ĆW. 1 - DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA W MEDYCYNIE

Główne kierunki analizy DNA

Genomowy DNA:

• Amplifikacja DNA Amplifikacja in-vitro, PCR

• Hybrydyzacja molekularna Southern Blot, Northern Blot, Dot Blot, DNA Fingerprinting

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

• metoda badania oparta na zdolności tworzenia kompleksu dwuniciowego przez jednoniciowe fragmenty kwasów nukleinowych,

• polega na wzajemnym oddziaływaniu pomiędzy badanym fragmentem kwasu nukleinowego a sondą molekularną, które prowadzi do wytworzenia hybrydu (dupleksu) o dwuniciowej strukturze,

• w przypadku dwuniciowego fragmentu kwasu nukleinowego tworzenie hybrydu poprzedzone jest denaturacją pod wpływem działania zasad lub wysokich temperatur,

• proces łączenia sondy molekularnej z fragmentem docelowym kwasu nukleinowego jest wysoce specyficzny i zachodzi zgodnie z zasadą komplementarności,

• odpowiednio przygotowana sonda molekularna, w optymalnych warunkach rozpoznaje sekwencje różniące się zaledwie kilkoma nukleotydami i tworzy trwałe kompleksy,

• badany kwas nukleinowy może być denaturowany i unieruchamiany na filtrach, a następnie poddawany procesowi identyfikacji za pomocą znakowanej radioaktywnie lub nieradioaktywnie sondy molekularnej.

• Tm (odwrotny punkt topnienia) - temperatura przy której istnieje równowaga dynamiczna pomiędzy hybrydami rozpadającymi się w wyniku denaturacji i tworzenia się w wyniku renaturyzacji

• Ze statycznego punktu widzenia w tej temperaturze 50% hybryd ulega rozpadowi

• Tm zależy od wielu czynników: stężenia jonów Na, liczby par G-C, długości hybrydy, stężenia formamidu lub mocznika

Tm = 2 x n_A-T + 4 x n_C-G

Zjawisko hybrydyzacji umożliwia tworzenie kompleksów różnych molekuł zwanych inaczej hybrydami:

• DNA - DNA, gdy sonda (wyznakowany ssDNA) wiąże się do komplementarnego ssDNA analizowanej sekwencji,

• DNA - RNA, gdy sonda (wyznakowany ssDNA) tworzy hybryd z komplementarną cząsteczką RNA,

• RNA - RNA, gdy sonda (wyznakowany RNA) łączy się z komplementarna cząsteczką RNA.

Stabilność wyżej wymienionych hybrydów jest zróżnicowana:

RNA -RNA > DNA -RNA > DNA -DNA

Sondy molekularne

W analityce molekularnej wykorzystuje się sondy oligonukleotydowe pochodzenia naturalnego (kilkaset nukleotydów), które można otrzymać przez określone zabiegi molekularne np. klonowanie lub sondy syntetyzowane chemicznie (zwykle o długości 10 - 50 nukleotydów).

Zalety sond syntetycznych:

• stosunkowo łatwa dostępność,

• możliwość dowolnego programowania sekwencji sond,

• nie ma potrzeby denaturacji, gdyż sonda jest jednoniciowa,

• krótki czas hybrydyzacji,

• wysoka selektywność.

Znakowanie sond molekularnych

Znakowanie najczęściej wykonuje się poprzez wprowadzenie radioizotopu ³²P w miejsce niepromieniotwórczych atomów fosforu.

Można tego dokonać poprzez:

• przeniesienie z udziałem kinazy polinukleotydowej reszty fosfonowej [γ ³²P] ze znakowanego ATP na koniec 5' cząsteczki sondy

lub

• wbudowując w łańcuch sondy [γ ³²P] - deoksyfosfonukleozydy w procesie „nick translation” (uzupełnienie przerw w dwuniciowej cząsteczce DNA, wywołanych uprzednio przez endonukleazę).

W korzystaniu z tego typu sond metodą wykrywania utworzonych struktur hybrydowych jest bezpośrednia autoradiografia.

Powszechnie stosuje się również techniki niepromieniotwórcze w znakowaniu sond molekularnych, polegające na dołączaniu biotyny lub digoksygeniny. Produkty hybrydyzacji wykrywa się wówczas w procesach dwustopniowych:

Etap I:

• użycie streptawidyny wiążącej się wybiórczo z biotyną lub przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko biotynie czy digoksygeninie,

• streptawidyna i przeciwciała sprzężone są z enzymami (peroksydaza chrzanowa lub fosfataza zasadowa).

Etap II:

• w/w enzymy w obecności odpowiednich substratów powodują reakcje barwne lub wywołują zjawisko chemiluminescencji.

Hybrydyzacja Southern (ang. Southern blot hybridization)

• hybrydyzacja mająca na celu identyfikację określonego fragmentu DNA,

• najczęściej dotyczy hybrydyzacji DNA - DNA,

Etapy :

1. Izolacja i oczyszczanie DNA z komórek lub tkanek.

2. Trawienie DNA odpowiednimi restryktazami.

3. Rozdział elektroforetyczny fragmentów DNA według wielkości i ich denaturacja in situ.

4. Przeniesienie fragmentów DNA z żelu na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy.

5. Związanie DNA z filtrem: w temperaturze 80°C lub poprzez naświetlanie UV.

6. Hybrydyzacja z sondą.

7. Ustalenie położenia fragmentów , do których zhybrydyzowała sonda z użyciem autoradiografii i reakcji barwnych lub fluorescencji

Hybrydyzację z sondą dzielimy na trzy etapy:

• Prehybrydyzacja:

• eliminacja niespecyficznego tła poprzez moczenie filtru w roztworze, którego składniki blokują miejsca mogące związać kwasy nukleinowe na filtrze,

• w celu zminimalizowania tła dodaje się również niehomologiczne DNA nośnikowe.

• Właściwa hybrydyzacja:

• wyznakowana sonda wiąże się z unieruchomionymi na filtrze kwasami nukleinowymi,

• wysoka homologia: temperatura (65°C), mniejsze stężenie soli, dodatek formamidu,

• częściowa homologia: temperatura (55°C) , wyższe stężenie soli.

• Płukanie filtru:

• usunięcie niezhybrydyzowanej sondy - jest to warunek specyficznego obrazu hybrydyzacji.

Zastosowanie hybrydyzacja Southern umożliwia:

• wykrycie rearanżacji genowych (np. delecje, insercje) większych niż 50 pz,

• badanie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych DNA - RFLP (restriction fragment length polymorphism).

Polimorfizm może mieć charakter naturalny lub może wystąpić w wyniku zmian mutacyjnych w DNA, które powodują zanikanie bądź pojawianie się miejsc restrykcyjnych.

Analiza RFLP wykorzystywana jest m.in. w badaniach dziedzicznych uwarunkowań chorób jak również w wykrywaniu mutacji somatycznych w badanych genach.

Hybrydyzacja Northern (ang. Northern blot hybridization)

Jest to metoda służąca detekcji kwasów rybonukleinowych (RNA). Najczęściej stosuje się ją do badania aktywności określonych genów(badanie ekspresji genów).

Metodyka zbliżona jest do hybrydyzacji Southern:

• rozdział elektroforetyczny RNA na żelu w warunkach denaturujących,

• przeniesienie RNA na odpowiednią membranę,

• utrwalenie RNA na membranie,

• hybrydyzacja RNA z sondą,

• odpłukanie nadmiaru sondy i detekcja.

Sonda daje sygnał proporcjonalny do ilości RNA obecnego na membranie, stąd po intensywności sygnału po detekcji można ilościowo oszacować poziom wykrytego RNA.

