BIOTECHNOLOGIA WYKŁADY

Biotechnologia:
- Integracja nauk przyrodniczych i inżynieryjnych w celu zastosowania organizmów, komórek lub ich części oraz molekularnych analogów w celu pozyskania produktów i usług (definicja wg EFB Europejskiej Fundacji Biotechnologii)
- Zastosowanie podstaw naukowych i inżynierskich do przetwarzania materiałów i czynników biologicznych w celu pozyskania dóbr i usług.

Różne kolory biotechnologii i ich rola.
Zgodnie z przyjętą przez OECD (jak i UE) klasyfikacją wyróżnić można następujące umowna działy biotechnologii, często określane kolorami :
▪ zielona biotechnologia, które stanowią przede wszystkim biotechnologia związana z rolnictwem, wykorzystywana w celach spożywczych i niespożywczych,
▪ czerwona biotechnologia – to biotechnologia wykorzystywana w ochronie zdrowie.
▪ biała biotechnologia to biotechnologia przemysłowa wykorzystująca systemy biologiczne w produkcji przemysłowej i ochronie środowiska,
▪ fioletowa biotechnologia zogniskowana wokół zagadnień społecznych i przemysłowych, jak akceptacja społeczna, legislacja, własność intelektualna czy też zgodności filozoficznych i etycznych,
▪ niebieska biotechnologia poświęcona problematyce biotechnologii wód (jezior, oceanów i mórz)

Podziały tradycyjne:
▪ biotechnologia zwierząt
▪ biotechnologia roślin
▪ biotechnologia żywności
oraz
▪ biotechnologia tradycyjna ( stosowanie naturalnych enzymów lub enzymy nie zawierające obcego materiału genetycznego)
▪ biotechnologia nowoczesna (zastosowane organizmy, enzymy i białka modyfikowane genetycznie)

NOWOCZESNA BIOTECHNOLOGIA
To zastosowanie metod i technik:
- Inżynieria genetyczna
- Kultury „in vitro”
- techniki bioreaktorowe

● Inżynieria genetyczna :
- rozwijana od początku lat 70-tych ubiegłego wieku.
- Jest zbiorem technik biologii molekularnej, które mogą być wykorzystane w biotechnologii w innych dziedzinach nauki
- zespół technik badawczych pozwalających na wyizolowania i charakterystykę określonych genów, a także wprowadzanie do nich zmian,

● Kultury „in vitro”
- Określenie kultury „in vitro” najdokładniej rozumiane „hodowlę prowadzoną w szkle (w zamkniętych naczyniach)”
- praktycznie przez roślinne kultury „in vitro” będziemy rozumieć hodowle roślin, a także częściej ich niewielkich fragmentów i organów, tkanek, komórek, protoplastów prowadzone w sztucznych podłożach (pożywkach) w sterylnych warunkach

● Techniki bioreaktorowe
- Wykorzystywanie urządzeń do wzrostu takich organów jak bakterie, drożdże, które są wykorzystywane w produkcji takich substancji jak:
przeciwciała,
szczepionki,
czy wykorzystywane do biokonwersji odpadów organicznych.

Biotechnologia – wszelkie manipulacje żywymi organizmami prowadzące do odniesienia określonych korzyści, stosowane przez ludzi od zarania dziejów.
1919 – pierwsze użycie słowa biotechnologia przez Karla Ereky`ego,
1972 – odkrycie że ludzkie DNA jest w 99% takie samo jak u szympansów i goryli,
1980 – scharakteryzowanie nowej technologii,
1983 – wynalezienie PCR – możliwość uzyskania w dość krótkim czasie wielu kopi cząsteczki DNA Flavr Sarr,
1996 – sklonowanie owcy Dolly,
2000 – opublikowanie wersji roboczej ludzkiego genomu,
2002 – zsekwencjonowanie DNA pierwszej rośliny uprawnej – ryżu.

Droga do organizmu o nowych właściwościach
- udomowienie,
- aklimatyzacja,
- introdukcja
- selekcja,
- krzyżowanie.
Ostrość selekcji – im mniej wybieramy organizmów o właściwościach dobrych z całej populacji.

Krzyżowanie – odmian jednego gatunku realizowane dopóki pula genetyczna jest na tyle różna, że osobniki potomne mają różne geny.

Przyczyny utrudniające krzyżowanie oddalone możemy podzielić na:
- prezygotyczne
- postzygotyczne wynikające z
- niezgodność zarodka i bielma (prowadzą do śmierci zarodka)
- Utrudnionego dopływu substancji odżywczych z tkanki macierzystej do zarodka
- funkcjonowania enzymów krzyżowalnośći.

Wyizolowanie zarodka i przeniesienie go do nowych stymulujących cykl rozwoju, daje szansę na przejście przez dalsze stadia rozwojowe i utrzymanie rośliny.

Należy przy tym uwzględnić
1. Stadium rozwojowe zarodka – wiek (kuliste, sercowate, torpedo), izolować przed wystąpieniem oznak zamierania lub procesów obniżających żywotność.
2. Skład pożywek dostosować do:
- wymagań gatunków rodzicielskich
- wieku i kondycji zarodków
- uzupełnić dodatkami organizmami 9mleczko kokosowe, ekstrakty, uwzględnić ciśnienie osmotyczne)

Poziomka wirginijska (oktoploidalna) X Poziomka chilijska (oktoploidalna) Truskawkę

Schemat powstawania śliwomoreli i jej mieszańców

Śliwy japońskie (Prunus salicina) X Morele (Prunus armenicca) Śliwomorele (plumcot)
Śliwomorele (plumcot) X Śliwy japońskie lub amerykańskie Śliwomorele (plumcot) (krzyżowanie wsteczne)
Śliwomorele (plumcot) X Morele Morelośliwy (Aprium) (krzyżowanie wsteczne)

Przyczyny utrudniające krzyżowanie oddalone możemy podzielić na :
- prezygotyczne,
- postzygotyczne wynikające z
* niezgodności zarodka i bielma ( prowadzi do śmierci zarodka)
* utrudnionego dopływu substancji odżywczych z tkanki macierzystej do zarodka

Ze względy na bariery należy
- krzyżowanie przeprowadzić na liczniejszym materiale,
- w obrębie gatunku wyodrębnić odmiany, które łatwiej niż inne krzyżują się z roślinami należącymi do obcego gatunku,
- wykorzystać mieszance pośrednie pomiędzy jednym z komponentów i innych gatunków z którymi daje ono płodne potomstwo,
- krzyżowanie oddalone przeprowadzić w obu kierunkach,
- w celu ułatwienie zawiązywania nasion na znamionach słupków oprócz pyłku obcego gatunku nanieść pyłek zgodny (z pokrewnej odmiany),
- zapobiegać przedwczesnemu opadaniu kwiatów przez stosowanie substancji wzrostowych,
- przenieść zarodki do kultury „in vitro”,
- kontrolować warunki wewnętrzne.

