminowy, materiały biodegradowalne).

Zamykanie systemów enzymatycznych wymagających systemu regeneracji kofaktora:

-

heksokinaza i kinaza pirogronianowa (regeneracja ATP)

o

glukoza

→

glukozo-6P

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

31

o

fosfoenolopirogronian

→

pirogronian

-

dehydrogenaza alkoholowa i dehydrogenaza jabłczanowa (NAD

+

→

NADH)

-

ureaza, dehydrogenaza glutaminianowa, dehydrogenaza glukozo-6P (mocznik

→

amoniak

→

α

-ketoglutaran)

W4

Sztuczne komórki zawierające komórki biologiczne i inny materiał biologiczny:

-

sztuczne organy

o

powierzchnia wymiany 33 ml śr 0,1 mm

→

2 m

2

o

przepuszczalność 0,002

µ

m

→

20

µ

m

-

detoksyfikatory krwi

-

sztuczna wątroba

-

sztuczna nerka

-

substytuty krwi

NOWE TRENDY BIOTECHNOLOGII DLA MEDYCYNY

-

1990 r.- Humane Genome Project USA

-

Functional Genomics, FunctIonal Proteomics

-

technologia rekombinacji DNA

-

inżynieria białka – wykorzystanie organizmów transgenicznych

-

systemy ekspresji:

o

prokariotyczny system ekspresji Escherichia coli

o

eukariotyczny system ekspresji (Sacharomyces cerevisiae, Pichia pastoris)

o

systemy ekspresji oparte na hodowlach komórek ssaków (chomik, małpa)

o

hodowle owadzie (system bakulowirusa, Drosphilla melanogaster)

o

ekspresja heterologicznych białek w gruczołach mlecznych ssaków (myszy, króliki,
owce, kozy, krowy)

o

systemy roślinne

-

szczepionki (rekombinowane szczepionki antygenowe, hybrydowe szczepionki wirusowe i
bakteryjne, antyidiotopowe, hybrydowe, białkowe, antygenowe syntetyczne peptydy)

-

terapia genowa

-

strategia antysensu i rybozymowa

-

metody diagnostyczne

W5

BIOTECHNOLOGIA DLA MEDYCYNY – POLSKA

Poznań, Łódź- techniki chemicznej syntezy genów i ich analogów

-

zespół prof. W. Markiewicza (JChB PAN Poznań)- nowe biblioteki kombinatoryjne

-

zespół A. Legockiego (JChB PAN Poznań)- ekspresja immunogennego białka
powierzchniowego HBV w transgenicznych roślinach jadalnych

-

zespół B. Szewczyk (UG-AMG Gdańsk)- system bakulowirusa do ekspresji heterologicznych
białek (antygenów białkowych wirusów grypy oraz opryszczki)

-

AM Łódź- Escherichia coli (czynniki nekrozy nowotworów)

BROWARNICTWO

Egipcjanie praktykowali warzenie piwa już 6000 lat temu. Narody wschodu potrafiły otrzymywać
napoje fermentowane z ryżu.

1643 r.- król Karol I opodatkował produkcję piwa
XIX w.- Niemcy; produkcja i eksport
XIX w.- L. Pasteur; badania mające na celu udoskonalenie francuskich technologii produkcji piwa
(1889 r. francuski kongres browarników)
1883 r.- E. Hansen; czyste szczepy drożdży

32

SŁÓD

-

otrzymywany z jęczmienia browarnego (odpowiednie odmiany)

-

produkcja słodu (wytworzenie i uaktywnienie enzymów ziarna koniecznych do rozkładu
skrobi i białek) obejmuje:

o

moczenie ziarna jęczmienia

o

kiełkowanie

o

suszenie

-

podział słodów:

o

jasne (pilzneńskie)

o

ciemne (monachijskie)

CHMIEL

-

przyprawa

-

rozdzielnopłciowa bylina (Humulus lupus)

-

kwiatostany żeńskie: gorzkie żywice (goryczka); olejki chmielowe (składniki aromatyczne)

-

stosowano suszone szyszki chmielowe (chmiel naturalny siarkowany w balotach)

-

stosuje się preparaty chmielowe: proszki, granulaty, ekstrakty

-

rodzaje chmielu:

o

-

14-21% żywice chmielowe: walory smakowe poprawiające stabilność piany, właściwości
bakteriobójcze

-

200 g/l piwa (słodu 100 razy więcej)

W5

WODA

-

zużycie wody w browarze: 3,7-10,9 hl/hl wyprodukowanego piwa

-

woda- zacieranie

-

alkaliczność resztkowa- różnice pomiędzy właściwościami alkalizującymi anionów (HCO

3

_

),

a właściwościami zakwaszającymi kationów (Ca

2+

, Mg

2+

)

-

piwa pilzneńskie- AR

<

5

°

n

-

jony wpływające ujemnie na proces produkcji: Fe

2+

, Fe

3+

, Mn

2+

, NO

3

-

, SiO

3

-

, SO

4

2-

-

systemy uzdatniania wody: (Ca

2+

)

DODATKI NIESŁODOWANE

-

źródło węglowodanów: 15-20% dodatek do słodu

-

kukurydza, śruta, płatki, skrobia, syrop kukurydziany, ryż, jęczmień, sorgo, pszenica, cukier

-

preparaty enzymatyczne, stabilizujące, filtrujące

DROŻDŻE

-

mikroorganizmy odgrywają pierwszoplanową rolę w produkcji piwa

-

Polska- wyłącznie drożdże; Niemcy, Belgia- bakteria (mlekowe):

o

drożdże- wytwarzanie alkoholu, substancji chromatycznych, obniżenie pH brzeczki

o

bakterie- obniżenie kwasowości brzeczki

-

drożdże dolnej fermentacji

-

drożdże górnej fermentacji- Sacharomyces cerevisiae

-

dzikie drożdże – Sacharomyces pastorianus, Torulopsis (stęchły smak i zapach)

ETAPY PRODUKCJI PIWA

1. Przygotowanie słodu:

a. usunięcie kiełków
b. 5-6 tyg. odleżenia

2. Mielenie słodu

a. przygotowanie słodu do procesu zacierania
b. celem mielenia jest ułatwienie rozpuszczenia składników ekstraktywnych słodu w

wodzie i pobudzenie działania enzymów; stworzenie materiału do budowy warstwy
filtracyjnej brzeczki w kadzi fermentacyjnej

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

33

c. najmniejsze rozdrobnienie łuski, największe rozdrobnienie bielma

3. Zacieranie

a. ma na celu wyprodukowanie brzeczki (surowiec i podłoże dla mikrobów)
b. I faza – przechodzą do roztworu substancje rozpuszczalne słodu powstałe na skutek

enzymatycznych przemian bielma w czasie kiełkowania

c. II faza – hydroliza skrobi w temp. 35-75

°

C (maltoza i dekstryny graniczne); hydroliza

białek w temp. 48-55

°

C; 50

°

C przerwa białkowa

d. typowy skład węglowodanów w typowej brzeczce: 44% maltoza, 31% dekstryny,

11% maltotrioza, 9% glukoza, 3% sacharoza, 2% fruktoza

4. Filtracja brzeczki

W5

5. Gotowanie brzeczki z chmielem

a. smak i aromat
b. ma na celu:

i. sterylizacja brzeczki

ii. wytrącanie osadów

iii. usuwanie niepożądanych składników

iv. ustalenie barwy

v. zakwaszenie i zagęszczenie brzeczki

vi. inaktywacja enzymów

c. dawkę chmielu ustala się na podstawie aktualnej zawartości „izo-związków” w

chmielu oraz wymaganej zawartości w piwie

d. związki goryczkowe- „kwasy”, gotowanie formy „izo” (odpowiedni czas dodawania

odpowiedniego rodzaju chmielu)

6. Usuwanie osadów gorących.
7. Chłodzenie i natlenianie brzeczki.
8. Usuwanie osadów zimnych.
9. Zadawanie drożdżami:

a. czysta kultura lub drożdże z wcześniejszych szarży
b. pielęgnacja drożdży: dekarboksylacja, przemywanie, przesiewanie, napowietrzanie,

homogenizacja, przechowywanie

c. przygotowanie do zaszczepu, napowietrzanie i mieszanie w celu ujednolicenia

10. Fermentacja:

a. konwersja cukrów brzeczki do etanolu i CO

2

b. węglowodany zużywane w odpowiedniej kolejności
c. związki azotowe- aminokwasy, peptydy niskocząsteczkowe, zasady azotowe,

purynowe i pirymidynowe

d. aminokwasy- wyższe alkohole alifatyczne i aromatyczne (Wal- diacetyl)
e. jony
f. temperatura
g. fermentacja dolna (8-10 dni)
h. fermentacja górna (2-3 dni)
i. fermentacja główna (burzliwa):

i. zaszczepienie

ii. faza krążków niskich

iii. faza krążków wysokich

iv. faza opadania krążków

11. Dojrzewanie piwa (leżakowanie):

a. dojrzewanie piwa (fermentacja wtórna)
b. zachodzi: nasycenie piwa CO

2

, sklarowanie piwa, uzyskanie odpowiedniego stopnia

odfermentowania, wytworzenie właściwego bukietu smakowo-zapachowego

c. parametry kontrolowane- temperatura, zawartość ekstraktu, zawartość CO

2

, zmiana

pH, zawartość diacetylu, ilość osadów drożdżowych

12. Filtracja, karbonizacja, rozlew piwa.

Piwa angielskie:
ALE- owocowy smak
Lager- dolna fermentacja, złocista barwa

34

W5

Porter- mocne, ciemne piwo

Piwa niemieckie:
Altbier- miedziana barwa, ze słodu jęczmiennego
Bock- fermentacja dolna, mocne, sezonowe
Eisbock- moc wzrasta dzięki procesowi mrożenia
Weissbier- piwo pszennicze

Piwa belgijskie:
Guezue
Saison

Piwa holenderskie:
Kruidenbier- piwo z przyprawami

Piwa hiszpańskie:
Oscura- ciemne piwo

Produkcja piwa- etapy (E)


PRODUKCJA DROŻDŻY PIEKARSKICH

-

czołowe miejsce wśród przemysłów fermentacyjnych

-

piekarnictwo, dodatek żywieniowy (witaminy B, aminokwasy)

-

drożdże prasowane, suszone, suszone instant

-

drożdże fermentacji górnej Sacharomyces cerevisiae

-

cechy drożdży piekarskich:

o

wysoka, właściwa szybkość wzrostu

o

wysoka aktywność w procesie glikolizy

o

zdolność adaptacji do szybko zmieniających się substratów w pożywce hodowlanej

o

wysoka aktywność inwertazy

α

-glukozydazy,

β

-fruktofuranozydazy

o

zdolność do wzrostu i syntezy enzymów i koenzymów zarówno w procesie tlenowym
jak i beztlenowym

o

produkt- dobra trwałość w czasie przechowywania

-

przemysłowa produkcja drożdży piekarskich- prowadzenie kilkuetapowej hodowli tlenowej ze
zwiększeniem objętości pożywki hodowlanej

-

brzeczka hodowlana- melasa, związki będące źródłem azotu i fosforu, witaminy (biotyna,
kwas pantotenowy, inozytol, tiapirodoksyna, niacyna)

-

III etapy produkcji:

o

stadium czystych kultur

o

generacja I

o

generacja handlowa

PRODUKCJA SCP (Single Cell Protein)

-

wykorzystywanie do produkcji białka

-

biomasa mikroorganizmów źródłem białka

W5

-

wykorzystywana przede wszystkim jako pasza dla zwierząt

-

SCP

-

korzyści z zastosowania:

o

bardzo szybki wzrost mikroorganizmów

o

możliwość modyfikacji genetycznej

o

odpady jako składnik pokarmowy

1. wytwarzanie SCP z węglowodanów:
-

węglowodory aromatyczne Pseudomonas sp., Anthrobacter sp., Nocardia sp.,

Candida sp., Torulopsis sp., Aspergillus sp., Penicillium sp.