Hybrydyzacja DOT - BLOT

• metoda półilościowa,

• umożliwia jednoczesne wykrywanie i identyfikację wielu próbek na tym samym filtrze,

• pozwala na bezpośrednie stosowanie komórek hodowanych in vitro lub bakterii w miejsce kwasów nukleinowych,

• stosowana do wykrywania wirusów w diagnostyce chorób zakaźnych zwierząt chodowlanych.

DNA Fingerprinting (genetyczny odcisk palca)

• Metoda oparta na hybrydyzacji Southerna.

• Opracowana w 1984 roku przez Brytyjczyka Aleca Jeffreysa.

• Polega na izolowaniu i sporządzaniu obrazów fragmentów DNA.

• Wykorzystuje obecność w genomie polimorficznych sekwencji powtórzonych VNTR (variable number of tandem repeats) - zmienna liczba tandemowych powtórzeń.

Występowanie w eukariotycznym DNA sekwencji powtórzonych, cechujących się dużą zmiennością, nadaje DNA poszczególnych osobników cechy indywidualne.

Metodyka:

• trawienie wyizolowanego DNA odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, które tną kwasy nukleinowe w specyficznych miejscach,

• rozdzielenie i sortowanie poprzez rozdział elektroforeteczny pocięte fragmenty DNA,

• przeniesienie rozdzielonych fragmentów DNA na filtr nitrocelulozowy i hybrydyzacja z wyznakowanymi sondami,

• detekcja.

W wyniku hybrydyzacji VNTR z sondami molekularnymi rozpoznajacymi jednocześnie od kilkunastu do kilkudziesięciu loci otrzymuje się dla każdego osobnika charakterystyczny obraz fragmentów DNA tzw. DNA fingerprint.

Zastosowanie:

• badania medyczno - sądowe,

• ustalanie ojcostwa.

PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction)

• Najważniejsza metoda badawcza biologii molekularnej stosowana powszechnie w większości laboratoriów.

• Należy do najczęściej stosowanych technik biologii molekularnej.

• W znaczny sposób przyśpieszyła uzyskiwanie wyników w pracach nad poznaniem struktury i funkcji genów.

• Umożliwia specyficzną amplifikacje in vitro wybranych odcinków DNA i RNA.

• Reakcja ta odzwierciedla naturalny proces replikacji i umożliwia w warunkach In vitro szybkie powielenie wybranych odcinków DNA lub RNA (przepisanego na cDNA przy użyciu reakcji odwrotnej transkrypcji)

• Charakteryzuje się wysoką czułością, pozwala amplifikować DNA pojedynczych genów 1000000 razy.

• Powtarzanie cykli amplifikacji prowadzi do wzrostu ilości odpowiednich fragmentów DNA w postępie wykładniczym, 2n gdzie n oznacza liczbę cykli (po30-40 cyklach uzyskuje się powielenie fragmentu DNA kilka milionów razy) - produkty jednego cyklu amplifikacji służą jako matryce dla następnego
  Rys historyczny

• Izolacja polimerazy DNA z Thermus aquaticus (Chien 1974).

• Wydłużanie starterów przy udziale fragmentu Klenowa polimerazy I z E.coli (Panet i Khorana 1974).

• Cykliczne wydłużanie starterów (Saiki i wsp. 1985).

• Zastosowanie termostabilnej polimerazy (Mullis i Faloona 1987, Saiki i wsp. 1998).

Klonowanie genu (Lawyer i wsp. 1989).

Założenia reakcji

• Technika enzymatycznej amplifikacji określonych sekwencji DNA.

• Specyficzność reakcji zapewniają dwa startery komplementarne do sekwencji docelowej.

• Czułość reakcji pozwala amplifikować DNA pojedynczych genów ponad 1 000 000 razy mimo obecności innych sekwencji.

• Możliwość amplifikacji pojedynczych matryc.

Przebieg reakcji, cykle reakcji PCR:

• Denaturacja wstępna - 90-95 ºC przez 30-60 sek - rozdzielenie nici DNA pod wpływem temperatury,
  temperatura denaturacji zależna jest od:

• Składu zasad fragmentu DNA, który chcemy powielić (we fragmentach bogatych w GC temperatura jest wyższa),

• Odporności polimerazy na wysoką temperaturę (standardowo używana jest polimeraza Taq, która wytrzymuje temperaturę 94-95 ºC)

-Wiązanie starterów (annealing) - 50-65 ºC przez 30-60 sek, najbardziej istotny czynnik w optymalizacji reakcji, na ten etap ma wpływ temperatura, stężenie matrycy i startera oraz czas; jeżeli temperatura hybrydyzacji jest za wysoka - przyłączanie primerów jest niemożliwe. Przy zbyt niskiej temperaturze może zachodzić niespecyficzne przyłączenie starterów do wielu miejsc na matrycy - w efekcie powstaje duża ilość niespecyficznych produktów o nieznanej sekwencji.

- Wydłużanie łańcucha (extension) - 72 ºC - wydłużanie startera następuje zawsze od końca 3'-OH, sukcesywne dosyntetyzowanie DTP zachodzi najczęściej w temperaturze 72 ºC, aczkolwiek może być wyższa,
czas trwania polimeryzacji to 20 sekund - dla fragmentów do 500 pz i 40 sekund dla fragmentów do 1,2 kpz;
Proces ten katalizowany jest przez polimerazę DNA; szybkość reakcji w optymalnych warunkach dla polimerazy Taq wynosi od 2000 nukleotydów/min; dla całkowitej syntezy badanego fragmentu czas trwania tego etapu wyznaczamy zakładając połowę optymalnej prędkości

Skład mieszaniny reakcyjnej: Matryca (DNA, cDNA), para syntetycznych oligonukleotydów służących jako startery syntezy DNA, Trójfosforany deoksyrybonukleotydów dNTP (aATP, dCTP, dGTP, dTTP , kationy dwuwartościowe (Mg2+)_, Termostabilna polimeraza Taq, Bufor o pH 8,8

Matryca - nie może być zdegradowana ani zanieczyszczona

DNA musi być wysokocząsteczkowe, wolne od białek i inhibitorów enzymów

Etapy pobierania materiału, prawidłowego oznaczenia próbki, transportu, przechowywania i izolacji DNA są warunkami koniecznymi aby zagwarantować wysoką wydajność izolacji i wysoki stopień czystości DNA

1. Ilość DNA matrycowego użytego do reakcji PCR zależy od źródła jego pochodzenia

genomowy 0,1 - 1μg
plazmidowy lub fagowy 0,01-1 μg

2. Wyjściowa liczba matryc 3 x 10⁵

DNA człowieka 1 μg

DNA drożdży 10 ng

DNA E.coli 1 ng

3. Stopień czystości Pomiar UV

Elektroforeza

4. Metoda izolacji Inhibitory
Startery

1. Stężenie 0.1 - 0.5 μM

2. Stężenie wyjściowe 18 - 28 nt

3. Zawartość GC 50 - 60%

4. Tm 55 - 72ºC

5. Stężenie wyjściowe 200 - 1000 pmoli/μl

6. Stężenie robocze 10 pmoli/μl

Uwagi: Zbyt duże stężenie - niespecyficzny produkt.

Dimery starterów - komplementarne końce 3'

dNTP

1. pH 7.0

2. Stężenie wyjściowe 5 - 10 mM

3. Stężenie w reakcji 20 - 200 μM

4. Przechowywanie -20şC

Uwagi: Po 30 cyklach PCR 50% nukleotydów występuje jako dNTP. Korzystniej stosować mniej dNTP niż zbyt dużo. 20 μM każdego dNTP wystarcza do syntezy 2.6 ng DNA

lub 10 pmoli sekwencji o długości 400 pz.