Zatem wyizolowanie zarodków i przeniesienie go do nowych stymulujących rozwój warunków daje szanse na przejście przez dalsze stadia rozwojowe i otrzymanie rośliny. Należy przy tym uwzględnić
- stadium rozwojowe zarodka – wiek ( kuliste, sercowate, torpedo) izolowanie przed występowaniem oznak zamierania lub procesów obniżonej żywotności,
- skład pożywek dostosowany do
* wymagań gatunkowych, rodzajowych
* wieku i kondycji zarodków
* uzupełnić dodatkami organicznymi ( mleczko kokosowe, uwzględnić ciśnienie osmotyczne)

Stosuje się dwie drogi postepowania z zarodkami mieszańców
1. Zabiegi prowadzące do dalszego normalnego rozwoju i powstawania roślin (jeden zarodek – jedna roślina)
- izolowanie zarodków i zalążni
- sterylizacja zarodków
- wyłożenie zarodków na pożywkę indukująca, bezpośredni rozwój rośliny
- pasaż rozwijających się zarodków
- położenie roślin na pożywkę ukorzeniającą
2. Postepowanie prowadzące do regeneracji rośliny przez fazę kalusa lub bez niej (jeden zarodek – wiele roślin)
- izolowanie zarodków i zalążni
- sterylizowanie zarodków
- wyłożenie na pożywkę indukująca powstawanie kalusa embriogenicznego
- przełożenie kalusa na pożywkę regenerującą
- regeneracja
- przełożenie roślinek ma pożywkę ukorzeniająca (sm – zmienność samoklonalna)
Np. uzyskanie zarodków mieszańcowych z krzyżówki dyni zwyczajnej o dyni olbrzymiej
- izolacja zarodków 25-30 dni
- wykładanie na pożywką MS z dodatkiem adeniny
- regeneracja roślin
- efektywność kultury 1-50% wynikającej z
* genotypu roślin rodzicielskich
* kierunek krzyżowań
* sposób izolacji i sterylizacji zarodków
* warunków kultury in vitro
* warunków w jakich uprawiano i preparowano krzyżówkę

Jednym z głównych celów biotechnologii roślin jest uzyskanie nowych gatunków roślin, przewyższających swoimi cechami genotypy dotychczas uprawiane. To ulepszenie uzyskujemy od dawna, posługując się znanymi tradycyjnymi metodami hodowlanymi tj. selekcją , krzyżowaniem, wykorzystując rekombinacje i mutacje. W przypadku tradycyjnych metod hodowlanych wyszukane formy o korzystnych właściwościach ocenia się i selekcjonuje w warunkach polowych, szklarniowych. Uzyskanie nowej odmiany rośliny o określonych cechach w takich warunkach z zastosowaniem tradycyjnych metod uwarunkowana jest:
- długością cyklu życiowego danej rośliny (np. dwuletni, wieloletni)
- sposobem jej rozmnazania (wegetatywny, generatywny) i zapylania
- liczebnością osobników które można selekcjonować
- warunkami klimatycznymi
- czasem średnia trwa 10-20 lat

Kultury in vitro to specyficzny sposób uprawy w pojemnikach w sterylnych warunkach przy kontrolowanej temp, oświetleniu i wilgotności na pożywce stałej lub płynnej. Za pomocą in vitro możliwe stało się opracowanie następujących metod pozyskiwania roślin o nowych cechach
- selekcja w in vitro
- haploidyzacja – haploidy i podwojone haploidy
- krzyżówki genetyczne i somatyczna hybrydyzacja- mieszańce miedzy gatunkowe i miedzy rodzinowe
- transformacja – rośliny transgeniczne

SELEKCJA – jedna z najstarszych i najprostszych metod hodowli, która polega na identyfikacji i wyłonieniu z danej populacji roślin samo lub obcopylnych pożądanych osobników tzn. pojedynków lub biotopów charakteryzujących się określonymi, poszukiwanymi przez człowieka cechami. Selekcja jest rodzajem filtru , który ocenia i klasyfikuje zgodnie z wymaganiami hodowcy

Selekcja w kulturach in vitro polega na identyfikacji i wyłonieniu określonych wartości co do których spodziewamy się z mogą być reprezentowane w materiale roślinnym i które chcemy uzyskać .
Zalety
- duża ilość populacji genotypów przeznaczona do selekcji
- możliwość wielokrotnego powtarzania
- ściśle kontrolowane warunki
- znacznie mniejsze niż w polu powierzchnie i nakłady finansowe na sprzęt
Wady
- selekcjonować można tylko te cechy które pojawiają się na poziomie badanego obiektu tj. komórki, kalusa, zarodka somatycznego lub siewek
- do selekcji in vitro nie nadają się cechy związane z morfologią rośliny czy tez cechy pojawiające się i/lub zależne od określonych faz jej cyklu życiowego (np. występowanie talków w określonej tkance czy organie widoczne tylko po przejściu rośliny z fazy wegetacyjnej do …..)
- zjawisko habituacji, które może zaburzyć jednoznaczna identyfikację danej cechy.