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

35

-

n-oktadekan, n-heksadekan

-

produkcyjna hodowla odbywa się w warunkach silnego napowietrzenia pożywki w
zemulgowanych środowiskach

-

metan jako substrat dla mikroorganizmów

2. SCP z alkoholi

a. etanol i metanol
b. SCP z metanolu- firma U.V.Hoechst (Niemcy), Mitshubishi (Japonia), Methylophilus

methylotrophus, ICI (Anglia), Pseudomonas sp.

c. SCP z etanolu- Skonaft (Czechy), Amoco Foods (USA)- drożdże

3. SCP ze ścieków i odpadów przemysłowych:
-

wywary gorzelnicze, melasa, serwatka, poślady zbóż, korzenie, słoma, łuski, osady czynne
biologicznych oczyszczalni ścieków

-

Szwecja- produkcja SCP z odpadów przemysłu krochmalniczego, mieszanka dwóch szczepów
Endgmycopsis fibuligria, Candida utilis

-

Finlandia- produkcja z SCP z ługów posiarczanowych zbiałczonych przez Peacilomyces sp.

-

Anglia- Rank Haris McDougall wykorzystanie przemysłu rolno-spożywczego

-

odpady lignino- celulozowe Clostridium thermocellum

-

Szwecja- rozkład lignin Sporotriculum pulvenilentum

W6

MLEKO = płynna wydzielina gruczołów mlecznych ssaków

Skład chemiczny zależy od:

•

rasy krów

•

okresu laktacji

•

sposobu odżywiania

•

pory roku, itp.

SKŁADNIKI

średnia zawartość %

woda

87,7

tłuszcz

3,4

kazeina

2,5

inne białka

0,7

laktoza

4,8

kwas cytrynowy, witaminy A, B

1

, B

2

, B

6

, B

12

,biotyna, inozytol, cholina,

kwasy: pantotenowy, foliowy, nikotynowy

0,2

popiół

0,7

Bakterie fermentacji mlekowej przetwarzają laktozę i kazeinę.

LAKTOZA- cukier, może być w warunkach beztlenowych fermentowana z wydzieleniem głównie
kwasu mlekowego, który w odpowiednim stężeniu ścina białka mleka powodując powstanie skrzepu.

Niektóre szczepy bakterii są zdolne do hydrolizy białka mleka.

PRODUKTY FERMENTACJI MLEKOWEJ:

-

diacetyl

-

aldehyd octowy

-

alkohol etylowy

-

kwas propionowy

-

kwas mrówkowy

-

lotne kwasy tłuszczowe

-

alkohole

-

aceton

-

estry

FERMENTACJA INDUKOWANA – STARTERY

Funkcja bakterii fermentacji mlekowej:

36

-

nadanie produktom specyficznych cech organoleptycznych (smak, aromat, konsystencja)

-

zwiększenie ich wartości odżywczych

-

zwiększenie przyswajalności składników mineralnych

-

stabilizacja biologiczna produktów (antagonistyczne właściwości bakterii mlekowych)

W6

Główne metabolity antagonistyczne:

-

kwasy organiczne- mlekowy, octowy, 2-pirolodono-5-karboksylowy

-

bakteriocyny- aktywne, głównie w stosunku do bakterii Gram (+)

-

enzymy- układ peroksydazy, lizozym

-

niskocząsteczkowe produkty przemiany materii: renteryna, diacetyl, aldehyd octowy, kwasy
tłuszczowe

-

inne: H

2

O

2

PRODUKCJA SERÓW

SERY produkty nabiałowe bogate w białko i tłuszcz, otrzymane na drodze koagulacji kazeiny,
odpowiedniej obróbki skrzepu oraz przemian biochemicznych zwanych dojrzewaniem

PODZIAŁ SERÓW PODPUSZCZKOWYCH:

-

twarde i półtwarde

o

typ szwajcarski (Ementaler, Grujer)

o

typ włoski (Orana, Parmezan)

o

typ holenderski (Edamski, Gouda)

o

typ szwajcarsko-holenderski

o

typ angielski (Chedar)

o

typ z masy parzonej (Oscypek)

-

miękkie

o

z porostem pleśniowym (Camembert, Brie)

o

z przerostem pleśniowym (Roquefort)

o

maziowe (Limburski)

o

pomazankowe (Bryndza)

PRZYGOTOWANIE MLEKA DO WYROBU SERÓW:

-

standaryzacja- białka/tłuszcze (P/F stały)

-

filtracja- 30

°

C, filtr bawełniany

-

klarownie- 32-38

°

C

-

usuwanie bakterii- 99% bakterii, 95% spor

-

subpasteryzacja- 63-65

°

C, schłodzenie

-

ultrafiltracja- sery miękkie

-

homogenizacja- rozbicie drobin tłuszczu

-

pasteryzacja- całkowite zabicie drobnoustrojów i inaktywacja enzymów 63

°

C, 30 min. lub

72

°

C, 16 s.

DODATKI DO MLEKA:

-

CaCl

2

-

azotany

-

barwniki

-

H

2

O

2

-

lipazy

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

37

W6

PRODUKCJA SERÓW PODPUSZCZKOWYCH:

-

przygotowanie mleka do przerobu

-

przygotowanie i dodatek zakwasu lub preparatu bakterii fermentacji mlekowej

-

przygotowanie i zaprawienie mleka podpuszczką lub innym preparatem koagulacyjnym

-

obróbka skrzepu i gęstwy

-

formowanie serów

-

ociekanie i prasownie

-

solenie

-

dojrzewanie i pielęgnacja serów

SERY TWARDE

Mleko (30-32

°

C) + CaCl

2

+ saletra potasowa + zakwas

Zadaniem zakwasu dodawanego do mleka w ilości 0,3-2% jest prawidłowe ukierunkowanie procesów
fermentacji podczas obróbki gęstwy serowej na wannie i w czasie dojrzewania oraz zahamowanie
rozwoju drobnoustrojów niepożądanych.

Jednocześnie bakterie zakwasu posiadają enzymy proteolityczne biorące udział w degradacji białka i
tłuszczu w czasie dojrzewania.

ZAKWAS TERMOFILNY- bakterie termofilne Lactobacillus salivaris, Lactobacillus velveticus,
Lactobacillus bulgaricus, bakterie propionowe.

ZAKWAS MEZOFILNY- Streptococcus lactis, Streptococcus diacetilacti,
Streptococcus cremoris, Lactobacillus casei.

FERMENTACJA LAKTOZY

Po uzyskaniu skrzepu o odpowiedniej zwięzłości następuje jego krojenie i rozdrobnienie do postaci
ziarna w celu usunięcia serwatki.

Ziarno w serwatce (gęstwa) miesza się i podgrzewa do 38

°

C (Gouda) lub 54-58

°

C (Ementaler).

Formowanie, solenie.

Dojrzewanie- 15

°

C, wilgotność względna powietrza 80-85%, proces w całej masie. Produkty

powstające w czasie dojrzewania i decydujące o cechach organoleptycznych sera:

-

produkty przemiany laktozy- kwas mlekowy, propionowy, octowy i inne, lotne kwasy,
aldehyd octowy, diacetal

-

produkty degradacji białek- peptydy, polipeptydy, aminokwasy oraz związki powstające w
wyniku deaminacji, dekarboksylacji aminokwasów

-

produkty przemiany tłuszczów- aldehydy i estry

-

produkty biosyntezy powstające w wyniku procesów życiowych mikroorganizmów

W6

SERY MIĘKKIE:

Pasteryzowane mleko o znormalizowanej zawartości tłuszczu zaszczepia się dużą dawką zakwasu
mezofilnego (paciorkowce). Czas krzepnięcia jest dłuższy- 1-2 h , nagromadzenie bakterii w szczepie.
Uzyskany skrzep kroi się na duże ziarna, gęstwę osusza się i bez dogrzewania dolewa się do form. Po
soleniu sery umieszcza się w dojrzewalni.

Otrzymana masa serowa posiada więcej laktozy, która ulega przemianie a tym samym jest bardziej
kwaśna.

Pielęgnacja- pierwsze rozwijają się drożdże, grzyby i bakterie Brevibacterium lineus.

38

Camembert, Brie:

-

Penicillium camembert

-

Penicillium candidum

-

Penicillium caseicolum

-

Brevibacterium lineus

Roquert:

-

Penicillium roquefort

BIOTECHNOLOGICZNE PRZETWARZANIE SERWATKI

-

produkcja napojów fermentowanych (Streptococcus sp., Lactobacillus sp.)

-

browarnictwo- zamiast wody do przygotowywania zacieru

-

koncentraty biologicznie ukwaszonej serwatki- utrwalenie odpowiednich drożdży piekarskich

-

SCP

-

kwas mlekowy, kwas propionowy

-

podłoże z serwatką do hodowli pieczarek

1. Zsiadłe mleko:

-

wysoka pasteryzacja mleka

-

dodatek zakwasu

-

bakterie kwaszące i aromatyzujące: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris

-

inkubacja 30-35

°

C, 7-12 h

2. Mleko acidofilne:

-

Lactobacillus acidofilus

-

mleko wysoce pasteryzowane lub sterylizowane

-

zakwas monokulturowy

-

inkubacja 38-40

°

C, 7-12 h

3. Jogurt:

-

mleko pełne lub odtłuszczone,

-

zgęszczone,

-

zakwas 1:1 lub 1:2 (Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus thermophilus);

-

metoda zbiornikowa lub termostatowa;

-

wzbogacenia: Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium bifidum

W6

4. Biogurt:

-

zakwas 1:3 (Lactobacillus acidophilus, Streptococcus lactis)

5. Kefir:

-

napój musujący

-

grzybki kefirowe (Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus diacetilactis,
Lactobacillus desidious, Brevibacterium brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus
cellobiosis), drożdże (Candida kefyr, Candida pseudotropicalis, Kluyveromyces lactis,
Saccharomyces florentimus, Saccharomyces globasus, Saccharomyces delbrueckii,
Saccharomyces unisporus)

6. Maślanka:

-

ukwaszenie maślanki (proces ubocznego procesu produkcji masła)

-

zakwas Streptococcus Streptococcus cremois lub lactis, S. Diacetalis lub leuconostoc

-

22

o

C, 18 godzin

7. Kwaśna śmietana- zakwas śmietankowy

-

22

o

C, 18 godzin

-

S. cremosis lub lactis, S.leuconostoc

8. Kumys

-

Lactobacillus bulgaricus, Candida kefyr (bakteria + grzyb)

-

28

o

C, 2 godziny

9. Szampan serwatkowy

-

niskoprocentowy napój alkoholowy

10. Masło:

-

najszlachetniejszy tłuszcz jadalny

-

15-16% woda, 83-84% tłuszcze, śmietanka

-

dojrzałość fizyczna

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

39

-

dojrzałość biologiczna – pH 5,5-5,9

-

zakwas Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus diacetilactis, Leuconostoc
cremoris, Lactobacillus lactis

Lactobacillus

→

warunki beztlenowe i powstaje CH

3

COOH zamiast mleczanu

Leuconostoc dextranium

→

kwas cytrynowy

→

kwas pirogronowy

→

acetoina (zapach maślany)

→

diacetyl + CO

2

L. bulgaricus, S. thermophilus

→

acetaldehyd (główny składnik smakowy jogurtu)

ZAKWASY STOSOWANE W MLECZNICTWIE:

Zakwas- hodowla czystych kultur bakterii fermentacji mlekowej stosowana do wyrobu sera, twarogu,
masła i napojów mlecznych.

Zadaniem zakwasu jest prawidłowe ukierunkowanie procesów fermentacyjnych podczas obróbki
produktu.

Cechy zakwasu:

-

odpowiedni skład mikrobiologiczny

-

wysoka aktywność

-

czystość mikrobiologiczna

W6

Rodzaje zakwasów:

-

zakwasy pojedynczych szczepów

-

zakwasy wieloszczepowe

-

zakwasy mieszane kombinowane

Kryteria doboru i selekcji nowych szczepów, które wprowadza się do serowarstwa:

mieszanina szczepów

↓

przesiewanie

↓

aktywność syntazy kwasu mlekowego

↓

odporność na bakteriofagi

↓

identyfikacja plazmidów DNA

↓

badanie zgodności steroidów

↓

test na wytwarzanie substancji smakowo-zapachowych

↓

próbny wyrób sera

↓

ocena i klasyfikacja szczepu

RODZAJE SZCZEPIONEK STOSOWANYCH W PRZEMYŚLE SPOŻYWCZYM

-

ciekłe

-

suszone

-

zamrożone

OCENA SANITARNA WARUNKÓW PRODUKCJI

40

HACCP (Hazard Analysis Critical Central Point) system krytycznych punktów kontroli ustalanych na
podstawie przeprowadzonej analizy zagrożeń. Prawidłowy stan mikrobiologiczny produktu zostaje
osiągnięty poprzez zapobieganie zagrożeniom w całym łańcuchu zagrożeń.