MgCl₂

1. Jony Mg²⁺ wiązane są przez

Startery

Matrycę

Polimerazę

dNTP

2. Stężenie 0.5 - 2.0 mM

Polimeraza

1. Stężenie 0.5 - 5 jedn./100 μl

2. Przechowywanie -20ºC

3. Okres półtrwania 92.5ºC 2 godz.

92.0ºC 40 min.

97.5ºC 5 min.

4. Temperatura 68 - 72ºC

5. Synteza 30 - 100 nt/sek. (2 kpz/min)

Uwagi: Za dużo polimerazy - niespecyficzne produkty

Za mało polimerazy - brak produktu

Najczęstszy błąd - za dużo cykli

Liczba matryc Liczba cykli

3 x 10⁵ 25 - 30

1.5 x 10⁴ 30 - 35
Bufor

1. pH 8.3 - 8.8

2. Tris-HCL 10 - 50 mM

3. Sole <50 mM

4. „Wzmacniacze” reakcji

DMSO, Żelatyna, BSA, Tween 20

Przebieg

1. denaturacja 94-95ºC - rozplecenie podwójnej nici DNA, czas ok. 30-60s

2. wiązanie starterów - przyłączanie (hybrydyzacja) starterów do matrycy ustalana doświadczalnie w zależności od składu nukleotydowego starterów czas ok. 30-60 s

3. synteza nici przez polimeryzację Taq 72ºC- na tym etapie zachodzi właściwa amplifikacja pożądanego fragmentu genu czas ok. 30-60s

• reakcja PCR prowadzi do wzrostu ilości pożądanego fragmentu DNA

• przerost ilości produktu wzrasta 2^n, gdzie n oznacza liczbę cykli, tak więc liczba matryc wzrasta wykładniczo np., po 30 cyklach liczba matryc wynosi 107 374 824 (2^30)

• produkty jednego cyklu amplifikacji służą jako matryca dla następnego cyklu

• produkt PCR jest dwuniciowym fragmentem DNA, którego końce określone SA przez sekwencję obu starterów

Analiza produktów PCR

1. Elektroforeza w żelach agarozowych

- barwienie bromkiem etydyny,

- autoradiografia.

2. Elektroforeza w żelach poliakryloamidowych

- barwienie bromkiem etydyny, srebrzenie,

- autoradiografia, fluorografia.

• Elektroforeza to rozdział cząsteczek posiadających ładunek w polu elektrycznym

• Ruchliwość elektroforetyczna jest proporcjonalna do ładunku i odwrotnie proporcjonalna do wielkości cząsteczki, zależy tez od kształtu

• Elektroforeza agarowa odbywa się w żelu agarowym zanurzonym w buforze do elektroforezy

• W zależności od wielkości rozdzielanych cząsteczek stosuje się żele o różnym stężeniu. Produkty o wielkości 100-500pz - żel 2% 0,5 - 1 kpz - żel 1,5%

• Produkt PCR zaopatrzony w barwnik zanoszony (?) jest do studzienek

• Po włączeniu napięcia produkt migruje w żelu

• DNA posiada ładunek (-) w polu elektrycznym migruje od katody (-) do anody (+)

• W zależności od wielkości cząsteczki, kształtu produkt PCCR z różną szybkością oddala się od miejsca nałożenia. Po zakończeniu elektroforezy żel wybarwia się (bromek etydyny) i ocenia się w świetle UV

• Produkt PCR powinien być widoczny na żelu w postaci dobrze widocznego prazka o określonej wielkości

Zastosowanie PCR:

• klonowanie (YAC, BAC, minigeny), hybrydyzacja (klony cDNA, produkty PCR), amplifikacja

• analiza funkcji i ekspresji genów, diagnostyka prenatalna, wykrywanie GMO

• mikrobiologiczne - wykrywanie bakterii, wirusów, pasożytów (np. wirus HIV, prądki gruźlicy)

• onkologia - wykrywanie mutacji w onkogenach, genach supresorowych, monitorowanie przebiegu choroby, określenie predyspozycji do chorób nowotworowych

• wykrywanie zmian w genomowym DNA w chorobach genetycznych

• transplantologia - badania zmienności genów HLA decydujących o przyjęciu/odrzuceniu przeszczepu

• medycyna sadowa - badania ojcostwa, kryminalistyka, identyfikacja osobnicza

RT-PCR PCR (ang. Reverse transcriptase PCR)

Matrycą wyjściową jest mRNA, które w procesie odwrotnej transkrypcji jest przepisywane na komplementarne DNA (ang. complementary DNA - cDNA). Następnie cDNA ulega amplifikacji, jak w zwykłym PCR.

Zastosowanie: Badanie ekspresji genów.

PCR multipleks

Metoda polega na jednoczesnej amplifikacji kilku fragmentów DNA, różniących się wielkością, co w praktyce polega na użyciu w jednej mieszaninie reakcyjnej kilku par starterów.

Zastosowanie: Jednoczesna amplifikacja kilku regionów jednego lub kilku genów. W jednej reakcji uzyskać można nawet 13 amplikonów.

PCR-RFLP (ang. restriction fragment length polymorphism PCR)

Połączenie reakcji PCR z analizą restrykcyjną. Produkty amplifikacji poddaje się działaniu enzymu restrykcyjnego i porównuje wzór powstałych prążków.

Zastosowanie: Wykrywanie znanych mutacji/polimorfizmów. Analiza bezpośrednia - mutacje. Analiza pośrednia - polimorfizmy

Real-time PCR (PCR w czasie rzeczywistym)

Metoda ilościowa pozwalająca na obserwowanie amplifikacji w czasie rzeczywistym. Wraz z przybywaniem produktów PCR wzrasta intensywność fluorescencji rejestrowanej przez detektor. Odzwierciedlone jest to w postaci wykresu na monitorze komputera.

Zastosowanie: Pomiar liczby cząsteczek wirusów lub bakterii w materiałach klinicznych, u możliwia monitorowanie postępów leczenia (określenie wyjściowego poziomu wiremii lub bakteriemii jest wskazaniem koniecznym do rozpoczęcia właściwego leczenia).

Nested-PCR (PCR gniazdowy)

Stosowane są dwie pary starterów: zewnętrzna (komplementarna do końców poszukiwanej sekwencji) i wewnętrzna (przyłącza się przyśrodkowo w stosunku do pierwszej pary starterów). Produkt powstały po amplifikacji z pierwszą parą starterów poddaje się kolejnej amplifikacji z druga parą. Zapewnia to większą specyficzność metody.

Zastosowanie: Szybka diagnostyka zakażeń wirusowych.

RAPD-PCR (ang. random amplified polymorphic DNA)

Wykorzystywana, gdy nieznane są sekwencje specyficzne. Stosuje się krótkie uniwersalne startery, którymi amplifikuje się zbiór produktów, a ich liczba i długość są zależne od sekwencji nukleotydowej matrycy oraz warunków reakcji.

Zastosowanie: Określenie zmienności genetycznej bez informacji o sekwencji analizowanego DNA

RACE-PCR (ang. rapid amplification of cDNA ends)

Technika umożliwiająca otrzymanie pełnej długości sekwencji gdy znany jest tylko fragment.

Zastosowanie: Klonowanie cDNA.

ASA-PCR(ang. allele specific amplification)

Technika umożliwiająca wykrywanie mutacji przy pomocy specyficznych oligonukleotydów. Oprócz starterów flankujących stosuje się starter w pełni komplementarny do allela z mutacją lub startery, z kórych jeden jest w pełni komplementarny do allela z mutacją a drugi do allela niezmutowanego. Startery są tak zlokalizowane, że w wyniku PCR powstają produkty różniące się długością w zależności od genotypu użytej próbki DNA.