Zadania selekcji – selekcja in vitro ma na celu uzyskanie nowych cech czyli poszerzenie istniejącej w naturze różnorodności biologicznej . Duże znaczenie praktyczne selekcji in vitro polega na stosowaniu szybszej i prostszej niż tradycyjna metodzie uzyskania nowych genotypów roślin .
Zadania selekcji:
1. zidentyfikowana i wyłoniona cecha występuje tylko w kulturach komórkowych lub tkankowych
- pozwala na wykorzystanie wyselekcjonowanych linii cech
- umożliwia identyfikacje genotypu odpowiedzialnego za daną zmianę i przeniesienie go do innego genotypu roślinnego
- stwarza dogodne warunki prowadzenia szeregu badań dotyczących mechanizmu nabywania lub utraty cech
2. Określone cechy przejawiają się także w zregenerowanych roślinach już po przeniesieniu ich do uprawy polowej
- aby była to cecha dziedziczna tzn. Przekazana w sposób reprodukowany na następne pokolenia
Znaczenie selekcji – zatem wykonywanie selekcji obejmuje:
- cechy odporności na środowiskowe czynniki biotycznie abiotyczne (m.in. odporność na patogenne grzyby, owady i nicienie, herbicydy, metale śladowe, zasolenie, suszę, niska temp czy niedobór składników pokarmowych w pożywce)
- cechy związane z wytwarzaniem określonej substancji (mono- i diterpeny, związki steroidowe, alkaloidy, glikozydy) – metabolity wtórne wykorzystywane w farmacji, kosmetyce.

Rodzaje zmienności
Prowadzony w kulturach in vitro materiał roślinny może być stabilny genetycznie w efekcie kolejne pokolenia powstające w wyniku rozmnazania klonalnego są identyczne pod każdym względem z osobnikiem macierzystym. Stosunkowo często obserwuje się występowanie zmian w pokoleniu, pojawiają się inne cechy niż w organizmie wyjściowym. Zmiany pojawiają się w materiale roślinnym prowadzonym w warunkach in vitro mogą mieć podłoże genetyczne (dziedziczne) oraz epigeniczne (poza genetyczne) i wówczas są one niedziedziczone. Jeśli zmiany dotyczą komórek generatywnych, to wśród powstałych z nich roślin obserwuje się zmienność gametoklonalną. Natomiast jeśli zmiany dotyczą komórek somatycznych to zmienność wśród zregenerowanych roślin określa sia jako zmienność somatoklonalną.

Zmienność gametoklonalną – bada się w warunkach in vitro izolowanych mikrospor (ewentualnie pylników) lub ziaren pyłku. Z mikrospor powstają zregenerowane rośliny haploidalne odznaczają się dana cechą natomiast wyselekcjonowane zmiana ziarna pyłku służą do zapylenia.

Zmienność somatoklonalną – obiektem selekcji są głownie zawiesiny komórkowe, kalus, zarodki zygotyczne czy uzyskanie z nich siewki.

Podstawą selekcji w kulturach in vitro jest zmienność somatoklonalna.
Zmienność somatoklonalna jest klasyfikowana jako suma różnych zjawisk genetycznych takich jak mutacje genomu jądrowego i plazmatycznego powstającego pod wpływem warunków kultura oraz zmiany będące skutkiem stresu taki jak zwiększenie amplifikacji genów uaktywnienie trans pozonów, zmiany merylacji DNA.

Podział zmienności somatoklonalnej
- niedziedziczna zmienność somatoklonalna pojawia się w wyniku bezpośredniego wpływu warunków kultur a szczególnie regeneracji wzrostu. Może zostać wykorzystana jedynie w przypadku gatunków rozmnażanych wegetatywnie o ile utrzymuje się w kolejnych pokoleniach. Wykazuje dużą tendencję do zanikania w kolejnych pokoleniach.
- dziedziczna zmienność somatoklonalna mechanizm powstanie tego typu zmienności jest taki sam jak w przypadku mutacji. Zmiany dotyczą zarówno genomu jądrowego jak i genomów plastydowych i mitochondrialnych.

Zmienność somatoklonalna powstająca w kulturach spontanicznie może być kontrolowana tylko w ograniczony sposobów. Zmienność ta może być wynikiem genetycznego zróżnicowanie tkanek, z których składa się eksplantant pierwotny. Eksplantanty mogą zawierać tkanki o różnej poliploidalności i zmutowane komórki somatyczne które poza kulturą nie miałyby możliwości przekazanie zmienności zmiennych cech drogą genetyczną. Oprócz zmienności somatoklonalnej wpływa istotnie sposób wegetatywny roślin oraz niektóre czynniki kultury.

Indukowanie zmienności somatoklonalnej
- mutacje chemiczne np.:
▪ powoduje modyfikacje zasad azotowych, a w konsekwencji nieprawidłowy odczyt informacji zawartej z DNA (np. kwas azotowy, iperyt.)
▪ będące przyczyną nieprawidłowego wstawiania nukleotydów
- mutacje fizyczne
▪ promieniowanie jonizujące
▪ promieniowanie ultrafioletowe
▪ wysoka temperatura

Skutki działań mutacji na komórki roślinne
- mutacje punktowe
- zaburzenia w budowie i liczbie chromosomów
- mutacje chlorofilowe
- zmiany izoenzymatyczne

Aby wyeliminować niepożądane mutacje już w trakcie trwanie kultury należy prowadzić selekcję.
Zasady prowadzenia selekcji. Selekcję prowadzi się w obecności czynnika selekcyjnego tzn. dodaje się go do pożywki na której znajduje się materiał roślinny. Czynnikami selekcyjnymi w zależności od poszukiwanej cechy mogą być elicytory ( sygnalizujące roślinie konieczność wytwarzania substancji obronnych) wyciąg i koncentrat z mikroorganizmów filtraty po kulturowe, związki chemiczne oraz czynniki fizyczne.

Przykłady czynników selekcyjnych w odniesieniu do określonej cechy

Czynnik selekcyjny	Cecha
Stosowana chemia - streptomycyna - herbicydy - jony metali - NaCl	Odporność - antybiotyki - środki ochrony roślin - metale ciężkie - zasolenie
Wyciągi i koncentraty z kultury mikroorganizmów patogennych (np. Fusarium oxysporum)	Odporność na Fusarium
Intensywność elisytory bakterie Erwinia carotoworum	Odporność na dana bakterię
Czynnik fizyczny - niska temperatura - wysokie ciśnienie osmotyczne pożywki	- Mrozoodporność - tolerancja na suszę

O skuteczności selekcji decydują
- rodzaj, stężenie i czas działania czynnika selekcji,
- rodzaju kultury
- reakcja komórek na działanie danego czynnika pobierając najbardziej
Parametry selekcji każdorazowo należy ustalić doświadczalnie, dobierając najbardziej korzystne warianty.