Krytyczny punkt kontrolny- surowiec, miejsce, postępowanie, procedura, operacja jednostkowa, punkt
w którym należy działanie kontrolne lub zapobiegawcze w celu wyeliminowania lub
zminimalizowania zagrożeń wpływających na jakość końcowego produktu.

Produkowanie zgodnie z praktyką higieniczną- całkowite wykluczenie możliwości wzajemnego
krzyżowania się lub cofania dróg surowca, półproduktu i gotowego wyrobu we wszystkich etapach
produkcji.

W6

Właściwe opracowanie dróg i szlaków transportu wewnętrznego w celu wyeliminowania ich ruchu
przez obszary, które mogą być źródłem zanieczyszczeń wtórnych (zasada „first in- first out”).

Higiena personelu.

Metody badań:

-

metody klasyczne- tamponowa, wypłukiwania, bezpośrednia, odciskowa (dają efekt po
upływie czasu)

-

metody nowoczesne- modyfikacja metody płytkowej, bioluminescencji (najszybsza metoda)

W7

PROCES KONWERSJI SKROBII

Skrobia- roślinna substancja zapasowa występująca w dwóch formach: amylazy i amylopektyny.

Amylaza- nie ma rozgałęzień, cząsteczki glukozy połączone wiązaniami

α

-1,4-glikozydowym.

n

OH

OH

Amylopektyna- rozgałęzienia, na jedno wiązanie

α

-1,6-glikozydowe przypada 30 wiązań

α

-1,4-

glikozydowych.

O

O

OH

CH

2

OH

OH

O

O

O

OH

OH

CHOH

CH

2

OH

OH

OH

O

O

OH

O

H

CH

2

OH

Konwersji podlega tylko skrobia kukurydziana.

HFCS (High Fructose Corn Syrup)- mieszanina dekstrozy i fruktozy, 42%, 55%, 90% środek
słodzący.

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

41

PROCES PRODUKCJI:

1. Przygotowanie dekstrozy ze skrobii (

α-amylaza).

2. Przygotowanie do sacharyfikacji- zmiana pH i temperatury.
3. Sacharyfikacja (glukoamylaza).
4. I rafinacja- oczyszczanie hydrolizatu na węglu aktywnym:

a. jony Mg

2+

aktywują izomerazę glukozy

b. inhibitory kompetencyjne do jonów Ca

2+

(ochrona)

5. Izomeryzacja- immobilizowana izomeraza glukozy.
6. II rafinacja- odparowanie:

a. węgiel aktywny
b. chromatografia jonowymienna

7. gotowy produkt- 42% HFCS (komercyjnie otrzymuje się)

W7

Wytłumaczyć proces konwersji skrobi, na czym polega? (E)

PREPARATY ENZYMATYCZNE STOSOWANE W PRZEMYŚLE.

Dzięki zastosowaniu preparatów enzymatycznych uzyskuje się:
-

oszczędność surowca, np. zastąpienie słodu jęczmiennego słodem pleśniowym

-

zwiększenie wydajności procesu technologicznego, np. zastosowanie pektynaz do klarowania
soków

-

skrócenie cyklu produkcyjnego, np. zastosowanie enzymów proteolitycznych w przemyśle
mięsnym

-

poprawienie jakości wyrobu, np. lepsza jakość soków odwłasianych enzymatycznie

-

zwiększenie trwałości produktu, np. stabilizacja piwa za pomocą oksydazy glukozowej

-

możliwość sterowania reakcją enzymatyczną

1896 r.- TAKADIASTAZA (enzymy hydrolityczne); surowy preparat enzymatyczny otrzymywany z
hodowli Aspergillus oryzae prowadzonych na otrębach pszennych.

OGÓLNY DIAGRAM PRODUKCJI PRZEMYSŁOWEJ ENZYMÓW

mikroorganizmy tkanki roślinne i zwierzęce

↓

↓

produkcja biomasy

mielenie i homogenizacja

↓

↓

fermentacja fermentacja
wgłębna powierzchniowa

wodna

ekstrakcja i filtracja

roztwór

enzymu

suszenie

↓

↓

zagęszczanie rozdrabnianie

dodatek stabilizatora lub precypitacja surowy preparat

konserwantów

enzymatyczny

↓

↓

roztwór enzymu filtracja

↓

suszenie

↓

rozdrabnianie

↓

42

proszek enzymatyczny

W7

Większość enzymów używanych w przemyśle to enzymy egzogenne.

ENZYMY PROTEOLITYCZNE

Stanowią 60% komercyjnie używanych enzymów.

HYDROLAZY PPEPTYDOWE

-

pochodzenie roślinne, zwierzęce i mikrobiologiczne

-

enzymy indukcyjne

-

enzymy egzogenne, endogenne

PROTEINAZY SERYNOWE

Trypsynopodobne, alkaliczne,

α

-lityczne, proteinazy, Myxobacterium sp.

Proteinazy trypsynopodobne- trypsyna (pankreatyna- przemysł spozywczy, garbarstwo i przemysł
farmaceutyczny), chemotrypsyna, enzymy Streptomyces sp.

Proteinazy alkaliczne- bakteria, drożdże i pleśnie, tkanki ssacze, znaczenie komercyjne: subtylizyna
(alkaliczne enzymy detergentów), enzym Aspergillus oryzae (preparaty termostabilnych proteinaz
alkalicznych), enzym Streptomyces vimosus (przemysłowa produkcja oksytetracykliny).

Proteinazy tiolowe-

Proteinazy kwaśne (karboksylowe):
-

reninopodobne- podpuszczka cielęca i bakteryjna

-

peptydopodobne- wieprzpowa i wołowa pepsyna proteinazy z Aspergillus

Podpuszczka i proteinazy podobne- „gorzkie peptydy”, enzymy zwierzęce, rybne (ryby morskie),
niskie optimum temperatury, mikrobiologiczne (Aspergillus sp., Rhizopus sp.)

Metaloproteinazy- naturalne, alkaliczne:
-

naturalne:

o

bakteryjne: Bacillus subtilis (browarnictwo); Bacillus stearothermophilus- termolizyna
(aspartam)

o

grzybowe: Aspergillus oryzae (piekarnictwo, przemysł spożywczy, modyfikacje białek,
przemysł farmaceutyczny)

-

alkaliczne: Pseudomonas aeruginosa, Serratia sp. (dtergenty)

PRZEMYSŁOWE ZASTOSOWANIE PROTEAZ POCHODZENIA
MIKROBIOLOGICZNEGO:

-

hydroliza białek- zmiana właściwości białka i produktu, którego ma być składnikiem kontrola
gorzkiego smaku hydrolizatów białkowych [„gorzkie peptydy”- maskowanie (polifosforany,
żelatyna), usuwanie (filtracja, wytrącanie kwasem), zapobieganie (enzymem)]

W7

-

hydrolizaty sojowe- doskonałe właściwości białek soi, sosy i przetwory sojowe, suplementowanie
białkami napojów, dietetycznej żywności

-

hydroliza żelatyny- zniesienie efektu żelu, niski poziom Trp, środki dietetyczne, przemysł
kosmetyczny; typowy proces 30% roztwór żelatyny + mieszanina alkalicznych i neutralnych
proteaz,

>

4 h, pasteryzacja 90

°

C

-

hydroliza kazeiny i białek serwatki

-

hydroliza białek mięsa

-

białka rybie

-

kruszenie mięsa- enzymy roślinne (papaina, ficyna)

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

43

-

detergenty- enzymy o dużej stabilności, aktywności w roztworze detergentu;

-

mleczarstwo- serowarstwo (podpuszczka zwierzęca 65%, renina + pepsyna 50:50)

-

browarnictwo- mielenie słodu (zwiększenie wydajności, poziom aminokwasów, klarowanie-
papaina)

-

piekarnictwo- poprawa jakości mąki

-

garbarstwo- proteazy alkaliczne, etap moczenia skóry, oczyszczanie, odwłasianie

-

produkcja podłoży mikrobiologicznych

-

przemysł farmaceutyczny- mieszanki poprawiające trawienie, urokinaza, zaburzenia krzepnięcia
krwi, kolagenaza, likwidacja zmian skórnych

INNE ENZYMY HYDROLITYCZNE

PEKTYNAZY- Aspergillus niger, Rhisopus (pektyny-kwasne polimery cukorwe)

-

esteraza pektynowa- pomidor, Fusarium oxysporum, Clostridium multifermentans

-

egzopoligalaktouranaza- brzeczka pofermentacyjna (produkcja kwasu cytrynowego przez
Aspergillus niger)

LIAZY

CELULAZY- Aspergillus niger, Penicillium sp.:

-

enzymy odporne, stabilne w niskim pH

-

substrat to celebioza

-

zastosowanie:

o

przemysłowy alkohol etylowy z celulozy

o

obróbka nasion (browarnictwo, przetwórstwo)

o

wydzielenie wielocukrów glonów morskich

β-GLUKANAZY:
-

hydroliza glukanu jęczmienia

-

hydroliza poliglukanu wytworzonego przez grzyb etylujący winogrona

HEMICELULAZY I KSYLANAZY- pleśnie, hydroliza arabanu, galaktanu, mannanu, ksylanu
(tkanki roślinne) wraz z pektynazami i celulazami.

LAKTAZA- konwersja laktozy do glukozy i galaktozy, di- i trisacharydy sa produktami ubocznymi,
enzymy roślinne (jabłka, brzoskwinie, morele), zwierzęta, mikroorganizmy, enzymy bakteryjne i
drożdżowe (wewnątrzkomórkowe), grzybowe (zewnątrzkomórkowe);

W7

znaczenie komercyjne Kuyveromyces lactis, Kuyveromyces fragilis, Aspergillus oryzae, Bacillus sp.

ŻRÓDŁO PRODUKT

UWAGI

pasza dla zwierząt

zwiększenie wydajności, , wartości odżywczej,
zapobieganie krystalizacji laktozy w koncentratach
serwatkowych

serwatka

bezlaktozowy syrop serwatkowy

piekarnictwo, lody

mleko

mleko bezlaktozowe

składnik diety ludzi z niską tolerancja laktozy,
słodki smak, zapobieganie krystalizacji laktozy w
koncentratach laktozowych

44

MLEKO

UHT

MLEKO UHT

pasteryzacja

laktoza drozdzowa

hydroliza fermentowa

pakowanie sterylne

hydrolizat

hydroliza

bezlaktozowe mleko UHT

UHT

pasteryzowane mleko bezlaktozowe

odparowanie

mleczny koncentrat bezlaktozowy

W7

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

45

SERWATKA

pasteryzacja

zmiana pH

laktoza grzybowa

hydroliza

bla

bla

hydroliza

pasteryzacja

odparowanie

bezlaktozowy syrop serwatkowy

UHT- Ultra High Temperature

LIPAZY- Candida sp., Aspergillus sp., Rhizopus sp., Mucor sp., lipazy trzustkowe, przemysł
farmaceutyczny, produkcja zapachów, przyspieszenie dojrzewania serów twardych, hydroliza olejów
w produkcji mydła.