Zastosowanie: Wykrywanie znanych mutacji.

Competitive-PCR (PCR konkurujący)

W mieszaninie reakcyjnej umieszcza się DNA badane oraz DNA kontrolne o znanym stężeniu. W wyniku konkurowania o reagenty ilość produktu DNA kontrolnego będzie odwrotnie proporcjonalna do ilości DNA badanego w probówce.

Zastosowanie: Ocena ilościowa produktu.

ĆW 2 MIKROMACIERZE DNA

Zastosowanie badań molekularnych:

• wykrywanie mutacji związanych z chorobami

• monitorowanie chorób o podłożu genetycznym

• śledzenie sposobu dziedziczenia mutacji genetycznych w rodzinach oraz ustalenie nosicielstwa chorób genetycznych

• określenie ekspresji genów

• identyfikacja mutacji - określenie rodzaju mutacji

• w kryminalistyce do identyfikacji osób, ustalenia spraw przestępstw w oparciu o badania sladów biologicznych

• w dochodzeniu ojcostwa

Uzyskanie ostatecznych wyników diagnostycznych w badaniach molekularnych:

• ocena polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych - RFLP

• określenie długości badanego fragmentu DNA

• określenie sekwencji badanego odcinka DNA

Metoda DNA microarray (mikromacierze DNA, mikrosiatki DNA, mikromoduły DNA, mikroprocesory DNA, chipy DNA)

Półilościowa metoda wykrywania

• genów lub ich fragmentów

• ekspresji genów

• mutacji w genach

oraz porównania genów np. w celu badania ich ewolucji.

Przy użyciu zestawu kilkiset lub kilku tys. sond oligonukleotydowych, które umieszczone są w postaci plamek na jednaj płytce o wielkości mikroskopowego szkiełka nakrywkowego tworząc tzw. chipy genowe

DNA microarray - płytka szklana lub plastikowa z naniesionym w regularnych pozycjach mikroskopowej wielkości polami (ang. Spots) zawierającym fragmenty DNA różniące się od siebie sekwencją nukleotydów. Fragmenty te są sondami, które wykrywają poprzez hybrydyzację komplementarne do siebie cząsteczki DNA lub RNA. Bardzo czuła metoda i musi być zachowana czystość. W tej technice sond się nie znakuje np. materiał badany fluorochromami

Rodzaje macierzy:

• ze względu na budowę sond

• mikromacierze oligonukleotydowe - na płytce naniesione są krótkie na ogół 25-70 nukleotydowe sekwencje sond

• mikromacierze cDNA - sondy znacznie dłuższe zazwyczaj odpowiadające pełnym sekwencjom mRNA, co w praktyce oznacza zazwyczaj kompletną sekwencję wariantu genu

• ze względu na wykrywanie sekwencji

• mikromacierze do badania ekspresji genów najczęściej stosowane -sondy w obrębie sekwencji mRNA

• macierze eksonowe (sondy to sekwencje eksonów)

• macierze pokrywające genom ( do badania ekspresji obszarów pozagenowych)

• macierze do badania splicingu

• mikromacierze do badania sekwencji genów

• macierze SNP - odróżnianie jednonukleotydowych polimorfizmów DNA

Etapy metody:

1. Synteza jednoniciowych sond DNA w milionach kopii każda umieszczenie w postaci plamek na jednaj płytce i przymocowanie chemiczne lub elektryczne do podłoża. Wszystkie kopie unikalnej sondy zgromadzone są w jednaj plamce o powierzchni ok. 90x90μm. Plamki ułożone są w siatce , a ich pozycje odznaczone są w obu siach płytki

2. Przygotowanie badanego (jednoniciowego) DNA lub cDNA (przepisane z mRNA) wyizolowanego z komórki np. nowotworu

3. Wyznakowanie fluorochromem (np. Cy 3,Cy 5) badanego materiału

4. wprowadzenie badanego materiału do plamek z poszczególnymi sondami. DNA lub cDNA jest wiązany do sond na zasadzie komplementarności zasad (hybrydyzacja)

5. Niezwiązany lub słabo związany DNA lub cDNA jest usuwany na etapie odpłukiwania.

Detekcja

• DNA lub cDNA wcześniej wyznakowany fluorochromem w celu umożliwienia wizualizacji hybrydów

• plamki z hybrydami oświetlane światłem laserowym (…)

• obraz sczytuje ilościowo (za pomocą lasera lub mikroskopu)

• intensywność sygnału dla poszczególnych sond jest proporcjonalna do ilości kw. nukleinowego o danej sekwencji w próbce oraz siły wiazania

Analiza

• dane z mikromacierzy trzeba poddać wstępnej obróbce

• analiza zeskanowanego obrazu - obliczenia intensywności sygnału dla każdej sondy

• odjęcie sygnału sondy

• normalizacja danych - modyfikowanie wartości ekspresji w celu dostosowania do całości eksperymentu lub do zamierzonego rozkładu, niezbędna dla porównywania intensywności między macierzami

• sumaryzacja danych - podsumowanie wartości dla grup sond.

Może być wykonywane dla każdej grupy sond osobno lub za pomocą globalnego modelu dla całego doświadczenia.

Umożliwia

• udoskonalenie i ułatwienie diagnostyki chorób o podłożu genetycznym oraz prognozowanie ich przebiegu

• zindywidualizowanie toku leczenia poszczególnych pacjentów w zależności od ich swoistej postaci choroby

Obawy Genechip

• drobny ślad biologiczny (kropla krwi, włos) ->brama do wiedzy o całym genomie

• automatyzm i szybkość badania

• potencjalne sytuacje: zatrudnienie elita genetyczna, ubezpieczenie dyskryminacja, wybór partnera życiowego eugenika, wybór embrionu eugenika

ĆW. 3 BADANIA CYTOGENETYCZNE

Cytogenetyka kliniczna - dział genetyki zajmujący się badaniami chromosomów w komórkach organizmu ludzkiego, ich abberacji oraz związku nieprawidłowości z obrazem klinicznym.

Badania cytogenetyczne - genetyka komórki jądrzastej; bada się chromosomy w metafazie, oznaczenie kariotypu, liczby i struktury chromosomów

Metody badań cytogenetycznych:

• klasyczne badania cytogenetyczne - polega na ocenie liczby i morfologii chromosomów uzyskanych z jądek komórek poddawanych hodowli komórkowej

• cytogenetyka molekularna:

• FISH - fluorescencyjna hybrydyzacja in situ pozwala na badanie jądek komórkowych w stadium metafazy jak i interfazy przy wykorzystaniu odpowiedniej sondy molekularnej

• CGH - porównywawcza hybrydyzacja genowa to modyfikacja metody FISH. Wykrywa obecność dodatkowego lub brak materiału genetycznego

Kariotyp konstytucyjny - ten, z którym się rodzimy; z krwi, płynu owodniowego

Kariotyp nabyty - powstał w wyniku choroby(np. nowotwory); nie dziedziczy się

Wskazania do badań cytogenetycznych:

• Badania postnatalne: wystąpienie zespołu wad rozwojowych i lub cech dysmorficznych, podejrzenie zespołu genetycznego np. zespołu Downa, opóźnienie rozwoju psychoruchowego i lub umysłowego, brak cech dojrzewania płciowego lub cechy przedwczesnego dojrzewania płciowego,kliniczne zaburzenia wzrostu, pierwotny lub wtórny brak miesiączki o nieustalonej etiologii, choroba recesywna związana z chromosomem X u dziewczynki lub kobiety, więcej niż dwa poronienia samoistne, wykrycie abberacji chromosowej w badaniu prenatalnym płodu pacjentki, niepłodnośc nieznanego pochodzenia, przed zabiegiem in vitro, występowanie znanej abberacji strukturalnej w rodzinie