Najprostszą metodą selekcji in vitro jest metoda bezpośrednia. Umieszcza się analizowane obiekty na dwóch pożywkach różniących się brakiem lub obecnością czynnika selekcyjnego. Te obiekty które przeżyją w obecności czynnika selekcji prawdopodobnie mają poszukiwaną cechę. Selekcja powtórzyć kilkukrotnie.
wyselekcjonowane linie pasażuje się na pożywce bez czynnika selekcyjnego. Po kilka subkulturach na czystą pożywkę obiekty ponownie przenosi się na pożywki selekcyjne celem sprawdzenia czy zmiany są trwałe.
Jeśli tak należy dążyć do regeneracji i testować te rośliny pod względem poszukiwanej cechy oraz jej sposobu dziedziczenia.

Charakterystyka wybranych typów kultur
- kultury kalusa – badanie lub mikrozmnażanie
- kultury zawiesin komórkowych
- kultury protoplastów
- kultury organów i ich fragmentów

Kultury kalusa
- w naturze formowanie tkanki kalusowej (przyrannej) to odpowiedz rośliny na urazy mechaniczne, spowodowane infekcja mikroorganizmów lub uszkodzeniami przez zwierzęta roślinożerne,
- w warunkach in vitro kalus może powstać z każdego fragmentu żywej tkanki czy organu wyizolowanego z rośliny macierzystej i umieszczonego na pożywce zawierającej odpowiednie substancje odżywcze oraz regulatory wzrostu i rozwoju (głównie cukry)

Tempo formowanie się kalusa zależy m.in. od budowy eksplantantu
- eksplantanty zawierające tylko komórki macierzyste szybko tworzą kalus,
- jeśli natomiast w eksplantancie znajdują się głównie komórki zróżnicowane, ulegają one namnażaniu odróżnicowaniu i staja się merystematyczne a dopiero później w wyniku powtórnego różnicowania tworzą kalus trwa to zwykle od 2 do 4 tygodni.
- kalus może powstać tylko w miejscu cięcia rośliny jak także na całej powierzchni eksplantantu
- po uformowaniu na eksplantancie kalus zazwyczaj odcina się i przenosi na nowe pożywki (pasażuje się) celem dalszego namnażania komórek a potem stymuluje się regeneracje roślin
- inicjacja kalusa odbywa się zwykle w ciemności natomiast namnażanie i regeneracja roślin może zachodzić zarówno w ciemności jak i pod wpływem działania światła.

Powstający w kulturach in vitro kalus różnią się
- rodzajem i liczba tworzących go komórek
- strukturą (zwarta, luźna, jednolita, grudkowata)
- barwą biała żółta czerwona zielona
- konsystencja twarde, miękkie, suche, wilgotne
- stabilnością genetyczna ( zmiany kariotypu dotyczące liczby i budowy chromosomów) – poliploidy, haploidy, aneuploidy
- zdolnościami rozwojowymi kalusy morfogenne, organogenne i embriogenne oraz niemorfogenne – proliferacja
- kompetencja komórek kalusa nie jest stała cechą. Różnice te wynikają m.in. z pochodzenia i rodzaju eksplantantu wieku kalusa, składu chemicznego pożywki oraz warunków prowadzenia kultury.

Zdolności rozwojowe kalusa in vitro
Eksplantant indukcja kalusa kalus (morfogenne) korzenie, pędy, zarodki somatyczne, (niemorfogenne) poliferacja kalusa.

Habituacja (anergizacja)
- to zjawisko stopniowego uniezależniania się kalusa od egzogennych auksyn i/lub cytokinin oraz przystosowanie się do wzrostu na pożywce bez lub przy znacznym obniżeniu ich zawartości
- zjawisko habituacji względem auksyn i etylokinin mogą występować niezależnie lub jednocześnie w tym samym kalusie
- Habituacja może także dotyczyć innych substancji odżywczych w pożywce.

Wykorzystanie kalusa
- masowa regeneracja roślin drogą morfogenezy przybyszowej
- wytwarzanie na skalę przemysłową roślinnych produktów naturalnych
- uzyskiwanie roślin zmodyfikowanych genetycznie czy wyselekcjonowanych z uwagi na wybrane stresowe czynniki środowiskowe
- podstawa kultury zawiesin komórek.

Kultury zawiesinowe (kultury zawiesin komórek)
Zawiesina komórek to populacja pojedynczych komórek lub niewielkich agregatów komórkowych intensywnie rosnące w rytmicznie wstrząsanej pożywce płynnej charakteryzująca się powtarzalnymi parametrami wzrostu. Wielkość 40-200 nm nie większe niż 3mm.

Do inicjacji kultur zawiesinowych wykorzystuje się
- luźny i podatny na rozbicie kalus – najlepszy
- drobno pocięte zarodki
- drobno pocięte blaszki liściowe

Kultury zawiesinowe prowadzi się zwykle w kolbach stożkowych umieszczonych na wytrząsarce rotacyjnej zarówno w ciemności jak i w świetle o niezbyt dużym natężeniu.
Sposoby hodowli w laboratorium
- system okresowy – w danej objętości pożywki komórki kontynuują podziały i wzrost aż do wyczerpania zapasów i kończy to rozwój kultury
- system ciągły wymiana pożywki na świeżą zapewnia stały dostęp do pożywki, usuwa metabolity toksyczne.