PROCES PRZEMYSŁOWY:

-

kadzie przedmateczne z podłożem A (białko sojowe);

-

kadzie mateczne z podłożem B (namok kukurydziany, skrobia kukurydziana, ekstrakt drożdżowy,
silikan);

-

fermentator produkcyjny (podłoże B + dekstroza), 4-28 h, zasilany odpowiednio przygotowanym
sterylizowanym namokiem kukurydzianym;

-

immobilizacja;

-

oddzielenie biomasy od płynu pohodowlanego;

-

suszenie;

W7

IMMOBILIZACJA IG

MIKROORGANIZM

METODA IMMOBILIZACJI

Actinoplanes missouriensis

całe komórki, żelatyna, glutaraldehyd, enzym,
alumina

Streptomyces rubiginosus

enzym, żelatyna

46

Flavobacterium arborescens = całe komórki, glutaraldehyd
Bacillus coagulans = lizat komórkowy, glutaraldehyd

Sweetzyme® = Bacillus coagulans
Maxazyme® = Actinoplanes missouriensis
Ketozym® = Actinoplanes missouriensis
Tako–Sweet® = Streptomyces olivaceus
Optisweet22® = Streptomyces rubinosus

ENZYMY PRZEMYSŁOWE – PODSUMOWANIE

ENZYMY GLIKOLITYCZNE

α

- amylazy

Bacillus subtilis
Aspergillus niger

tekstylia, syropy glukozowe,
detergenty, fermentacja
etanolowa, karma dla zwierząt
browarnictwo, piekarnictwo

β

-amylazy

Bacillus browarnictwo, syropy

maltozowe

celulazy

płyny do mycia naczyń, pasze
dla zwierząt, bioenergia,
tekstylia

β

-glukanazy

piwowarstwo

dekstranazy

przemysł spożywczy

2-galaktozydaza

przemysł spożywczy

glukoamylaza

cukrownictwo

hemicelulazy

Aspergillus niger
Rhizopus

syropy glukozowe i dekstranowe

pentozanazy

ksylonazy

inwertaza

laktaza

Klebsiella lactis
Aspergillusoryzae
Bacillus subtilis

mleczarstwo

naringinaza

usuwanie goryczy ze skórek
cytrusowych

pektynaza

produkcja soków

pullulanaza

Klebsiella aerogenes
Bacillus subtilis

drożdże piekarskie,
p/podziałowy

W7

PROTEAZY

proteinazy kwaśne

Aspergillus niger
Aspergillus oryzae

piekarnictwo

proteazy alkaliczne

Bacillus subtilis

detergenty, garbarstwo

pepsyna

żołądki wieprzowe, wołowe

produkcja serów

subtytlizyna

Bacillus subtilis

OKSYDOREDUKTAZY

•

dehydrogenaza alkoholowa

•

katalaza

LIAZY

•

histydaza

TRANSFERAZA

•

glikozylotransferaza

•

cyklodekstrynaza

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

47

MIKROBIOLOGICZNE ŚRODKI SMAKOWE I ZAPACHOWE

Związki aromatyczne i smakowe - kompleksowe mieszaniny

Komercyjny sukces:

•

wysoka wydajność

•

tanie substraty

•

ograniczenie syntezy chemicznej

1. METYLOKETONY

•

aromat sera

•

Penicillium roqueforti – formy spoczynkowe, nie wegetatywne, konwersja kwasów
tłuszczowych (C14)

→

metyloketon (C1)

•

produkcja przemysłowa – koszt

•

toksyczność związków

•

lotność – techniki fermentacyjne + konwersja enzymatyczna

•

fermentacja grzybowa

→

kwasy tłuszczowe

→

β

-oksydacja

→

odzysk poprzez

ekstrakcję lub destylację

2. DIACETYL

•

roztwór wodny

•

charakterystyczny, ostry masłowy zapach

•

przemysł spożywczy i perfumeryjny

•

występuje w mieszaninie z acetoiną

•

Streptococcus lactis, Leuconostoc

W7

3. LAKTONY

•

cykliczne estry specyficzne hydroksykwasów

•

zapachy: śmietankowy, owocowy, brzoskwiniowy, orzechowy, kokosowy, miodowy

4. KWAS MASŁOWY:

•

uzupełnianie zapachu maślanego w serowarstwie

•

estry- pentylowy (zapach bananowy), izobutylowy (zapach gruszkowy)

•

proces fermentacji zależy od pH i podłoża

W8

3. LAKTONY

4. KWAS MASŁOWY:

- niskie stężenie uzupełnia zapach maślany w serowarstwie,
- naturalne 2% masła,
- obligatoryjne anaeroby Clostridium, Eubacterium, Fusarium, wrażliwe na pH, w fermentorze pH

≈

5

(CaCO

3

),

- toksyczny dla produktu:

a) maślan pentylowy = zapach owoców brzoskwini, ananasa, moreli;
b) maślan izobutylowy = gruszka, ananas, brzoskwinia

5. KWAS IZOWALERIANOWY: najsilniejszy zapach, zapach brudnych stóp

•

izowalerian etylu = zapach jabłkowy (cukierki, gumy do żucia)

•

izowalerian izopentylowy = zapach jabłek, malinowy (przemysł spożywczy)

•

izowalerian izobutylu = zapach jabłkowo-malinowy (przemysł perfumeryjny)

6. TERPENY i produkty ich transformacji:

48

-

olejki eteryczne,

-

różnorodność zapachów: owocowe, różane, geranium pachnący, trawiasty,
migdałowy, grzybowy, kamforowy

7. JONONY:

-

produkty enzymatycznej hydrolizy karotenoidów

-

zapach tabaki

8. GEOSMIN: algi, baterie, grzyby, perfumy, olejki eteryczne.

Mikroorganizmy mogą syntezować kompleksowe mieszaniny związków, które uzupełniają się:

•

zapachy nabiałowe – zapachy serowe (chipsy, sosy, wypieki), jogurtowe, śmietankowe

•

zapachy chlebowe: zapach białego chleba – składniki, produkty fermentacji drożdżowej i
bakteryjnej, degradacji, produkty reakcji termicznej, 2 kierunki :

o

zapachy prefermentacyjne (mieszanina drożdży, wody, cukru, soli, odtłuszczonego
mleka, pożywki drożdżowej; 6h fermentacji bezpośrednio do ciasta lub podczas
wyrabiania)

o

preparaty enzymatyczne: amylazy, proteazy mikrobiologiczne

•

zapachy grzybowe: 1-octan-3-ol, kwas glutaminowy, 5’-guanylan; poszukiwanie zapachów
grzybowych nie koncentruje się na poszukiwaniu producentów; hodowla wgłębna, suszenie

•

zapachy i smaki z tkanek roślinnych: wanilia i mięta pieprzowa, koszt i dostępność;

metoda pozyskiwania: bezpośrednia ekstrakcja z materiału, podłoża, biotransformacja, synteza
enzymatyczna,
wszystkie techniki z fermentacji mikrobiologicznej używa się w produkcji związków
smakowych i zapachowych z roślin: selekcja komórek nadprodukujących prekursory,
manipulacje położenia, hormony.

W8

AROMATY IDENTYCZNE Z NATURALNYMI

COH

OH

OMe

WANILINA = 4-hydroksy-3-metoksybenzaldehyd (aromat identyczny z naturalnym)

•

odpowiedzialna za zapach wanilii;

•

w materiale roślinnym znajduje się 2% suchej masy wanilii; izolowana w postaci
proszku o słodkim smaku i intensywnym zapachu;

•

zastosowanie: przemysł spożywczy, cukiernictwo, produkcja napojów, perfumy,
kosmetyki;

•

produkcja: 6000ton/rok;

•

synteza chemiczna: gwajakol i ligniny, tanio 12$/kg związku (ludziom nie podoba się
ten związek – jest syntetykiem, więc rozpoczęto poszukiwania metod do produkcji
tych związków, tzn. identycznych z naturalnymi: biotransformacje, synteza de novo
przez specjalne szczepy).

Aromaty identyczne z naturalnymi: związki produkowane przy udziale mikroorganizmów.

1. PRODUKCJA WANILINY PRZEZ BIOTRANSFORMACJĘ:
- biotransformacja lignin: utlenianie „white rot fungi”; peroksydaza ligninowa z grzybów z rodzaju
hub
- biotransformacja kwasu ferulowego:

WANILINA

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

49

OH

OMe

COOH

pochodna kwasu cynamonowego, enzymatyczne uwalnianie z lignin: esteraza ferulowa i hydrolaza
estrów cynamonowych

•

dekarboksylacja: grzyby i drożdże

•

redukcja: Burkolderia cepacia, Lactobacillus plantarum, Saccharomyces cervisiae

•

deacetylacja niezależna od CoA: Pseudomonas, Bacillus subtilis, Escherichia coli

•

deacetylacja zależna od CoA: P. putida, Rhodotorula rubra

- biotransformacja kwasu wanilinowego: Pseudomonas fluorescens, 95% wydajności;

OH

OMe

COOH

- biotransformacja eugenolu i izoeugenolu: składniki olejków eterycznych z drzewa
goździkowego: Corynobacterium, Pseudomonas;

W8

- biotransformacje Phe;
2. Produkcja waniliny de novo (toksyczna dla organizmów, które ją produkują i nie jest

możliwa jej konwersja) mutant Escherichia coli; nadprodukcja aminokwasów
aromatycznych (Trp); konwersja glukozy w kwas wanilinowy, odzyskiwany i redukowany
enzymatycznie do waniliny (dehydrogenaza alkoholu arylowego z

Nocardia crassa)

BIOTECHNOLOGICZNA PRODUKCJA AMINOKWASÓW

PRODUKCJA AMINOKWASÓW JEST MOŻLIWA:

•

na drodze syntezy chemicznej (D,L – Met)

•

na drodze syntezy enzymatycznej (L-Asp, L-Trp)

•

w procesie jedno- lub wielostopniowej biosyntezy

•

zastosowanie aminokwasów: przemysł spożywczy, paszowy, medycyna, przemysł
farmaceutyczny, chemiczny

aminokwasy

produkcja [t/rok]

mat. produkcji

zastosowanie

glutaminian sodu (sól

jednosodowa)

370 000

biosynteza

poprawia smak

potraw

L-Lys

70 000

biosynteza

wzbogacenie pasz

białkowych

(podawana krowom

w dawkach

10mg/dziennie

zwiększa ilość białka

w mleku o 10%,

ekonomicznie

opłacalne)

L-Asp, L-Phe

7 000

synteza

enzymatyczna,

biosynteza

aspartam (produkt

spożywczy jako

słodzik)

L-Cys

7 000

biosynteza

antyoksydant,

dodatek do chleba

D,L-Met

70 000

synteza chemiczna

wzbogacenie pasz

białkowych

(podawana krowom

w dawkach

10mg/dziennie

KWAS WANILINOWY

KWAS FERULOWY

50

zwiększa ilość białka

w mleku o 10%,

ekonomicznie

opłacalne)

DO MIKROBIOLOGICZNEJ PRODUKCJI AMINOKWASÓW WYKORZYSTUJE SIĘ:

•

Corynobacterium glutamicum

•

Bravibacterium flavum

W8

-

G(+), katalazododatnie,

-

morfologicznie zmienne: tlenowce lub względne beztlenowce w warunkach
tlenowych: substrat

→

CO

2

+ H

2

O;w warunkach beztlenowych: fermentacja mlekowa

-

mezofile

-

niskie wymagania pokarmowe (źródło N – nieorganiczne, C – mono-, disacharydy,
kwasy tłuszczowe, alkany),

-

brak aktywności proteolitycznej (bardzo niskie)

-

naturalne auksotrofy w stosunku do biotyny bądź tiaminy,

Wspólne cechy tych bakterii: w sprzyjających warunkach produkują i wydzielają poza komórkę kwas
glutaminowy (duże ilości); bardzo prosty materiał pierwotny: manipulacje dają zmodyfikowane
ścieżki metaboliczne, tak aby była możliwość nadprodukcji materiału pierwotnego.

1.

KWAS GLUTAMINOWY
Kiedyś

→

synteza metodą kwaśnej, ciśnieniowej hydrolizy bogatych w ten aa białek

pszenicy
Obecnie

→

jednostopniowa fermentacja

glukoza

PEP

szczawiooctan pirogronian

Corynebacterium glutamicum

cytrynian

dehydrogenaza glutaminianowa (duza aktywnosc)
dehydrogenaza alkoholowa (mala aktywnosc)

cis-akonitan

dodatek detergentu, penicyliny
(zmodyfikowana blona komorkowa-latwosc przenikania aa)

izocytrynian

ketoglutaran

glutaminian

dehydrogenaza glutaminianowa
dehydrogenaza 2-oksoglutaranu

Skład pożywki hodowlanej:

•

5

µ

g/l biotyna (stężenie nie może być większe, hamuje wzrost)

•

melasa buraczana (uboga w biotynę

•

(NH

4

)

2

SO

4

•

kreda (środek zobojętniający)

efektywna hodowla: napowietrzana, 30

0

C, 40 – 72 h

→

wydajność 50%

tzw. bakterie kwasu
glutaminowego

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

51

W8

Bakterie wykorzystujące inny cukier niż glukoza, np. Corynebacterium sp. R7. Wykorzystują
heksadekan i penicylinę lub Tween 80 ( wydajność 75 g/l), małe stężenie tiaminy.