• Badanie prenatalne - wiek matki powyżej 35rż, urodzenie dziecka z abberacją chromosomalną, urodzenie żywe lub martwe dziecko z wadami wrodzonymi, wystąpienie abberacji u jednego z partenrów, pokrewieństwo rodziców, nieprawidłowości w przesiewowym badaniu USG i lub testów biochemicznych w surowicy krwi matki

Materiał do analizy cytogenetycznej:

• krew obwodowa - limf T, badania postnatalne

• fibroblasy - gdy wynik kariotypu konstytucyjnego krwi obwodowej nie odpowiada fenotypowi pacjenta

• komórki kosmówki - droga aspiracji przez powłoki brzuszne, między 8 a 11 tyg; materiał trzeba oczyścić z tkanki matczynej

• amniocyty - komórki płodu pochodzące z owodni - skóra, ukł pokarmowy, moczowy; badania prenatalne (amnipunkcja wczesna: 11-14 tyg, późna: 15-17 tyg)

• szpik kostny (białaczki) - kariotyp nabyty

• komórki guzów litych: płyny wysiękowe, biopsja guza. Należy mechaniczne rozdrobnić tkanki, wrzucić do naczynia hodowlanego, dodać kolagenozę. Powstaje pierwotna zawiesina komórkowa przeznaczona do hodowli

• krew pępowinowa

Etapy hodowli w badaniu cytogenetycznym:

• pobranie:

• jałowe pobranie krwi na heparynę o temp 37 st.C lub 4 st.C

• ok. 5 ml (krew), 2-4 ml (szpik)

• zakładanie hodowli komórkowej (w 2 sterylnych flakonach)

• 4 ml pożywki RPMI z 1 ml płodowej surowicy cielęcej lub surowicy AB

• mitogen np. LF-7 (mukoproteina z wyciągu z fasoli), PHA - fitohemaglutynina (0,2 ml)

• antybiotyk

• krew

• mitogen dodajemy w zależności od rodzaju białaczki. Warunki hodowli: 37 st.C, 5% CO2, 24 - 72 h, wilgotność. Na 1,15 h przed zakończeniem hodowli dodajemy kolcemid, aby zahamować powstawanie wrzeciona kariokinetycznego.

• zahamowanie hodowli i opracowanie:

• odwirowanie 1500 obr/min przez 10 min

• supernatant odlewamy, ważny jest osad; komórki muszą pęknąć

• szok hipotoniczny (0,075 M KCl, 37 st.C): 40 min - szpik kostny, 30 min - krew

• odwirowanie 1500 obr/min przez 10 min

• 3x utrwalanie w mieszaninie metanol : lodowaty kwas octowy w stosunku 3 : 1 (4 st.C, I utrwalacz - 30 min, II i III - 15 min)

• materiał taki kładziemy na szkiełko i szukamy metafaz. Ważne, aby uzyskać chromosomy o dużej rozdzielczości prążkowej (400, 550 lub 1250).

Metody otrzymywania chromosomów większej rozdzielczości w stadium profazy i prometafazy:

• naturalna - wyszukiwanie metafaz profazalnych i prometafazalnych

• zapobieganie spiralizacji przez dodanie substancji interkalujących (bromek etydyny, aktynomycyna D), które hamują kondensację.

• zablokowanie cyklu komórkowego przejściu G1-S - najczęściej stosowany metotreksat; synchronizacja hodowli za pomocą ametopteryny lub tymidyny w celu zwiększenia w hodowli liczby komórek w stadium profazy i wczesnej metafazy.

Techniki prążkowe - umożliwiają precyzyjną identyfikację każdego chromosomu, identyfikację brakującego lub dodatkowego materiału chromosomowego(o wielkości co najmniej 4Mb), wybarwienie konkretnych fragmentów:

• GTG (prążki G, trypsyna, Giemsa) - najczęściej stos. do oceny kariotypu ,tą metodą uzyskuje się 300-400 prążków ciemnych i jasnych charakterystyczne dla każdej pary chrom. Prążki ciemne zawierają skondensowaną chromatynę = heterochromatynę (dostęp trypsyny do niej jest utrudniony), bogatą w pary zasad A-T, zawierającą stos. mało aktywnych genów. Jest to obszar wolnoreplikujący (replikuje się późno w fazie S) Prążki jasne zawierają euchromatynę, 80% aktywnych genów, dużo par C-G, obszary te replikują się wcześnie. Aby widoczne były mutacje musi być min. 400 prążków na kariotyp. W profazie i prometafazie rozdzielczość jest max.(występuje Ok. 500-850 prążków na kariotyp-możliwe jest stwierdzenie mikromutacji).

• GTW (pr.G, trypsyna, b.Wrighta)

• CBG (prążki C, Ba(OH)2, Giemsa) - Ba(OH)2 wiąże się z heterochromatyną konstytucyjną (występuje ona w centromerach wszystkich chromosomów, w okolicach satelitarnych chromosomów akrocentrycznych-13,14,15,21,22, na końcu ramienia długiego chromosomu Y); dotyczy chromosómów 1,9,16

• QFQ (pr.Q, fluorochrom, quinakryna) - wybarwiają się okolica centromeru chromosomu 3, okolica centromeru i regionu satelitarnego chromosomów akrocentrycznych 13, 14, 15, 21, 22 oraz odcinki dystalnej ramion długich chromosomu Y

• RHG (pr.R, hydroliza na ciepło, Giemsa) - prążki barwią się na odwrót niż w GTG, metoda ta może być użyteczna w badaniu aberracji w regionach telomerowych.

• AgNOR - organizatory jąderkowe traktowane azotanem srebra; stosowane przy białaczkach, bo występuje duża proliferacja i duże organizatory jąderkowe. Identyfikowane w chromosomach akrocentrycznych13-15, 21-22 oraz ich wariantów akrocentycznych

Rozdzielczość prążków - im wyższa tym większa liczba prążków, która daje możliwość zidentyfikowania większej ilości abberacji. Standardowo 400-550 prążków na haploidalny zestaw chromosomów (identyfikacja abberacji liczbowych). Minimum 550 (aberacje strukturalne). 850 lub > (mikrodelecje związane z zespołami wad)

Kariogram - zestaw poukładanych parami chromosomów

Klasyfikacja chromosomów:

A - 1, 2, 3 - duże metacentryczne

B - 4, 5 - duże submetacentryczne

C - 6 - 12, X - średnie submetacentryczne

D - 13 - 15 - duże akrocentryczne

E - 16 - 18 - małe submetacentryczne

F - 19 - 20 - najmniejsze submetacentryczne

G - 21 - 22, Y - małe akrocentryczne

Chromosom Y- heterochromatyna w długich ramionach

ĆW. 4 ABERRACJE CHROMOSOMOWE

Aberracje - zaburzenia w liczbie lub strukturze chromosomów; mutacje materiału genetycznego widoczne pod mikroskopem świetlnym (najmniejszy widoczny dodatek lub delecja wynosi ok. 0,13%, czyli 4 mln pz), do aberracji może dochodzić spontanicznie lub pod wpływem działania czynników mutagennych takich jak :promieniowanie UV, jonizacja, wysoka temperatura i inne.