Etapy kultury zawiesinowej
- założenie kultury wielkość inokulum ustala się eksperymentalnie objętość pożywki nie powinna przekraczać 1/4 -1/5 pojemności naczynia
- wstrząsanie rozbicie tkanki na mniejsze fragmenty i uwalnianie się pojedynczych komórek; zapewnia jednolite warunki kultury
- filtrowanie ma na celu usuniecie resztek eksplantantu i zbyt dużych agregatów komórkowych
- pasażowanie zawiesiny czyli przenoszenie do świeżej pożywki odbywa się zwykle co 7-21 dni

Pasażowanie powinno się przeprowadzać zawsze w tym samym okresie cyklu życiowego zawiesiny komórkowej zwykle na początku fazy stacjonarnej.
Wzrost liczby komórek –parametr pozwalający ocenić zachowanie się komórek w zawiesinie. Tempo wzrostu liczby komórek w ciągu całego cyklu od pasażu do pasażu zmienia się w charakter sposób tworząc krzywą wzrostu. Standardowa krzywa wzrostu ma kształt sinusoidy i można w niej zaznaczyć 5 faz:
1) spoczynkowa – adaptacja komórek do warunków środowiska
2) wykładnicza – intensywny podział komórek
3) wzrostu liniowego – intensywny wzrost komórek tempo podziału maleje
4) obniżonego wzrostu – komórki osiągają swoje maksymalne rozmiary ustają podziały komórkowe. Tworzą się agregaty komórkowe (zwiększanie intensywności mieszania zapobiega temu)
5) stacjonarna – może dochodzić do obumierania pojedunczych komórek

Kulruty zawiesinowe sa dobrym obiektem rozmaitych badań
- metabolity komórek
- reakcji na czynniki stresu (abiotyczne i biotyczne)
- mechanizmów różnicowania się komórek
- manipulacje genetyczne

W praktyce wykarzystuje się m.in. do
- selekcji wybranych genotypów
- uzyskiwania i namnażania komórek embriogennych oraz organogennych a nastepnie do regeneracji z nich roślin
- uzyskanie dużej ilości transformantów
- do wytwarzania na duża skalę ( w bioreaktorach) roslinnych produktów naturalnych

Organizme genetycznie zmodyfikowane
Są to organizmy do których wprowadzono nowy gen (tzw transgen) przy użyciu technik inżynieri genetycznej w celu wzuskania roslin lub zwierząt o uzupełnienie nowych właściwości.

Zakres manipulacji genetycznej
- zmiana aktywności genów wystepujących w danym organizmie np. pomidorów ze zmiejszona aktywnością genu odpowiedzialnego za dojrzewanie i mięknięcie
- wprowadzenie do organizmu dodatkowego jego wlasnego genu np. dodatkowego genu odpowiedzialnego za produkcję mleka u krów i owiec co zwieksza ich mleczność.
- wprowadzenie do organizmu nowego genu polączonych:
▪ genów roslinnych z roslinnymi
▪ genów zwierzecych ze zwierzecymi
▪ roslinnych ze zwierzecymi lub ludzkimi
▪ bakteryjnych z roślinnymi

Transformacja roslin
- rośliny należą do najłatwiej transformowalnych wsród organów wyzszych
- do ich transformacji używane sa zarówno metody fizyczne jak i biologiczne
- do niedawna rosliny były jedynymi transgenicznymi organizmami dopuszczonymi do uzytki powszechnego

Metody transformacji
- wektorowe (pośrednie) polegają na wykorzystaniu bakteri z plazmoidem zawierającym transgen
- bezwektorowe (bezposrednie) gen wprowadza się do komórek biorcy bez posrednictwa bakterii.

Metoda wektorowaz uzyciem A.tumerfaciens
Transformacja z uzyciem A. transfaciens jest procesem zależnym od
- właściwosci bakterii
- rodzaju infekowanej tkanki roslinnej
- czynników środowiskowych
jego istotą jest przekazanie przez bakterie komórkom roslinnym fragmentu zwanego T-DNA stosowanego części plazmoidu Ti
Metody otrzymywania tranzgenicznych roślin.
1 Metody wektorowe – wykorzystanie plazmidu Ti z bakterii A. tumefaciens (guzowatość korzeni) posiadajacego naturalną zdolność wbudowywania swojego DNA do genomu roślin, w celu wprowadzenia transgenów proces ten nazywany jest TRANSFEKCJĄ.
A. rhizogenes – plazmid Ri wywołuje powstawanie dużej ilośći korzeni włośnikowych. Plazmid Ti kolista cząsteczka DNA o wielkośći 200 kpz ( kilo par zasad) replikująca się niezależnieod chromosomu bakteryjnego.

Fragment T
- geny odpowiedzalne za syntezę auksyn (iiM, iaaH) oraz cytokinien (itp.)
- gen biorący udział w morgogenezie tumorów (tml)
geny biotace udzial w syntezie (ops) i wydzielaniu opin (ocs)

Geny fragmentu T są zaopatrzone w sekwencja rozpoznawane przez czynniki transformacyjn e rosliny takie jak TATA – bedace sygnalem do rozpoczęcia transkrypcji czy AATAAA stanowiace sygnał do terminacji i poliaderykcji.
Fragment T jest z obu stron otoczony sekwencjami granicznymi i składającymi sia z prostych powtórzeń nukleotydów, które biorą udział w procesie integracji fragmentu T z genomem biorcy. Każda z sekwencji granicznych ma dłogość 25 par zasad.

W rejonie wirulencji o dłogości 30-40 kpz znajdują się geny wirulencji (vir) . 24 geny vir są ułozone w 8 operolach

Rola genów virA i virG jest aktywacja pozostałych genów vir. Geny virB kodują bialka błonowe przez które przedostaje się odcinek T. Produkty genów vir C i vir E biorą udział w ochronie i transporcie odcinka T. Geny vir D są odpowiedzialne za wyciecie odcinka T. Geny vir F i vir H są związane z podtrzymywaniem procesu reakowacenia min kodujące białka pełniace rolę detoksyfikatów zawiązków roślinnych utrudniających rozwój tumorów.
W procesie transformacji sa też zaangażowane geny virA i vir E leżace na chromosomie bakteri. Bialka kodowane przez dwa prawe geny sa odpowiedzialne za połaczenie bakterii z komórka roslinną a trzecie bierze udział w aktywacji genów vir.
Dla bakteri sygnałem do informacji są związki fenolowe lub i cukry uwalniane ze zranionej tkanki roslinnej, np. acetosyringon – r. Solanaceae, alkochol koniferylowy, pochodne kwasów benzoesowego i cynamonowego. Cząsteczki te wiążą się z receptorami błonowymi bakterii. W skład receptowór vir wchodzą produkty genów vir A i vir E tworząc kompleks aktywujący gen vir G.
Białko vir G wiąze się ze specyficznymi miejscami promotorów pozostałych genów rejonu vir, stymulując ich transkrypcje.
Dwa regiony operonu vir D: vir D1 i vir D2odpowiadaja za wyciecia fragmentu T, kodują białka vir D1 i vir D2 o aktywności endonukleazy. Wycięcie rozpoczyna się w specyficznym miejscu prawej sekwencji granicznej a naspępnie lewej.
Do końca 5 wycietego jednoniciowego fragmentu T wiązą się kowelancyjnie białka vir D2 chroniąc go w ten sposób przed egzonukleazami.
Nastepnie białko vir E2 łaczy się jednociciowym fragmentem T i chroni go tworząc kompleks nukleoptoteinowy.
W tej formnie fragmen T jest transportowany do komórek roślinnych, oba białka tworzace kompleks z fragmentem T biora udział w jego integracji z genomem roslinnym.