2.

KWAS ASPARAGINOWY

Kiedyś

→

produkowany z soku asparagusa

Teraz

→

metody fermentacyjne, enzymatyczne

Zastosowanie:

•

medycyna: sól K, Mg (leczenie znużenia, chorób serca, wątroby, skurczów nóg u
diabetyków), sól Fe (anemia)

•

kosmetyka: związki powierzchniowo czynne L-Asp + B

6

(kremy rewitalizujące)

•

przemysł spożywczy (soki pomarańczowe, aspartam)

Metoda fermentacyjna:

•

glukoza: Brevibacterium flavum

•

kwas fumarowy: Bacillus, mutanty F. fluorescens, E. coli

Metoda enzymatyczna: wykorzystanie liaz do produkcji (L-Asp całkowicie nie rozpuszczalny w
wodzie, łatwy do wydzielenia)

CH – COOH



kwas fumarowy

CH – COOH

aspartaza

↑↓

amoniak

CH – COONH

4

CH

2

– COOH





CH – COONH

4

CH

2

(NH

2

)COO

-

fumaran amonu

L-Asp

(zw. nierozpuszczalny w wodzie)

Stosuje się do tego celu specjalne kolumny wypełnione immobilizowanymi komórkami
Escherichia coli, jako nośnika używa się roztworu fumaranu amonu.

kolumna z immobilizowanymi komórkami E. coli

odciek

kryształy L-Asp

W8
BIOTECHNOLOGIA PRODUKCJI KWASÓW ORGANICZNYCH

1. KWAS CYTRYNOWY

- otrzymywany na drodze biologicznej

Zastosowanie:

•

przemysł spożywczy (80%):

metody mało wydajne; trudne do
kontroli

CH

2

– COONH

4

+



CH

2

(NH

2

)COOH

sól amonowa L-Asp

roztwór 1,2 M fumaranu amonu + 1mM Mg

2+

pH 8,5
37

0

C

powolny przepływ

zmiana pH 2,8, 60% H

2

SO

4

ochłodzenie do 15

0

C

odwirowanie
przemycie wodą

OH

HOOC

COOH

COOH

52

o

składnik konserw – obniża pH

o

inaktywacja oksydaz (oksydazy odpowiedzialne za ciemnienie owoców)

o

kompleksuje Me powodujące jełczenie tłuszczów

•

przemysł metalurgiczny: czyszczenie powierzchni metali przed spawaniem

•

przemysł farmaceutyczny:

o

dodatek do tabletek musujących

o

cytrynian sodu wykorzystywany jest jako preparat zapobiegający krzepnięciu krwi w
stacjach krwiodawstwa

•

przemysł chemiczny:

o

detergenty (wyparł biodegradowalne fosforany)

o

plastyfikatory, stosowane w mleczarniach do usuwania „kamienia mlecznego”;

Producenci:

•

Aspergillus niger

•

Aspergillus wenti

•

Candida sp.

Otrzymywanie kwasu cytrynowego (300.000 t/rok)

a) metoda powierzchniowa: dwie fazy w systemie jednostopniowym
1 faza – rozwój grzybni (72h)
2 faza – koniec rozwoju grzybni, właściwa produkcja kwasu cytrynowego

Surowiec: melasa buraczana (pozostałość po produkcji cukru) rozcieńczona do 16% zawartości
sacharozy + sole mineralne (KH

2

PO

4

, ZnSO

4

x7H

2

O, K

4

Fe(CN)

6

)

•

rozlanie sterylnej pożywki na system tac

•

zaszczepienie zawiesiną konidiów w węglu aktywnym

•

wzrost grzybni (dojrzała grzybnia 2-3cm)

•

produkcja kwasu cytrynowego (za produkcję odpowiedzialna jest część grzybni stykającej się
z powierzchnią pożywki)

•

wydzielenie produktu (metoda cytrynianowa i bezcytrynianowa)

•

wydajność 70%, proces trwa ok. 200h

•

istnieje zagrożenie zarażeniem mikrobiologicznym

b) metoda wgłębna:

•

opiera się na wykorzystaniu bioreaktorów (50 –100m

3

)

•

warunkiem wydajności procesu jest surowiec o dużej masie i wyższej klasie czystości (cukier
handlowy, soki cukrownicze, mączki cukrowe, hydrolizaty skrobiowe)

•

zaszczepienie: konidia lub grzybnia indukcyjna

W8

•

warunki: zamknięty reaktor, dozowanie po wysterylizowaniu, niskie pH 2,5 – 3

( nie sprzyja zakażeniom)

•

czas 120 –168 h, temperatura 30 –32

0

C

•

pożywka mineralna (sole)

→

wydajność 80%

•

normy spożywczego kw. cytrynowego muszą być spełnione (cukier handlowy, soki
cukrownicze, mączki cukrowe, hydrolizat skrobiowy)

•

problemy bioinżynieryjne:

o

wzrost w stałej objętości,

o

zmiana środowiska zewnętrznego,

o

zmiana gęstości,

o

specjalne bioreaktory;

•

problem z melasą buraczaną (mało wydajna)

2. KWAS MLEKOWY = kwas 2-hydroksypropionowy

COOH



HO – C – H



CH

3

związek optycznie
czynny (L,D, racemat)

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

53

•

zależy od tego czemu ma służyć kwas mlekowy, ceny i dostępności surowca

•

surowce: melasa buraczana, trzcinowa, serwatka, ługi posiarczynowe

•

przedsiębiorstwo „Akwawit”: sacharoza + kiełki lub ekstrakt drożdżowy; Lactobacillus
delbrueckii; temp. 50 –55

0

C, 2-8 dni, neutralizacja Ca(OH)

2

→

95%

•

pleśnie: Rhizopus oryzae; mogą wykorzystywać te same szlaki metaboliczne co bakterie
mlekowe, te które są zdolne do wytwarzania pojedynczych enancjomerów

•

hodowla wgłębna

Zastosowanie:

•

zakwaszanie i konserwacja przetworów i konserwantów owocowo-warzywnych

•

produkcja napojów chłodzących

•

przemysł garbarski, farbiarski, chemicznych

•

przemysł kosmetyczny, farmaceutyczny

3. KWAS GLUKONOWY = kwas pentahydroksykapronowy

O

H

OH

OH

OH

OH

COOH

•

otrzymywany metodami chemicznymi lub biologicznymi

•

oksydaza glukozowa: Aspergillus niger, Gluconobacter sp., Pseudomonas sp.

•

źródłem węgla jest glukoza

W8

Zastosowanie:

•

przemysł spożywczy: zakwaszacze produktów, sztuczny miód, kiełbasy, sery, napoje
gazowane, proszek do pieczenia

•

glukonian wapnia: związek łatwo przyswajalny przez zwierzęta

•

rozpuszczalnik skrzepów krwi

•

dodatek do antybiotyków: stabilność, rozpuszczalność, poziom we krwi

•

przemysł tekstylny: wybielanie i nabłyszczanie tkanin

•

przemysł metalurgiczny: jak kwas cytrynowy

•

glukonian sodu: automatyczne mycie butelek

•

glukonian potasu: ochrona instalacji przemysłowych

•

produkcja 50 000 ton/rok

α

-D-glukoza

β

-D-glukoza

D-glukozo-

δ

-lakton

D-glukozo-

γ

-laktan

kwas glukonowy

Aspergillus niger:

•

proces wgłębny

•

pożywka: 30% roztwór glukozy, P i N

•

pH 5,5 – 5,6

w roztworze wodnym ustala się
między nimi równowaga

oksydaza glukozowa: zawsze towarzyszą jej katalazy,

odszczepia 1C, dwa H, tworzy się lakton

54

•

ważny jest poziom napowietrzenia

•

proces trwa 60 – 70 h

•

wydajność 90%

Kwas glukonowy otrzymuje się jako roztwór 50% i wykorzystuje się go w przemyśle. Po zakończeniu
procesu kwas jest neutralizowany; otrzymaną sól neutralizuje się i oczyszcza.

5. KWAS OCTOWY

Surowiec: etanol, alkohole, wino, sfermentowany sok jabłkowy.

Metody otrzymywania:

a) powierzchniowa (orleańska)

– Acetobacter aceti
– temperatura 25 - 28

0

C

– najstarsza metoda
– samorzutna fermentacja wina w beczkach
– objętość 1/3 beczki zaszczepiona bakteriami

W8

– czterokrotnie odciąganie części zawartości
– otrzymujemy ocet winny

b) metoda ociekowa (wiązana): dwie odmiany

-

metoda stojakowa (przestarzała): mała wydajność 60 –80 % , trudna kontrola

-

metoda generatorowa: unieruchamianie bakterii octowej na nośniku np. pumeks,
kolby kukurydzy, wióry bukowe, koks;

-

zacier = brzeczka: dzieli się ją na 3 partie:

i. 50% zacieru w kolumnie: stężenia alkoholu ok. 4%

ii. 25% : stężenie alkoholu ok.. 3%

iii. 25%: stężenie alkoholu poniżej 3%

-

proces prowadzi się do momentu aż stężenie alkoholu wyniesie ok. 0,03%

-

14% EtOH (maksymalne stężenie alkoholu)

-

pożywka hodowlana 1 – 3% CH

3

COOH

-

stymulowany wzrost bakterii octowych (ekstrakt sodowy, drożdżowy, glukoza, sole
mineralne – N,P)

-

metoda fermentacyjna (metoda wgłębna):

i. fermentatory wyposażone w wężownice (utrzymują stałą temperaturę 30

0

C) i

system napowietrzający;

ii. proces jest szybki, okresowy, wysoce efektywny

iii. jedyna wada: produkt zanieczyszczony komórkami bakterii

iv. zacier: 10 –14% EtOH, 1- 3% kwas octowy, stymulatory wzrostu bakterii

octowych (glukoza, ekstrakt drożdżowy, sole mineralne)

v. materiał biologiczny – ocet spożywczy

vi. materiał chemiczny – kwas octowy dla celów technicznych

OCET BALSAMICZNY:

-

winogrona umieszczane są w beczce z drzewa kasztanowego o pojemności 100 l

-

po ich tłoczeniu otrzymuje się 70 l. świeżego moszczu., stężonych cukrów 16 –18%

-

zachodzi tu fermentacja alkoholowa i octowa

-

gotowanie na wolnym ogniu pod gołym niebem; 30 l koncentratu o stężeniu cukrów
30 –36%

-

chłodzenie w okresie zimowym, dekantacja w gąsiorkach

W9

POLISACHARYDY PRODUKOWANE PRZEZ MIKROORGANIZMY

Typy mikrobiologicznych polisacharydów:

•

egzopolisacharydy:

o

wydzielane na zewnątrz komórki

o

gumy

o

nierozpuszczalne w wodzie i nieszkodliwe dla człowieka

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

55

o

przemysł spożywczy i farmaceutyczny

o

jako koagulanty, emulsyfikatory

o

opłacalne pod względem ekonomicznym

•

wewnątrzkomórkowe

o

stanowią materiał zapasowy

o

komponenty ściany komórkowej

o

egzopolisacharydy (niektóre wydzielane w postaci kapsułek)

Producenci polisacharydów:

o

bakterie Gram +

o

bakterie Gram –

o

glony

o

grzyby

mikroorganizm

substrat

Polisacharyd

Azotobacter vinelandii sacharoza

polisacharyd

Zymononas mobilis

sacharoza

alginian

Sclerotium rolfsii

glukoza

skleroglukan

Aureobasidium campestris

sacharoza

pullan

Pseudomonas elodea

węglowodory

gellan

Xanthomonas campestris

laktoza

ksantan

Pod względem budowy polisacharydy dzielimy na:

•

homopolisacharydy: pullulan, dekstran

•

heteropolisacharydy: ksantan

•

proste

•

rozgałęzione

Pod względem niesionego ładunku:

•

kationowe

•

obojętne

•

neutralne

1. KSANTAN

•

produkowany przez Xanthomonas campestris

•

dodatek do żywności

•

naturalne pochodzenie mikrobiologiczne

•

otrzymywany na drodze fermentacji surowców węgla

W9

•

hydrokoloid zbudowany z glukozy, mannozy, i kwasu glukuronowego (3:2:2)

•

tworzy pseudoplastyczne roztwory

•

roztwory ksantanu oparte na: kwaśnym środowisku, działaniu enzymów i zmianach
temperatury

•

chemiczna i fizyczna stabilność = zagęszczanie produktów silnie kwaśnych, zasadowych

•

ksantan + mączka chleba świętojańskiego = żel elastyczny, termoodwracalny

Zastosowanie:

•

zagęszczacz i substancja żelująca: mleczne napoje fermentowane i niefermentowane,
musztarda, majonez, kisiel, galaretka, marmolada, sery, dżemy, sery topione, twarogi

•

emulgator i substancja żelująca: mieszaniny masła i tłuszczów roślinnych, napoje z
cząsteczkami owoców

2. DEKSTRAN

•

nośniki do wypełnień kolumny

56

•

homopolimer z cząsteczkami

α

-

∆

-glukozy połączonymi w pozycjach 1,6-

α

-1,6-glukan: płyny

infuzyjne (polimery 30 – 70kDa)

•

Leuconostoc mesenteroides: zdolny do przeprowadzania fermentacji, wykorzystuje sacharozę,
w podłożu musi zawierać mało aminokwasów

•

dekstrenosacharoza: transglukozydaza; hydroliza cząsteczki glukozy na dekstran

•

produkcja materiałów chromatograficznych, żeli dekstranowych, Sephadex

3. ALGINIAN

•

produkowany głównie przez glony morskie

•

źródło Azotobacter vinelandii

•

polisacharyd liniowy zbudowany z kwasu

∆

-mannozopiranosylurowego (

β

-1,4) i kwasu

glukoronowego (

α

-1,4)

•

nośnik do immobilizacji enzymów

4. PULLULAN

•

biały proszek bez smaku i zapachu, dobrze rozpuszczalny w wodzie, nie rozpuszcza się w
metanolu i acetonie

•

liniowy egzopolisacharyd

•

podstawowa jednostka tri- lub tetrasacharyd

•

Zastosowanie:

•

osłonki produktów spożywczych

•

substytut skrobi – żywność niskokaloryczna

•

modyfikacja chemiczna –produkcja torebek, pudełek (częściowa estryfikacja: folie
nierozpuszczalne w wodzie)

•

dodatek plastycyzerów (poprawia plastyczność)

•

kosmetyki, laminaty, włókna podobne do jedwabiu

W9

Proces produkcji polisacharydów pochodzenia mikrobiologicznego
- kontrola na poziomie środowiska hodowlanego

•

pożywka:

o

Xanthomonas campestris = ksantan

o

Azotobacter vinelandii = alginian

•

temp, pH, stężenie O

2

, rozp.CO

2

- kontrola na poziomie sprzętowo –technologicznym

Problemy inżynieryjne: wydzielanie i oczyszczanie produktu.


TŁUSZCZE I OLEJE POCHODZENIA MIKROBIOLOGICZNEGO

Rośliny oleiste = soja, orzeszki ziemne, bawełna, rzepak, słonecznik, oliwki, itp.

Przemysł
spożywczy

margaryny, tłuszcze do
pieczenia, majonezy, olej
sałatkowy, lody,
cukiernictwo

olej sojowy, z orzeszków
ziemnych, rzepakowy,
oliwa z oliwek

Przemysł
kosmetyczny

kosmetyki, leki

olej kokosowy, palmowy,
rycynowy

Przemysł
chemiczny

detergenty, surfaktanty,
mydła woski, wybielacze,
plastiki

olej palmowy, kokosowy
olej palmowy, sojowy
olej sojowy

Przemysł
metalurgiczny

olej palmowy

ograniczenie źródła węgla

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

57

Mikroorganizmy olageageniczne:

•

20 –25% biomasy w postaci lipidów

•

drożdże, pleśnie i inne mikroorganizmy eukariotyczne zawierają enzym liazę ATP cytrynianu

•

mikroorganizmy zawierające ten enzym zdolne są do przeprowadzania reakcji:

cytrynian + ATP +CoA

→

acetyloCoA + szczawiooctan + ADP +Pi

•

biosynteza tłuszczów – styren

Mikroorganizmy produkują lipazy, gdy pożywka zawiera odpowiednie stężenia źródeł N i C (C:N –
50:1).

Hodowla okresowa = wzrost biomasy do momentu wyczerpania źródła azotu (pozostające źródło C

→

produkcja lipidów)
Hodowla ciągła = ograniczenie dostępności do źródła N

PRODUCENCI LIPIDÓW
1. Bakterie:
- mycobakterie – Nocardia
- Arthrobacter – 80% biomasy w postaci lipidów (triacyloglicerole)

W9

•

poli-

β

-hydroksymaślan

o

produkowany w warunkach ograniczonego dostępu do źródła azotu;

o

synteza zależna od O

2

o

nierozpuszczalny w chloroformie, dlatego jest klasyfikowany jako lipid

o

polimer zapasowy

o

biodegradowalny plastik; producent : Alcaligenes enthropus (70 – 80% masy w
postaci polimeru)

•

woski: Acinetobacter; proste estry kwasów tłuszczowych i alkoholi tłuszczowych, pożywka z
bursztynianem jako źródłem węgla lub octanem (10-25% lipidów) oraz alkohole tłuszczowe –
wysoka wydajność

2. Glony:

§ oleje-do 70% Chlorella perenoiclosa
§ przejściowe produkty olejów napędowych

W10
2,3-BUTANODIOL

1906r. – odkrycie 2,3-butanodiolu w płynie pohodowlanym Klebsiella pneumoniae
II w. św. – przemysł zbrojeniowy
obecnie – paliwo płynne, prekursory pianek, atramenty, farby drukarskie, plastyfikatory, materiał
wybuchowy

•

producenci:

o

Klebsiella pneumoniae

o

Klebsiella oxytoc

o

Enterobacter aerogenes

o

Serratia marcescens

o

Bacillus subtilis

o

Bacillus polymyxa

•

substraty:

o

Klebsiella oxytoca = melasy, enzymatycznie hydrolizowane zaciery zbożowe,
zhydrolizowana skrobia, pszenica, hydrolizaty drewna, odpady posiarczynowe

o

Bacillus polymyxa = skrobia kukurydziana, pszeniczne zaciery (enzymy
amylolityczne)

•

warunki fermentacji: pH 5-6,5, temp. 37

o

C, O

2

, stężenie substratów 5-10%

•

biochemia procesu:

58

glukoza

pentan

frutozo-6-fosforan + aldehyd-3-fosfoglicerynowy

2-pirogronian

acetoina

diacetyl

2,3-butanodiol

•

produkty otrzymywane z 2,3-butandiolu

o

2-buten

o

1,3-butadien

o

estry butanodiolu

o

eter tetrametylowy

o

MEK

GLICEROL

•

zastosowanie: przemysł spożywczy, kosmetyczny, farmaceutyczny, chemiczny, materiał
wybuchowy (pochodne estrowe)

•

dodatek siarczku sodu

→

drożdże zamiast etanolu wytworzą glicerol

W10
ENZYMATYCZNA SYNTEZA TLENKÓW ALKENÓW

O

2

propylen, Cl

-

, H

2

O

2

chlorek hydroksypropylenu

H

-

Cl

-

tlenek propylenu

ALKOHOL ETYLOWY = ETANOL

•

CH

3

CH

2

OH

•

przemysł spożywczy, odczynnik chemiczny, rozpuszczalnik, paliwo

•

proces fermentacji cukrów z wytworzeniem alkoholu jest szeroko rozpowszechniony w
przyrodzie

•

produkcja przemysłowa: gorzelnicze odmiany drożdży: Saccharomyces cerevisiae, w USA:
Saccharomyces cerevisiae+ Candida+ Kluyveromyces

•

cechy drożdży gorzelniczych:

o

wysoka aktywność fermentacyjna

o

wydajność produkcji biomasy

o

wysoka stabilność cech morfologicznych i fizjologicznych

o

odporność na temperaturę >30

o

C

glikoliza

CO

2

oksydaza
2-pyranosowa

chloroperoksydaza

epoksydaza

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

59

o

odporność na duże stężenia etanolu w pożywce

o

zdolność do fermentowania brzeczek o podwyższonej zawartości cukrów (nawet ok.
50%)

•

fermentacja alkoholowa: piwowarska, winiarska, gorzelnicza

•

surowce do produkcji alkoholu etylowego

o

surowce skrobiowe – kukurydza, żyto, ziemniaki, jęczmień, owies, sorgo, ryż

o

surowce zawierające mulinę – łopian, buraki

o

surowce zawierające cukry proste i oligocukry – melasa, sacharoza, serwatka, buraki
paszowe, owoce, soki owocowe

o

surowce zawierające celulozę – drewno i jego odpady, torf, ługi posiarczynowe,
trawa, słoma

•

surowce zawierające skrobię: oczyszczanie, obróbka termiczna, obróbka enzymatyczna

•

przygotowanie słodu gorzelnianego:

α

-amylaza,

β

-amylaza,

α

-glukozydaza, glukozydaza

amylopektynowa, oligo-1,6-glikozydaza

•

warunki procesu:

o

14 – 16 dni, temperatura 8 – 10

o

C, półmrok

o

rozdrobnienie i ługowanie enzymów wodą = mleczko słodowe

W10

o

zacieranie = przemiana skleikowanej skrobi na cukry w temp. 55

o

C

o

α

-amylaza: pH op. 5-6, temp. op. 70

o

C

β

-amylaza: pH op. 4-5, temp. op. 40 –50

o

C

•

preparaty enzymatyczne scukrzające skrobię:

o

termamyl – Bacillus lichenifornis

o

SAN – Aspergillus niger

o

Fungamyl – Aspergillus oryzae

o

BAN – Bacillus subtilis

•

przygotowanie drożdży gorzelnianych

o

namnożenie przez ok. 20h na przecieku drożdżowym

o

dobre rezultaty – immobilizacja

§ mniejsza zależność od zmian kwasowości i temperatury
§ mniejsze ryzyko zakażenia
§ mniejsze koszty inwestycyjne i energochłonność
§ szybkość i wydajność produkcji

•

fermentacja:

o

I = zafermentowanie 18 –20h, powolny wzrost

II = fermentacja główna 20 –22h, temp. max 30

o

C

III = defermentowanie 20 – 30h, temp. 25 –26

o

C

o

zacier dojrzały zawiera 8 –12% alkoholu

o

produkty uboczne: kwas octowy, bursztynowy, aldehyd octowy, estry, wyższe
alkohole (fuzle)

o

teoretyczna wydajność:

C

6

H

12

O

6

→

2C

2

H

5

OH + 2CO

2

100g glukozy

→

51,5g EtOH

o

wydajność praktyczna:

45 – 48g metanolu / 87 – 94% w stosunku do wydajności teoretycznej

o

proces fermentacji surowców zawierających cukry proste lub dwucukry nie wymaga
stosowania słodu scukrzających preparatów enzymatycznych

•

poszczególne surowce:

o

melasa: rozcieńczenie, sterylizacja, proces okresowy, ciągły i półciągły

o

serwatka: Kluyveromyces; 42 l serwatki (4,4% laktozy) = 100% EtOH

o

surowiec zawierający celulozę: hydroliza

•

destylacja

napój destylowany

surowiec

Wódka

ziemniaki, zboże

Scotch Whisky

jęczmień

Irish Whisky

jęczmień, pszenica, owies, ryż

Canadian Whisky

ryż

Gin (1650r)

ziarna zbóż, owoce jałowca

Aquavit

ziemniaki, ziarna zbóż, kminek

70% skrobi:

•

80% maltoza

•

20% dekstryny, glukoza

60

Tequilla

sok kaktusa Agare Aequilana

Kirchwasser

sok wiśniowy

Brandy

owoce

Cognac

białe winogrona

Rum

trzcina cukrowa

W11

METALWORKING FLUIDS

W procesie obróbki metali stosowane są różne substancje ciekłe, które spełniają trzy podstawowe
funkcje:

1. chłodzenie
2. smarowanie
3. odprowadzanie drobin i opiłków

Ciecze niewodne oraz na bazie wody.