• liczbowe (nieprawidłowa liczba chromosomów)

• aneuploidia - 2n - 1, 2n +1 (złe rozchodzenie się chromosomów = nondysjunkcja)

• poliploidie - 3n, 4n; powstają: z zapłodnienia komórki jajowej przez 2 lub więcej plemników, zaburzenia podziału zygoty, zaburzenia podziału dojrzałego jaja lub plemnika i powstanie gamety diploidalnej;

• strukturalne (komórki somatyczne zawierają jeden lub więcej chromosomów nieprawidłowych; mogą dotyczyć autosomów lub chromosomów płci):

• zrównoważone - nie ma zmiany w ilości materiału genetycznego, np. translokacja wzajemna, inwersja; skutki nie zawsze są widoczne: zmiana ramki odczytu; są przyczyną powstawania w mejozie gamet z nieprawidłowym zestawem chromosomów. Może być przekazana na następne pokolenie jako zrównoważona lub niezrównoważona

• niezrównoważone - zwiększenie materiału, np. duplikacja, addycja lub ubytek - delecje; skutki fenotypowe są widoczne

Aberracje strukturalne

a) Translokacje - przemieszczenie materiału pomiędzy chromosomami:

• wzajemne - wymiana materiału między 2 chromosomami np. t(8;22)(q34;q11); powstaje w wyniku złamań chromosomów niehomologicznych lub przez przypadkową rekombinacje między chromosomami podczas mejozy

• robertsonowskie = fuzje centryczne; dotyczy chromosomów akrocentrycznych grupy D i G, w których złamanie następuje w centromerze lub blisko niego; powstaje chromosom z 2 centromerami; krótkie ramiona zawierające nieczynną genetycznie heterochromatynę są eliminowane

• insercje - jeden chromosom ma 2 pęknięcia, a drugi jedno, np. ins(6;18)(q21-22;q221)

b) Inwersje - chromosom pęka w dwóch miejscach i dochodzi do odwrócenia materiału genetycznego 180 st

• paracentryczne - złamanie w obrębie jednego ramienia np. inv(6)(q25;q31)

• pericentryczne - złamanie w obrębie dwóch ramion łącznie centromerem np. inv(6)(p22;q31)

Duplikacje - podwojenie fragmentu chromosomu np. dup(6p)

Chromosom kolisty - powstaje przez delecję części terminalnej ramiona krótkiego bądź długiego „lepkie” końce, które łączą się; układa prążków jest zachowany; są one niestabilne i w czasie podziału powstaje chromosom dicentryczny

Izochromosom - powstaje w wyniku poprzecznego podziału centromeru; duplikacja jednego ramienia i delecja drugiego; skutki fenotypowe: najczęściej ilościowe zmiany letalne np. i(X)(p10) oraz i(X)(q10)

Chromosomy markerowe - pochodzenie i mechanizm powstawania jest nieznany. Najczęściej jest to chromosom akrocentryczne lub metacentryczne.

Addycja - dodatkowy materiał chromosomowy nieznanego pochodzenia np. add(19)(p13)

Chromosom pochodny - znane są okolice i centromer danego chromosomu der(6)t(6;18)

c) Delecje - utrata fragmentu chromosomu

• terminalna - złamanie w części dystalnej chromosomu np. del(6)(q34)

• interstycjalna - podwójne złamanie np. del(6)(q25;q34)

• chromosom pierścieniowy - 2 delecje terminalne -> powstają lepkie końce, które łączą się

• mikrodelecje - utrata fragmentu, którego wielkość zbliżona jest do granicy rozdzielczości mikroskopii świetlnej. Można je wykryć za pomocą specjalnych technik biologii molekularnej.

Jeżeli aberracja chromosomowa obecna jest we wszystkich komórkach somatycznych, mówimy wówczas o homogenności.

Mogą jednak istnieć różne linie komórkowe - z aberracja i bez, nazywamy to mozaikowością.

Może mieć również miejsce mozaikowatość gonadalna komórki somatyczne i gonady mają różny kariotyp

ĆW. 5 FLUORESCENCYJNA HYBRYDYZACJA IN SITHU (FISH)

FISH łączy w sobie elementy cytogenetyki klasycznej i metod molekularnych.

Zasada metody: hybrydyzacja polega na tworzeniu dwuniciowych kompleksów między sondą molekularną a badanym jednoniciowym fragmentem DNA lub RNA (zgodnie z zasadą komplementarności).

Fragment DNA znakowany i doprowadzany do formy 1- niciowej przez ogrzanie i gwałtowne ochłodzenie → nakładany na wysuszone powietrzem, zdenaturowane preparaty chromosomów → przyłączona do odpowiadających jej w chromosomie sekwencji sonda molekularna widoczna w mikroskopie.

Metoda mapowania sklonowanych sekwencji DNA stos. standartowo, wynik 1-2 dni!

Znakowanie nie izotopowe oparte na wbudowywaniu biotyny do sondy DNA. Miejsce hybrydyzacji wykrywane przy użyciu antybiotyny (streptawidyny) sprzężonej z barwnikiem fluorescencyjnym. Kompleks analizowany w mikroskopie fluorescencyjnym zhybrydyzowane sekwencje musza być odlegle od siebie o min. 1 Mb.(chromosomy metafazowe) większa rozdzielczość metody przy użyciu mniej skondensowanych chromosomów w jądrach interfazowych (tu możliwe rozróżnienie sygnałów odległych o 50-100 kb), jeszcze większa rozdzielczość w met. gdzie włókna chromatynowe uwalniane są ze szkieletu białkowego (fiberFISH) tu możliwe rozróżnienie sekwencji odległych o mniej niż 10 kb.

Sonda molekularna - fragment DNA, którego sekwencja nukleotydów jest specyficzna względem badanego regionu. Sondą może być:

• syntetyczny lub naturalny gen lub jego fragment

• syntetyczny oligonukleotyd

• cDNA

• fragment chromosomu

• fragment genomowego DNA

Metody otrzymywania sond:

• klonowanie odpowiedniego fragmentu DNA

• synteza chemiczna (20 - 50 pz)

• sondy złożone otrzymuje się przez klonowanie całego chromosomu, cięcie go enzymami restrykcyjnymi, elektroforeza, denaturacja

Fluorochrom - rodamina barwnik czerwony, FITC zielony, czerwień Texasu czerwony, DAPi niebieski

FISH - interfazalny i metafazalny

• materiał po hodowli, rozmaz krwi lub szpik kostny, musi być utwardzony

• szkiełko odtłuszczone

• chromosomy nie mogą być w cytoplazmie, utrudniona jest penetracja sondy

• materiał nie może być zbyt gęsto i zbyt rzadko naniesiony na szkiełko

Etapy hybrydyzacji: 1.Sporządzanie i wyznakowanie sondy; 2. Przygotowanie preparatu; 3. Denaturacja sondy i preparatu; 4. Hybrydyzacja

Etapy: materiał na szkiełko, dehydratacja szkiełka (alkohol), nałożenie sondy, zaklejenie szkiełka klejem, denaturacja materiału i sondy, hybrydyzacja w 37st, 12h w ciemności, odpłukiwanie, nałożenie PAPi, detekcja sondy, analiza (mikroskop fluorescencyjny, źródło promieniowania- lampa rtęciowa, zestaw filtrów, aparat cyfrowy lub system komputerowy)

Rodzaje sond:

• specyficzne (unikatowe) dla danej sekwencji DNA

• do identyfikacji mikrodelecji, geny fuzyjne, submikroskopowe aberracje, w czasie metafazy i oraz jądra interfazowe, fuzje genowe - analizuje się przy białaczkach - 95% pacjentów z CML ma t(9;22)(q34;q11) z fuzją genową BCR/ABL1 (tzw. PH) i ABL1/BCR (9q+), identyfikacja pewnych genów istotnych w rozwoju nowotworów