W procesach wykorzystujacych Agrobacterium najczęściej wykorzystuje się kulture in vitro biorcy, wybierając dobrze regenerujace eksplantanty. Procedura ta składa się z następujacych etapów:
1. Indukcja zwana także kokulturą, polega na umieszcczaniu eksplantantów w roztworze bakterii.
2. Wstepne pozbycir się nadmieru bakterii przez wyplukanie eksplantantów w wodzie lub pożywce i/lub osuszenie na bibule filtrujacej.
3. Umieszczenie eksplantantów na pozywce stymulujacej regeneracje pedów zawierajaca jednoczesnie antybiotyki w celu eliminacji baktrii.
4. Umieszczenie eksplantantu na podlożu z odpowiednim czynnikiem selekcyjnym.
5. Regeneracja rosliny.

Zalety transformacji za pomoca Agrobacterium
- jest metoda wykorzystujacą naturalne właściwości tej bakteri,
- w czasie transformacji wprowadzany fragment jest ochraniany,
- jest to metoda o stosunkowo dużej wydajności wynikajacej z wysokiej czescości integracji fragmentu T z genomem roslinnym,
- Istnieje mozliwość jednoczesnego wprowadzenia kilku szczepów bakterii zawierających różne geny. W stosunku do roślin jednoliściennych metoda to okazała się mniej skuteczna i ograniczyła się tylko do kilku gatunków Asparagus officinalis (szparag), Oryza sativa (ryż siewny), Zea mays (kukurydza), Triticum aestivum (pszenica zwyczajna).

Proces wprowadzania DNA go genomu do komórki roslinnej obejmuje 3 podstawowe fazy:
1. Klonowanie i modyfikowanie DNA dokonuje się w plazmidach z wykorzystaniem rekombinacji DNA
Aby do plazmidu wprowadzić DNA przeznaczone do klonowania oczyszczony plazmidowy DNA poddaje się działaniu nukleazy restrykcyjnej, która go przecina tylko z jednym miejscu i z tak rozcietym plazmidem łaczy się kowalencyjnie za pomocą ligazy DNA przeznaczony do klonowania fragmen DNA (insert)
2.Przeniesienie plazmidu zawierajacego skonstruowany gen do Agrobactwrium na drodze koniungancji.
Proces transformacji komórki roslinnej zachodzi zarówno, gdy funkcja vir T-DNA ulokowane są na tych samych lub oddzielnych plazmidach w Agrobecterium. Cecha te umozliwiła opracowanie dwóch systemów wektorowej transfrormacji.
I.To system kointegracyjny (cis), w którym nowe geny wprowadzane są drogą homologicznej rekombinacji do T-DNA obecnego w plazmidzie Ti.
II.To system binarny (trans), w którym nowy gen ulokowany zostaje w T-DNA plazmidu zdolnego do replikacji w Agrobacterium, i nastepnie wprowadzony do komórki Agrobacterium zawierającej tzw. rozbrojony (pozbawiony T-DNA) plazmid Ti (Ri). W tym przypadku plazmid Ti pełni funkcję plazmidu pomocniczego, indukującego przez geny wirulencji proces przenoszenia DNA z plazmidu binarnego.

Plazmid pomocniczy jest modyfikowanym plazmidem Ti, nie ma on rejonu T ale zawiera region vir którego geny aktywnie uczestniczą w wycinaniu fragmentu DNA zawartego pomiędzy sekwencjami LB-RB wektora binarnego.

3. Przenoszony fragment DNA ulega integracji z genomem rośliny podczas wspólnej inkubacji (kokultywacji) Agrobacterium z komórkami roślinnymi lub eksplantatami.
Dla dokonania selekcji transformantów, u których wprowadzony gen nie wywołuje łatwo dostrzegalnych zmian fenotypowych, wymagane są konstrukty plazmidowe posiadające oprócz genu, którego ekspresję chcemy badać, także gen selekcyjny (markerowy) oraz gen reporterowy.
Przykładami są:
▪Beta – glukuronidaza (GUS)
Obecnie najczęściej stosowany gen pochodzący z E.coli
Użyteczność GUS jako enzymu reporterowego wynika z jego małej endogennej aktywności u badanych dotychczas roślin.

Aktywność enzymu oznacza spektrofotometrycznie, fluorometrycznie a także poprzez testy histochemiczne umożliwiające lokalizację aktywności enzymatycznej w transformowanych komórkach i tkankach. W tym ostatnim przypadku po wprowadzeniu do roślin substratu X-glukuronid uzyskuje się barwę niebieską łatwą do histochemicznego oznaczenia.

▪Lucyferaza (LUC) Lucyferaza ze świetlików (Photinus pyralis) katalizuje zależne od ATP utlenienie lucyferyny (naturalny pigment występujący w komórkach niektórych bakterii i świetlików), któremu towarzyszy emisja światła. Enzym wykazuje dużą specyficzność w stosunku do lucyferyny. Brak układu enzym-substrat w roślinach oraz znaczna czułość reakcji powodują iż jest to dogodny enzym reporterowy.