Drobnoustroje zasiedlające ciecze na bazie wody:

•

szczepy Pseudomonas = duże zdolności adaptacyjne do niekorzystnych warunków życia,
wykorzystują składniki organiczne, tak więc:

o

utleniają alkany do kwasów tłuszczowych

o

przeprowadzają

β

-oksydację kwasów tłuszczowych

o

przeprowadzają deaminację aminy

o

hydrolizują sulfoniany ropy naftowej

o

degradują inhibitory korozji

co powoduje zmiany w charakterze substancji (dekoloryzacja, zmiana pH) i przygotowania
środowiska życia dla anaerobów

•

szczepy anaerobów Desulfovibrio = nigdy nie pojawiają się, gdy zasiedlą środowisko bardzo
trudno się ich pozbyć; smród H

2

S

•

grzyby wszędobylskie Cephalosporium, Fusarium, Aspergillus, Penicillium, Cladosporium,
Candida:

o

zdolne do przetwarzania w obecności dużych populacji Pseudomonas

Detekcje (wykrywanie) mikroorganizmów w cieczach związanych z obróbką metali:

•

redukcja błękitu metylowego = populacje Pseudomonas

•

oznaczanie poziomu ATP

•

stężenie O

2

uwalnianego z H

2

O

2

przez katalazę komórkową

•

radiospirometria, konduktometria, kalorymetria – nie są wykorzystywane

Choroby ludzi:

•

1978r. – 250 pracowników zakładów Forda „Ford – Pontiac Fever”

•

związane z obecnością biocydów

Problemy ze stosowaniem biocydów.
Nie ma środka uniwersalnego i zawsze skutecznego.
Przykładowe biocydy: Dowcide, Bioban, Tris Nitro, Vancide TH.








W11

SCO = Single Cell Oil

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

61

•

Do SCO nie zalicza się wosków,

•

zalicza się te, które mają strukturę triacylogliceroli

•

główni producenci: glony, grzyby (pleśnie, drożdże)

•

idealny substrat powinien zawierać taki sam stosunek reszt (2 nasycone : 1 nienasycone
łańcuchy)

Olej z drożdży jako odpowiednik masła kakaowego

H

33

C

17

OC

O

CH

CH

2

O

CH

2

O

CO

CO

C

17

H

35

C

18

H

37

CBE = substytut masła kakaowego (16:0, 18:0,18:1)

O

2

R

R1

CH

2

R1

CH

2

CH

2

R

R1

CH

R

CH

NADPH

NADP+

desaturaza

inhibitor

2 H

2

O

Mutagenaza = Candida curvata

→

nieaktywna desaturaza

POLINIENASYCONE KWASY TŁUSZCZOWE

•

prekursory prostaglandyn, leukotrienów, tromboksanów

•

EPA i DHA polecane przy profilaktyce chorób serca

•

kwasy

γ

-linolenowe (GLA) – egzema

o

kwas

γ

-linolenowy (GLA) – Mucorcircinelloides

o

kwas dihomo-

γ

-linolenowy – Mucorcircinelloides

o

kwas arachidonowy (ARA) – Mucorcircinelloides

o

EPA – powstaje w wyniku działania

∆

17 desaturazie działąjącej na ARA

20% zawartości lipidów u grzybów Mortierella i Pythium, glon Porphyridium cruentum 40% lipidów

W11

•

DHA = grzyby morskie (Tchranstochytrium aureum) – 50% lipidów komórkowych, brak EPA

•

bakterie produkują PUFAs – Altermonas, Shewanella, Flexibacter, Vibrio = produkcja
przemysłowa EPA możliwa dla Shewanella putrifaciens (15 – 18 g biomasy, 12 –18 h, 10 –15
% biomasy to lipidy w tym 25 –40 % EPA)

PERSPEKTYWY W AGROBIOTECHNOLOGII

Nowa agrobiotechnologia bazuje na inżynierii genetycznej, biologii molekularnej i mikrobiologii
stosowanej.

XX w. - biotechnologia mikroorganizmów

MASŁO KAKAOWE

62

XXI w. - biotechnologia roślin i zwierząt

Cel wprowadzenia:

•

zwiększenie wydajności plonów

•

aby rolnictwo było przyjazne dla środowiska

TECHNOLOGIE GENOWE

Strategia doskonalenia rolnictwa zawsze koncentruje się na:

•

dobór odpowiednich upraw

•

zarządzanie ziemią i wodą

•

walce ze szkodnikami i ochronie upraw

Wprowadzanie do środowiska organizmów transgenicznych musi mieć wpływ na te czynniki.

ROŚLINY TRANSGENICZNE

produkt

status

Producent

rośliny odporne na stres (susze,
zasolenie)

próby
polowe

zboża zdolne do wiązania N

2

z

genami roślin strączkowych

wczesne
badania

rośliny z tolerancją na pestycydy w handlu

Monsanto
Calgene
Dupont

owoce i warzywa odporne na
wirusy

próby polne

Asgrow

jadalne szczepionki

badania

pomidory z opóźnionym
dojrzewaniem

w handlu

Calgene

W11

ZWIERZĘTA TRANSGENICZNE

produkt

zwierzę lub jego
produkt

status

p/ciała monoklonalne

mleko krów

hormon wzrostu

tilapie (ryba)

próby
polowe

MIKROORGANIZMY TRANSGENICZNE

produkt

status

chymozyna

Zaakceptowane przez FDA

MIKROORGANIZMY W ROLNICTWIE (BIONAWOZY)

Rhizobie wiązanie N

2

rośliny strączkowe

Cyanobacterie wiązanie N

2

ryż

mikoryza

P,N,S

drzewa szpilkowe

kompost

żyzność gleby

rośliny

CZYNNIKI BIOKONTROLI

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

63

-

biopestycydy

-

bioinsektycydy

-

bioherbicydy

-

inne: diagnostyka, bioremediacja

Biotechnologiczne doskonalenie roślin a środowisko:
2001r. – 52 mln hektarów upraw roślin transgenicznych (39 mln hektarów w Ameryce Płn)

Biotechnologia roślin rozwija się w dwóch kierunkach:

1. technik umożliwiających selekcję genetyczną rekombinantów przyśpieszających uzyskanie

nowych odmian roślin

techniki markerów molekularnych– łatwy i szybki sposób oceny segregującej populacji przez
co skraca się czas selekcji określonego genotypu

mapowanie molekularne- służy do identyfikacji miejsca, w którym znajdują się określone
geny co może być wykorzystane w doborze komponentów do krzyżowania

techniki kultur in vitro, techniki mikrorozmnażania, otrzymywanie podwojonych haploidów,
technika fuzji protoplastów i uzyskiwania mieszańców somatycznych

2. modyfikacji genetycznej

W11

MOŻLIWOŚCI MODYFIKACJI GENETYCZNEJ W PRZYKŁADZIE GENÓW
WARUNKUJĄCYCH ODPORNOŚĆ

Geny roślinne kodujące:

•

inhibitory enzymów trawiennych owadów

•

toksyczne substancje (lektyny, chitynazy, alkaloidy)

•

białka

•

białka antywirusowe

•

naturalne geny gospodarza kodujące odporność na patogeny

Geny patogenu lub mikroorganizmu niepatogenicznego:

•

geny białek wirusa

W celu zapewnienia długotrwałego i silnego efektu ochronnego produktu trans genezy powinny
cechować się szerokim spektrum działania, np. gen B

s

2 z papryki- produkty rozpoznają białka

awirulencji bakterii Xanthomonas campestris , X. Oryzae gen X

a

21 z ryżu- produkty rozpoznają

białka awirulencji bakterii Xanthomonas campestris , X. oryzae

Korzystny efekt można też uzyskać poprzez optymalizację

KIERUNKI ROZWOJU TECHNIK TRANSFORMACJI

•

metody transformacji za pomocą Agrobacterium jako system bardziej precyzyjny niż
transformacje bezpośrednie

•

transformacje chloroplastów jako metoda znacznie zwiększająca ilość produktu i
umożliwiająca poziome rozprzestrzenienie się transgenów

•

transformacja in plane

•

precyzyjne transformacje do wybranego miejsca w genomie

•

użycie nowych markerów selekcyjnych do selekcji pozytywnej

•

rozwój metod eliminacji genów selekcyjnych

64

ROŚLINY TRANSGENICZNE JAKO PRODUCENCI WAŻNYCH DLA CZŁOWIEKA
PRODUKTÓW

•

oleje roślinne

•

węglowodany

•

białka – szczepionki, przeciwciała, biofarmaceutyki (somatotropina), białka przemysłowe

•

tytoń i ziemniaki

•

przeciwciała – większa aktywność biologiczna niż przeciwciała monoklonalne

o

przeciwciała IgA z tytoniu przeciwko mikroorganizmom powodującym gnicie zębów
u ludzi

•

biofarmaceutyki – hormony

o

somatotropina = w chloroplastach tytoniu

W11

ROŚLINNE SZCZEPIONKI BAKTERYJNE

Nawóz bakteryjny (szczepionka bakteryjna)- preparat składający się z gleby, substancji odżywczej
oraz szczepu drobnoustroju, który może:

•

wzbogacać glebę w określony składnik pokarmowy (szczepionki wzbogacające w związki
azotu

•

mobilizować procesy przekształcania związków chemicznych niedostępnych dla roślin w
związki dostępne (szczepionki immobilizujące)

SZCZEPIONKI WZBOGACAJĄCE

•

Nitragina – Rhizobium

•

Azotobakteryna (nie tylko do roślin motylkowych) – Azotobacter (występuje tam gdzie dużo
związków organicznych)

SZCZEPIONKI IMMOBILIZUJĄCE

•

Fosfobakteryna – Bacillus megaterium (zdolność mineralizacji wiązań fosforowych)

•

szczepionki oparte o siderofory

•

szczepionki oparte o mikoryzę (współdziałanie roślin wyższych z grzybami)- w leśnictwie

o

zewnętrzna – obrasta korzenie, nie wnika do wnętrza

o

wewnętrzna – przebija skórę, przerasta strzępkami

BIOINSEKTYCYDY

mikroorganizm

cel

sposób otrzymywania

Bacillus

thuringensis

larwy Leptidopteran
larwy Dipteran

fermentacja

w handlu

Bacillus popilae

żuki japońskie

w handlu

Bacillus sphaericus

larwy komarów

fermentacja

Beauveria bassiana

różne

fermentacja

Hirutella thompson

roztocza cytrusów

fermentacja

w handlu

Verticillum lecani

mszyce w szklarniach

fermentacja

w handlu

W12

OCHRONA ŚRODOWISKA

Biotechnologia w ochronie środowiska

Tworzenie zintegrowanych systemów ochrony środowiska:

•

wydobywanie surowca

•

transport surowca do punktu przerobu

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

65

•

przetwarzanie surowca

•

eksploatacja urządzeń procesu technologicznego

•

zagospodarowanie surowców ubocznych, odpadów, ścieków

LCA - cykl życia produktów

Strategie odpadów:

•

unikanie ich powstawania lub zmniejszenie ich ilości i szkodliwości

•

materiałowe i energetyczne wykorzystanie odpadów

Metody czyszczenia ścieków:

•

mechaniczne

•

fizykochemiczne

•

biologiczne

Złoże biologiczne - mikroorganizmy zamieszkujące błonę biologiczną, przez którą przesączają się
ścieki

Bioremediacje - użycie biologicznych układów w celu redukcji wielkości zanieczyszczenia
środowiska lub transformacji różnego rodzaju zanieczyszczeń w formy mniej szkodliwe

•

bioremediacje podstawowe = naturalna mikroflora skażonego terenu jest wykorzystywana
do obniżenia substancji toksycznych w środowisku do bezpiecznego poziomu w określonych
i akceptowalnych ramach czasowych ( z naszej strony żadnych działań tylko monitoring)

•

biostymulacja = np. natlenianie i wprowadzanie pożywek, wzbogacanie w azot i fosfor;
zależy od pH, zasolenia i wilgotności