• mikrodelecje zespoły: Williamsa 7q11.23, DiGoerga 22q11.2, Millera Diekera 17p13.3, Cri Du chat sp15, Retinoblastoma 13q14, Pradego-Willera/ Angelmana 15q12

• komplementarne do sekwencji powtórzonych

• w czasie metafazy oraz jądra interfazowe, centromerowe- α satelitarne DNA komplementarne do tandemowych powtórzeń (171 pz) , telomerowe- komplementarne do telomerów składających się z krótkich sekwencji powtarzalnych, komplementarne do heterochromosomów konstytutywnych, wykorzystuje się je przy przeszczepach, w celu sprawdzenia jak się przyjęły, gdy dawca i biorca różnili się płcią = chimeryzm przeszczepowy)

• złożone (malujące) dla całego chromosomu lub ramienia

• w czasie mateafazy, chromosomy markerowe, dodatkowy materiał chromosomowy, złożone lub ukryte translokacje, aneuploidie, zaburzenia ilości chromosomów płci, zastosowanie do translokacji wzajemnych, translokacji złożonych - 3 lub więcej chr, M FISH = Mulitcolor FISH (różne kolory dla każdej pary)

Zastosowanie sond i FISH'a:

• wykrywanie addycji chromosomowych nieznanego pochodzenia

• identyfikacja chromosomów markerowych

• wyjaśnienie charakteru translokacji złożonych

• wykrycie mikrodelecji

• wyjaśnienie złożonych aberracji struktury

• identyfikacja aberracji liczbowych

• badanie struktury i organizacji chromosomów (mapowanie i ekspresja genów)

ĆW. 6 CHOROBY MONOGENOWE

Cele analizy genetycznych uwarunkowań dobrostanu:

• ocena ryzyka wystąpienia u płodu chorób uwarunkowanych genetycznie, wad rozwojowych

• wyodrębnienie ciąż wysokiego ryzyka i rozpoznanie patologii genetycznych; współudział w kształtowaniu dalszych decyzji diagnostycznych i leczniczych

• określenie ryzyka genetycznego dla następnej ciąży

Ryzyko genetyczne:

• jest oceniane jako prawdopodobieństwo wystąpienia zdefiniowanego zaburzenia

• powinno być ocenione ilościowo

• dotyczy zawsze określonej pary

• małe < 5 % - teoretyczne wyliczone z praw Mendla dla chorób jednogenowych, rodzinnych abberacji strukturalnych chromosomów

• średnie 5 - 10 % - zmodyfikowane jak wyżej z uwzględnieniem dodatkowych poprawek

• duże > 10% - empiryczne z obserwacji populacyjnych dla chorów wielogenowych, abberacji liczbowych chromosomów, zespołów wad

• teoretyczne:

• wyliczone z praw Mendla dla chorób jednogenowych

• rodzinnych aberracji strukturalnych chromosomów

• zmodyfikowane: jw. z uwzględnieniem

• dodatkowych poprawek

• empiryczne:

• z obserwacji populacyjnych, dla chorób wielogenowych, aberracji liczbowych chromosomów, zespołów wad

Techniki diagnostyki genetycznej:

• analiza rodowodowo - kliniczna: dane o zachorowaniach, utratach ciąż, niepłodności w zakresie wszystkich krewnych I°, wsparte dokumentacją lekarską, fotograficzną itp. Weryfikacja charakteru dziedziczenia; niekiedy może być nietypowy w określonej rodzinie. Taki sam fenotyp może wynikać z różnych uwarunkowań. Zapis symboliczny umożliwia lepszą orientację w uwarunkowaniach.

• analiza fenotypu

• analizy laboratoryjne

• diagnostyka cytogenetyczna

• diagnostyka molekularna DNA i RNA

• diagnostyka biochemiczna

Dziedziczenia autosomalne dominujące i recesywne

• wg Mc Kusicka z roku 2000 - 11 000 chorób monogenowych, obecnie około 16 000

• 10671 cechy zlokalizowane na autosomach

• 624 na chromosomie X

• cechy monogenowe - cechy mendlowskie: zasady segregacji, zasady niezależnego doboru

Prawa Mendla:

• zasada segregacji: organizmy rozmnażające się w sposób płciowy posiadają geny, które występują parami, ale tylko jeden gen danej pary jest przekazywany potomstwu.

• zasada niezależnego doboru: geny zlokalizowane w różnych loci są przekazywane kolejnym pokoleniom niezależnie.

Prawdopodobieństwo genetyczne - jest to procentowa możliwość wystąpienia danego wyniku w serii zdarzeń

Genotyp - genetyczna budowa jednostki w badanym locus.
Fenotyp - rzeczywisty obraz fizyczny lub kliniczny danej jednostki. Jest wynikiem współdziałania pomiędzy genotypem i czynnikami środowiskowymi.
Rodowód - określa związki pomiędzy członkami rodzin i pokazuje, którzy z nich są dotknięci chorobą genetyczną, a którzy nie.

Dziedziczenie autosomalne dominujące:

• 1/200 osób

• chory rodzic może przekazać swoim dzieciom gen „zdrowy” lub „chory”

• prawdopodobieństwo - 1/2

• osobnicy obu płci wykazują cechę chorobową w równych proporcjach

• dana cecha pojawia się w każdym pokoleniu (pionowy schemat przekazywania choroby)

• chora heterozygota przekazuje cechę połowie swoich dzieci

• choroby jednogenowe AD - penetracja genu

• manifestuje się „w pionie” niezależnie od płci, niekiedy częste mutacje de novo ( wtedy izolowana, ryzyko rośnie z wiekiem ojca), ale zwykle wywiad dodatni ryzyko rzeczywiste zwykle mniejsze od teoretycznego ze względu na niższą penetrację i ekspresję mutacji

• ekspresja zależna od genów modyfikujących i środowiska, penetracja od charakterystyki mutacji

• niekiedy homozygoty nie przeżywają do terminu porodu

• zróżnicowany obraz choroby

• wpływ na ekspresje genu ma środowisko

• zjawisko „luki genetycznej” osoba bez objawów jest nosicielem

• przykłady chorób AD: defekty białek strukturalnych, Predyspozycje do nowotworów, Fakomatozy, Pląsawica Huntingtona, PKD, Otoskleroza

Dziedziczenie autosomalne recesywne:

• rodzice osób chorych na choroby recesywne to heterozygotyczni nosiciele

• 1/4 potomstwa będzie zdrowymi homozygotami, 1/2 fenotypowo zdrowymi heterozygotami, 1/4 homozygotami, u których wystąpi choroba

• choroby występują u jednego lub kilku członków rodzeństwa, ale nie we wcześniejszych pokoleniach

• mężczyźni i kobiety chorują w równych proporcjach

• średnio 1/4 potomstwa dwóch heterozygotycznych nosicieli będzie dotknięta chorobą

• najczęściej choroba ujawnia się w związkach pokrewieństwa (większe prawdopodobieństwo posiadania wspólnych genów)

• choroby jednogenowe AR - penetracja genu:

• choroba manifestuje się „w poziomie”,

• wywiad rodzinny często ujemny

• występuje równie często u obu płci, częstsze w małżeństwach krewniaczych ryzyko zmodyfikowane zwykle równe teoretycznemu często możliwa identyfikacja nosicieli

• przykłady chorób AR: mukowiscydoza, Bloki metaboliczne, Retinitis, Defekty reparacji DNA, SLO, Immunodeficyty i in.