Zielone białko fluoryzujące (ang. greek fluorescent protein, GFP)
GFP jest bardzo użytecznym białkiem w biologii molekularnej komórki. Jego łatwa wizualizacja i brak toksyczności wobec organizmów żywych sprawia, że znakomicie sprawdza się jako cząsteczka reporterowa, służąca do badania np. aktywności promotorów lub wydajności transfekcji komórek. Dodatkowo, metodami inżynierii genetycznej można tworzyć białka funkcyjne złożone z GFP i badanego białka, co pozwala na uwidocznienie lokalizacji tego białka w komórce lub zmiany tej lokalizacji pod wpływem różnych czynników.

Geny selekcyjne:
1.Odporność na antybiotyki
2.Odporność na herbicydy
3.Zdolność do rozkładu toksycznych związków chemicznych
4.Stymulacja wzrostu i rozwoju in vitro
5.Zdolność do przekształcania (rozkładu) określonych węglowodanów
np. Fosfatransfera neomecynowa II – enzym ten inaktywuje antybiotyki i grupy aminiklukozydów - tamarycynę, neonycynę, gen + amycynę, ganetycynę.

Metody bez wykorzystania wektora
Są to metody polegające na bezpośrednim wprowadzeniu DNA do komórek roślinnych pozwalają one na transformowanie dowolnych roślin.
Nim fragment będzie mógł być wprowadzony do komórki gospodarza ta musi być pozbawiona ściany komórkowej (oprócz mikrowstrzeliwania) By to osiągnąć można poddać ja działaniom enzymów degradujących ścianę komórkową. Otrzymuje się w ten sposób tzw. protoplast którego błona komórkowa stanowi kolejna barierę dla transgenu, wprowadzane do komórek z wykorzystaniem jednej z metod, ogólnie podzielonych na fizyczne i chemiczne.

Mikrowstrzeliwania
● wykorzystuje mikroskopijne kulki za złota lub wolframu o śr. 0,5 – 5 mikrometra. Fragment DNA którego pragnie się wprowadzić do komórek są opłaszczone na tych kulkach a następnie wstrzeliwane do komórek roślinnych.
Zaleta: możliwość transformowanie wszystkich rodzajów tkanek.
Wada: konstrukt genomu nie jest chroniony co naraża go na uszkodzenia.

Mikroiniekcja
● polega na wprowadzeniu DNA za pomocą igły mikromanipulatora (mikropipety)

Elektroporacja
● polega na wykorzystaniu serii impulsów elektrycznych, które naruszają strukturę błony, powodując powstawanie w niej porów, przez które DNA może przeniknąć do wnętrza komórki.
● może być stosowana tez przy wprowadzaniu genów do innych komórek – zwierzęcych, bakteryjnych.

Z użyciem PEG polega na wykorzystaniu glikolu polietylenowego który powoduje zwiększenie przepuszczalności błony komórkowej, poprzez doprowadzenie do jej całkowitej odwracalnej dezorganizacji. To pozwala na wnikniecie transgenu do komórek, wraz z DNA nośnikowym.

Celowość modyfikacji roślin:
● odporność na herbicydy
- najpowszechniejsza z modyfikacji, możliwość stosowanie herbicydów bez obaw o zniszczenie uprawianej rośliny. Zmodyfikowano – kukurydze, soje, rzepak, tytoń.
- wytwarzanie enzymu katalizującego rozkład cząsteczek herbicydu i tym samym jego detoksykację,
- syntetyzuje inną formę enzymu (izoenzym) która nie jest wrażliwa na herbicyd,
- wytwarza bariery fizjologiczne i fizyczne, które zapobiegają wnikaniu herbicydów do tkanek i komórek.
● odporność na szkodniki
Wprowadzenie genu Bt (pochodzącego z bakterii glebowej) kodującego białka toksyczne dla owadów. Toksyczność polega na tym iż po spożyciu wewnątrz przewodu pokarmowego (środowisko zasadowe) kryształy białkowe rozpuszczają się uniemożliwiając działanie owadzich prokeaz, które trawiąc białko uwalniają fragmenty wielkości 65-70 kDa o właściwościach trujących. Nie jest ono toksyczne dla ssaków.
● odporność na choroby przenoszone przez grzyby i bakterie
Wprowadzenie do roślin trangenów kodujących enzymy niszczące ścianę komórkowa grzybów i bakterii.
● poprawa cech jakościowych i ilościowych np. opóźnienie dojrzewania
- pomidor Flavr – Savr blokowanie enzymu rozkładającego blaszkę miedzy komórkami,
- zwiększenie produkcji beta-karotenu u ryżu (gen z żonkila)
- pszenica o większej zawartości glutenu co poprawia cechy maki,
- kawa zawierająca o 70% mniej kofeiny niż normalna.
● zwiększenie trwałości roślin
zablokowanie syntezy etylenu - zmutowany nieaktywny gen receptora etylenu z Arabidopsis przeniesienie do petunii i pomidora. Gen ten inaktywuje również własne prawidłowe geny.
( uzyskanie nowych odpornych roślin poprzez kolor, kształt, właściwości wzrostu)
● uodpornienie na działanie niekorzystnych warunków środowiska np. mróz, susza, zasolenie, wysokie stężenie metali ciężkich. Stworzenie mrozoodpornych roślin dzięki transgenicznej ekspresji białek np. znajdowanych u ryb arktycznych.
Konstrukt genowy , T-DNA

25 bp sekwencja graniczna LB	Roślinny marker selekcyjny	TRANSGEN	25 bp sekwencja graniczna RB

↓↓

PROMOTOR	SEKWENCJA KODUJĄCA	TERMONATOR

Zmiany mogą dotyczyć:
- tkankowo swoistej ekspresji (określone tkanki roślinne),
- nadekspresji genu (promotor kieruje syntezą w większej niż normalne ilości)
- represji genu
- ekspresji regulowanej czynnikami środowiska
▪ światło
▪ regulator wzrostu