•

bioaugmentacja = (wprowadzenie obcej mikroflory gdy bioremediacja podstawowa i
biostymulacja zawodzą) = wzbogacanie zanieczyszczonego terenu w specjalnie
wyselekcjonowane mikroorganizmy o dużej zdolności biodegradacji zanieczyszczeń

Przeprowadzanie bioremediacji:

•

in situ = na miejscu

•

ex situ

Rodzaj i miejsce
skażenia

Koszt metody
konwencjonalnej

Koszt bioremediacji

Różnica

grunt skażony
węglowodanami
pochodzenia
petrochemicznego

wydobycie gruntu i
oczyszczenie ex situ
3 mln $

biowentylowanie
0,2 mln$

2,8 mln $

W12

Zalety:

•

procesy ekonomiczne

•

możliwość prowadzenia procesu in situ

•

grunt nadaje się do użytku bezpośrednio po przeprowadzeniu procesu oczyszczania

•

nie wymaga stosowania kosztownej i skomplikowanej aparatury

Ograniczenia:

•

rodzaje skażenia

•

warunki panujące w mieście

•

skażenie czasowe

Technologie te znajdują szczególne zastosowanie przy remediacji gruntów i wód gruntowych
skażonych:

•

produktami ropopochodnymi, benzenem, toluenem, paliwami, benzyną

•

produktami organicznymi: pestycydami, rozpuszczalnikami, środkami do impregnacji drewna

•

metalami ciężkimi

FITOREMEDIACJE - technologia oczyszczania środowiska, która wykorzystuje naturalne
zdolności roślin do pobierania i gromadzenia substancji zanieczyszczających lub do ich biodegradacji

66

np. zanieczyszczenie metalami ciężkimi:

Cu:

mniszek > skrzyp> trawy > sałata > kukurydza

Cd:

tobołek > szpinak > sałata > wierzba > słoma, jęczmień > trawy

Typy fitoremediacji:

•

fitoakumulacje (fitoekstarkcje) - wnikanie do wnętrza roślin; nie ulegają one degradacji

o

wierzba

o

gryka

o

luceryna

•

ryzofiltracje - rozwój roślin w środowisku wodnym

•

fitodegradacja - system korzeniowy, enzymy roślinne degradują toksyny

•

biodegradacja ryzosferyczna - roślina wydziela do środowiska związki degradujące toksyny

•

fitostabilizacje - wydzielanie związków do podłoża, unieruchamianie toksyn

•

fitoutlenianie =-transpiracja toksyn przez liście

•

kontrola hydrauliczna drzew

Zalety:

•

niski koszt nakładów inwestycyjnych

•

minimalne zakłócenie istniejących warunków środowiska

•

powszechna aprobata opinii publicznej

Ograniczenia:

•

wolne tempo oczyszczania

•

ograniczenie działania do płytkich warstw gleby

•

odpowiednio duże powierzchnie

W12

•

powolny wzrost i specyficzne wymagania oraz różna tolerancja na inne zanieczyszczenia
gleby

•

nie pomocne w wielu przypadkach

•

toksyczność i biologiczne własności produktów biodegradacji

•

przenikanie do żywności

•

niska efektywność w przypadku zanieczyszczeń, silnie zaobserwowanych na następnych
glebach

BIOGEOCHEMIA - zajmuje się rolą organizmów żywych w procesach obiegu pierwiastków w
przyrodzie, ich przemieszczaniem, akumulacją, tworzeniem i rozkładem minerałów oraz skał

Metody wymywania pierwiastków:

1. techniki laboratoryjne – perkolator - technika hodowli wstrząsanej; metoda zamkniętej kolby

ekologicznej; wymywanie pod ciśnieniem

2. metody in situ - hałdy niskoprocentowych rud „hole to hole”, „hole to mine”

Czynniki warunkujące efektywność wymywania pierwiastków:

•

dostępność tanich źródeł wody

•

odpowiedni skład rudy

•

dobór odpowiedniego szczepu

•

odczynniki chemiczne

M I K R O B I O L O G I C Z N E R E A K C J E G E O C H E M I C Z N E
O Z N A C Z E N I U P R A K T Y C Z N Y M

1. BIOGEOCHEMIA Cu:

•

wymywanie Cu związane jest z reakcjami utleniania związków towarzyszących czyli
związków siarki i żelaza: H

2

SO

4

, FeSO

4

, Fe

2

(SO

4

)

3

•

Thiobacillus thiooxidans, Thiobacillus ferroxidans

•

piryt:

FeS

2

+ 7O

2

+ H

2

O

→

2FeSO4 + H

2

SO

4

•

chalkopiryt: Fe S

2

+ 7,5O

2

+ H

2

O

→

Fe

2

(SO

4

)

3

+ H

2

SO

4

•

chalkozyn: Cu

2

S + 2Fe

2

(SO

4

)

3

→

2CuSO

4

+ 4FeSO

4

+ S

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

67

CuSO

4

+ Fe

2+

→

FeSO

4

+ Cu

2+

Piryt towarzyszy
związkom miedzi

Cu

2

S

Chalkozyn

S

2-

+

CuFeS

2

Chalkopiryt S

2-

, Fe

2+

-

CuS

kowelin

S

2-

+

2. BIOGEOCHEMIA Zn:

Skład chemiczny

Nazwa minerału

ZnS

Sfaleryt

ZnO

Cynkit

ZnCO

3

Smitsonit

Zn

2

(SiO

4

)

Wilemit

Zn

4

(OH)

2

(SiO

7

) x H

2

O

Kupryt

•

Thiobacillus ferrooxidans:

ZnS + 2Fe

2

(SO

4

)

3

+ O

2

→

ZnSO

4

+ 4FeSO

4

+ 2H

2

SO

4

H

2

SO

4

= ułatwia wymywanie, zakwasza środowisko, stwarza warunki dla wzrostu

Thiobacillus ferroxidans

3. BIOGEOCHEMIA URANU:

Podatność na
wymywanie
mikrobiologiczne

UO

2

Uraninit

+

Guninit

+

Bekerelit

+

Kofinit

-

238

U +

235

U +

234

U - naturalny uran

W13

AKUMULACJA METALI PRZEZ MIKROORGANIZMY

1. Usuwanie metali ciężkich ze środowiska przez mikroorganizmy wynika z:

•

powierzchni wiązania metali przez reaktywne polimery i makrocząsteczki osłon
komórkowych

•

wewnątrzkomórkowe wiązanie metali

Oporność mikroorganizmów na metale ciężkie wynika z obecności systemów komórkowych
umożliwiających:

•

wydalanie metali na zewnątrz komórki

•

akumulację wewnątrz komórki

•

mechanizmy enzymatyczne prowadzące do powstawania form mniej toksycznych

BIOSORPCJA - usuwanie metali ze środowiska

2. Mechanizmy usuwania metali ciężkich:

•

powierzchniowe wiązanie metalu:

o

procesy wymiany jonowej = ważna rola grupy COOH, fosforanowa (występują jako
składniki błon komórkowych)

o

tworzenie trwałych kompleksów = grupy COOH, OH, NH

3

(powinowactwo do

elektrododatnich metali)

68

o

rola białka (Cd: chityna; Cu, Co: mannan)

o

różnice w efektywności usuwania metali u bakterii Gram (+) i Gram (–) (różna
budowa ściany komórkowej); Gram (+) 10x efektywniej wiążą metale, ponieważ mają
wielowarstwową ścianę co umożliwia wiązanie jonowe z metalem)

o

ważne jest jakie mikroorganizm posiada otoczki, warstwy śluzowe (ułatwiają
wiązanie metalu)

•

zmiana pH środowiska:

o

zmiana odczynu powoduje przesunięcie równowagi chemicznej pomiędzy formami
metali w roztworze, a pośrednio ma wpływ na powinowactwo adsorpcyjne metalu do
otoczek i ścian komórkowych

o

grzyby- obniżają pH środowiska

o

bakterie- podwyższają pH środowiska

o

w środowisku alkalicznym tworzą się trudnorozpuszczalne związki

o

w środowisku kwaśnym tworzą się łatworozpuszczalne związki

o

Alcaligenes denitrificans = usuwanie Cd związane jest ze zdolnością do silnej
alkalizacji środowiska (prowadzą proces denitryfikacji).

3. Pozakomórkowe wydzielanie przez mikroorganizmy substancji nieorganicznych i organicznych:

•

kwasy organiczne, białka przyłączają Cd i powstałe kompleksy są deponowane w obrębie
osłon komórkowych

•

mikroorganizmy redukujące siarczany do H

2

S wytrącają metale w postaci nierozpuszczalnych

siarczków

•

Citobacter sp. – Cd (pożywka z fosfoglicerolu, kwaśna fosfataza

→

−

2

4

HPO

, nierozpuszczalne

MeHPO

4

W13

4. Biotransformacje polegające na przemianie enzymatyczne j metalu (f. rozpuszczalne

→

f. mniej

rozpuszczalne):

•

reakcje utleniania i redukcji

•

reakcje metylacji i demetylacji

As – utleniany przy pomocy oksydaz do As (V)- mniej rozpuszczalny i łatwiej strącany przez
fosforany czy FeCl

3

Cr(VI) – redukcja do Cr(III) Enterobacter elocae
Hg – Aeromonas hydrophila (proces dwuetapowy)

5. Akumulacja metali:

•

metalotioneiny (duża ilość grup tiolowych) = politiolowe polipeptydy

zawierające duże ilości (30%) Cys – Zn, Cu, Ag, Sn, Mg, Cd

•

fitochelatony = glony, rośliny wyższe

•

drożdże = niskocząsteczkowe polifosforany (kumulacja metalu w postaci granulek)

ETAPY W PRZEMYSŁOWYCH PROCESACH USUWANIA METALI CIĘŻKICH ZE
ŚRODOWISKA

•

biosorpcja: w tym procesie można wykorzystywać:

o

mikroorganizmy stanowiące produkt uboczny w przemyśle farmaceutycznym czy
fermentacyjnym lub procesach oczyszczania ścieków

o

mikroorganizmy hodowane i namnażane na specjalnych podłożach i wykazujące
zdolności do efektywnego wiązania metali

o

biopreparaty: AMT – BIOCLAM

•

desorpcja i regeneracja biomasy

Unieruchamianie biomasy:

•

pasywne:

o

agregacja (biomasa mało odporna na uszkodzenia)

o

zasiedlenie nośników

o

zastosowanie związków chemicznych, np. aldehyd glukonowy

•

aktywne:

o

specjalne nośniki modyfikowane chemicznie (silnego związanie biomasy z
nośnikiem)

białka indukcyjne = pojawiają się
gdy komórka ma kontakt z
metalem

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com

69

o

biomasa musi być zregenerowana, a metal odzyskany np. metodą elektrolizy

MEOR = Microbiologically Ennanced Oil Recovery (wydobycie ropy naftowej przy użyciu
mikroorganizmów)

•

złoża odpowiednie dla MEOR: pH 4-8

temp. <75

o

C

zasolenie < 10%
obecność fazy wodnej (decydująca)

•

w złożach panują warunki beztlenowe, jest na dużych głębokościach, panuje wysokie
ciśnienie, pH wody jest ekstremalne, bardzo wysokie zasolenie(warunki ekstremalne nawet
dla mikroorganizmów)

•

istnieją mikroorganizmy wykorzystujące węglowodory jako źródło węgla, ale tylko w
warunkach tlenowych (w złożu warunki beztlenowe), dlatego wraz z mikroorganizmami do
złoża wprowadza się substancje odżywcze

W13

•

w metodzie tej nie używa się bakterii wytwarzających polimery, bakterii fermentacyjnych,
kłaczkujących w celu uniknięcia zatkania por (miejsce iniekcji musi być czyste)

•

problem dyspersji- mikroorganizmy wprowadzane jako zawiesina wodna, bakteria nie może
być większa niż por w skale (ważny rodzaj skały)

•

w złożu znajdują się mikroorganizmy, więc może dojść do interakcji z bakteriami przez nas
wprowadzonymi

•

charakter ropy zmienia się pod wpływem obecności mikroorganizmów (rozwój, wzrost), np.
utlenianie olejów do kwasów tłuszczowych – tworzą się detergenty

•

wzrost biomasy wypycha ropę na zewnątrz

Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk

PDF created with pdfFactory Pro trial version

www.pdffactory.com