Promotor – jest to wchodząca w skład genu regulatorowa sekwencja DNA nie ulegająca transkrypcji ale warunkująca jej początek i koniec. Podział promotorów:
▪ promotory nieswoiste
- to najczęściej promotory kontrolujące syntezę transkryptów 19s i 35s wirusa mozaik kalafiora
* powodują wysoką wydajność ekspresji,
* są one niepodatne na regulację przez światło
zastosowanie
- wzmocnienie syntezy pożądanych związków
- zwiększenie odporności na patogeny
▪ promotory tkankowo swoiste
- sterują tkankowo swoistą ekspresją genów np. B33 – swoisty dla bulw ziemniaka, st-LS1 – swoisty dla liści, CM3 – dla zewnętrznej warstwy bielma u kukurydzy.
▪ promotory indukowane chemicznie – mają zastosowanie szczególnie wtedy gdy produkty obcego genu wpływa na wzrost i rozwój rośliny lub obcego genu ma ulec ekspresji w określonym miejscu i czasie. Np. PR-1a aktywowany atakiem patogena uruchamiający gen odpowiedzi i obrony, In2-2 – aktywowany safenerem (związki dodawane do herbicydów by aktywować system obronny rośliny) wzmacnianym tolerancje na herbicyd

Identyfikacja roślin transgenicznych
Ponieważ w genom roślinny zostaje wbudowany fragment T-DNA zatem elementami rozpoznania organizmu transgenicznego będą: promotor, sekwencja kodująca, terminator, marker selekcyjny .
Zatem kontrolę transgeniczność możemy przeprowadzić:
1. Na poziomie kw. nukleinowych za pomocą PCR
2. Na poziomie białek – analizuje się produkty białkowe transgenów.

Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) powiela wybrane sekwencje DNA. PCR opiera się na wykorzystaniu polimerazy DNA do kopiowania DNA (pełniącego role matrycy w poszczególnych rundach replikacji.

Polimeraza jest naprowadzana na sekwencje przeznaczone są kopiowania przez niektóre oligonuklotydy steroidowe (sterydy) które ulegają hybrydyzacji z matrycowego DNA na początku i końcu powielanej sekwencji DNA. Oligonuklotydy te są tak skonstruowane, by mogły stanowić startery do replikacji każdej z nici wyjściowego dwuniciowego DNA.

PCR można stosować do powielania (amplifikacji) tylko takiego DNA, którego sekwencje początkowa i końcowa są znane. Naprowadzanie przez sterydy, polimeraza DNA syntetyzuje wiele kpi (ok. miliona) potrzebnego odcinka DNA. PCR jest niezwykle czuła: ze jej pomocą można wykryć pojedyncza kopię jakiejś sekwencji DNA gdyż PCR powieli ją tak mocno, że produkty amplifikacji staja się wykrywalne np. przez barwienie po elektroforetycznym rozdziale w żelu.

Aby powielić jakiś odcinek DNA metodą PCR, należy znać sekwencje nukleotydowe krótkich rejonów oskrzydlających okolice przeznaczone do amplifikacji. Umożliwia to zaprojektowanie dwóch syntetycznych oligonulkeotydów z których jedna na komplementory do sekwencji oskrzydlającej powielany odcinek DNA po jednej jego stronie a drugi po przeciwnej. Oligonuklotydy te służą jako startery do syntezy DNA in vitro, katalizowanej przez polimerazą DNA i jednocześnie określają długość powielanego odcinka DNA.

Punktem wyjścia PCR jest dwuniciowy DNA, każdy cykl reakcji rozpoczyna się od krótkiego ogrzania dwuniciowej cząsteczki w celu oddzielenia od siebie obu jej łańcuchów (etap 1) – denaturacja 95stC.

Po oddzieleniu łańcuchów mieszaninę reakcyjną oziębia się w obecności dużego molowego nadmiaru obydwóch oligonulkeotydów starterowych, co powoduje ich hybrydyzację z komplementarnymi sekwencjami na końcach rejonu powielanego (etap 2) – przyłączanie starterów 54stC.

Mieszaninę indukuje się następnie z polimerazą DNA i czterema trifosforami deoksyrybonukleotydów dzięki czemu zachodzi synteza DNA, rozpoczynająca się od każdego z dwóch starterów – (etap 3) – elongacja 72 stC.

Cykl reakcji powtarza się od termicznej dysocjacji nowo utworzonych dwuniciowych cząsteczek DNA. W metodzie tej wykorzystuje się specjalną polimerazę DNA, izolowana z bakterii termofilnych. Polimeraza ta jest trwała w temperaturach znacznie wyższych niż eukariotyczna polimeraza DNA. Dzięki temu nie ulega denaturacji podczas termicznej denaturacji DNA.

Biblioteki (banki) DNA
jest to zespół fragmentów DNA danego organu połączonych z cząsteczkami wektora (cząsteczka plazmidowego DNA) wyróżniamy dwa podstawowe typy bibliotek
▪ genowa
▪ cDNA – odwrotne DNA sekwencja uzyskana na drodze odwrotnej transkrypcji z RNA

Dla tworzenia biblioteki genomowych fragmentacji poddaje się cały DNA danego organizmu. Następnie łączy się powstałe fragmentu z określonymi wektorami. Każda zatem cząsteczka wektora zawiera wbudowany jeden fragment DNA organizmu którego bibliotekę tworzymy. Biblioteka genowa jest zatem reprezentacja całego organizmu. Zawiera genotyp także interiory, sekwencje, regulatory itp. Stąd też wektor niekoniecznie musi zawierać DNA odpowiadający genowi. Ale na pewno zawiera wszystkie geny danego organizmu.

Biblioteka cDNA
Przy jej tworzeniu wykorzystujemy fakty iż informacja genetyczna z genów aktywnych w określonej temperaturze komórek jest przepisywana na mRNA.
To mRNA jest izolowane, z następnie przy pomocy enzymu odwrotnej transkrypcji informacja z mRNA jest przepisywana na DNA, komplementarne do mRNA które jest następnie łączone z wektorem.

Natomiast klony cDNA zawierają tylko sekwencje kodujące i to tylko takich genów które ulegają transkrypcji na mRNA w tkankach z której pochodzi RNA, ponieważ komórki różnych tkanek wytwarzają różne mRNA, dla każdego rodzaju tkanki pozyskuje się inna biblioteka cDNA. Biblioteki cDNA konstruuje się także w tym celu by uzyskać obraz zmian ekspresji genów w komórkach podczas różnych etapów jej rozwoju lub różnicowania się.