Choroby sprzężone z chromosomem X:

• manifestują się w pionie współwystępując zazwyczaj z płcią

• mogą być dziedziczone recesywnie lub dominująco

• recesywny mogą manifestować się u kobiet (homozygota, delecje X),

• u kobiet obligatoryjne nosicielstwo, mozaikowość somatyczna

• dominujące manifestują się u kobiet i mężczyzn, męskie hemizygoty i żeńskie homozygoty niekiedy nie dożywają do terminu porodu

• przykłady: hemofile A i B, DMD/BMD, AIS, FRA-X, nsXMR, SMA, Retinitis, Alport S., OFDS, Incontinentia pignenti, Krzywica oporna na vit D

Nietypowe choroby jednogenowe:

• choroby sprzężone z chromosomem Y: tylko w linii męskiej, defekty spermatogenezy

• mutacje genomu mitochondrialnego: dziedziczenie matczyne

• mutacje dynamiczne: antycypacja, w dziedziczeniu dominuje zwielokrotnienie 3 nukleotydów, objawy po przekroczeniu krytycznej ilości powtórzeń, w każdym kolejnym pokoleniu ujawnia się szybciej i jej przebieg jest cięższy np. Pląsawica Huntingtona, zespół łamliwego chromosomu X

ĆW. 7 DZIEDZICZENIE WIELOGENOWE, WIELOCZYNNIKOWE

Dziedziczenie wielogenowe - odnosi się do tych procesów, w których choroba lub wada jest rezultatem sumującego się efektu działania jednego lub wielu genów i czynników środowiskowych. Zalicza się do dziedziczenia małego (do 5%)

Kryteria dziedziczenia wieloczynnikowego:

• istnieje podobna wielkość ryzyka powtórnego wystąpienia choroby (zwykle 2-10%) u krewnych I stopnia

• I dziecko z rozszczepem podniebienia - ryzyko powtórzenia dla kolejnego dziecka 4%

• Rozszczep podniebienia u jednego z rodziców - ryzyko dla dziecka 4%

• niektóre choroby wykazują szczególną zależność od płci

• Wrodzone zwężenie odźwiernika - częściej u chłopców

• Wrodzone zwichnięcie stawów biodrowych - częściej u dziewczynek

• Ryzyko powtórzenia się choroby w rodzinie spada gwałtownie w miare oddalania się pokrewieństwa względem osoby chorej

• Ryzyko powtórzenia się rozszczepu wargi dla kuzynostwa - 0,5%

• ryzyko wystąpienia wady u dziecka urodzonego z kolejnej ciąży zależy od tego, czy wada wystąpiła u dzieci z ciąż poprzednich

• Ryzyko ponownego urodzenia dziecka z rozszczepem wargi i podniebienia wynosi 4%, jeśli rodzice już mają dziecko z ta wadą

• 9% - po urodzeniu dwojga dzieci z tą wadą

• ryzyko wystąpienia wady u kolejnego potomstwa zależy od ciężkości wady

• Gdy dziecko ma wrodzony brak unerwienia błony śluzowej długiego odcinka jelita grubego, istnieje większe ryzyko, że wada ta wystąpi u kolejnego rodzeństwa, niż wtedy, gdy wada dotyczy niewielkiego odcinka jelita

• dziedziczenie wieloczynnikowe jest rozpoznawane po wykluczeniu innych typów dziedziczenia

Czynniki teratogenne:

• endogenne - produkowane w toku procesów metabolicznych np. wolne rodniki tlenowe, tlenki azotu

• egzogenne - biologiczne (wirusy), chemiczne (benzen) i fizyczne (promieniowanie jonizujące)

Czynniki mutagenne indukują zmiany w genomie, które można obserwować na wszystkich poziomach jego organizacji: chromosomów, genów i nukleotydów. Teoretyczna częstość samoistnych mutacji wynosi dla jednej generacji komórek ok. 10^-7 mutacji na gen. Istnieją mutageny, które zwiększają częstość mutacji ponad 1000 krotnie.

Większość uszkodzeń DNA zostaje usunięta za pomocą systemów reperacyjnych komórek. Jeśli uszkodzenia DNA nie zostaną usunięte, zmiana genetyczna może zostać utrwalona w postaci mutacji.

Konsekwencje biologicznych mutacji dotyczą pojedynczej komórki lub całego organizmu.

Komórki z uszkodzonym DNA mogą wejść w cykl podziałowy, co prowadzi do powstania linii komórek zawierających mutację.

Mutacje może spowodować zanik cyklu komórkowego, „kom drzemiąca” która ponownie może wejść do cyklu po zadziałaniu promotorów np. pobudzających proliferację komórek

Zmiana informacji może doprowadzić do zaburzenia podstawowych funkcji życiowych komórki, tak że będzie przyczyną jej śmierci.

W odniesieni do całego organizmu biologiczne działanie czynników mutagennych może wyrażać się:

• mutageneza- mutacja komórek rozrodczych

• kancerogeneza- transformacje nowotworowe, somatyczne

• teratogeneza- indukcja wad wrodzonych, uszkodzenie zarodka

Skutki biologiczne zależą od typu komórek, które zostały uszkodzone (komórki płciowe lub somatyczne):

• uszkodzenie komórek płciowych:

• obniżenie płodności lub mutacje będą zawierały wszystkie komórki płodu (jeżeli komórka z mutacją weźmie udział w procesie zapłodnienia)

• poronienia

• urodzenie dziecka z abberacjami chromosomowymi zespołem uwarunkowanym mutacją pojedynczego genu lub z chorobą nowotworową

• uszkodzenie somatyczne:

• zmiana będzie się powtarzała jedynie w linii komórek wywodzących się z nieprawidłowej komórki

• okres prenatalny: przed organogenezą (pierwsze 2 tygodnie), w trakcie organogenezy (pierwsze 2 miesiące) i po organogenezie (teratogeneza)

• okres postnatalny (wpływ rakotwórczy): indukcja transformacji nowotworowej

Mutacja komórek somatycznych - etapy karcenogenezy:

• indukcja (pierwsza zmiana zwykle genetyczna, zapoczątkowująca proces transformacji)

• promocja (etap proliferacji pierwotnie uszkodzonej komórki)

• progresja (nabycie przez linie komórek cech nowotworu złośliwego)

Proces transformacji nowotworowej wynika z kumulacji zmian:

• genetycznych np. mutacje punktowe, delecje, amplifikacje, mutacje liczby i struktury chromosomów w trzech grupach genów: protoonkogenów, genów supresorowych i mutatorowych

• epigenetycznych np. regulacja ekspresji genów kontrolujących cykl komórkowy, różnicowanie komórek i ich adhezyjność

Zależność między wzrostem narażenia a ryzykiem indukcji procesów nowotworowych jest: BEZPROGOWA i LINOWA.Wzrost narażenia nie jest równe ciężkości przebiegu. Ryzyko transformacji nowotworowej występuje przy każdym narażeniu na działanie czynników teratogennych. Efekt teratogenny jest skutkiem zaburzeń dotyczących wielu komórek, wynikających z uszkodzenia DNA lub innych molekół.

Teratogen - każdy czynnik uszkadzający materiał genetyczny, lub mechanizmy powiązane z replikacją, transkrypcją i translacją w wyniku czego zachodzi do zaburzenia funkcji i podziałów komórki. Zaburzenia w trakcie życia płodowego powodują zaburzenia procesów tworzenia się i rozwoju narządów płodu.

Efekt teratogenny to skutek uszkodzenia wielu kom w wyniku czego następuja:

• zmiany ekspresji genów

• zaburzenia apoptozy

• zaburzenia migracji

• zaburzenia poliferacji

• zaburzenia syntezy i funkcji białek

• zaburzenia produkcji energii

Wady wrodzone indukowane działaniem czynników teratogennych mogą być zmianami:

• anatomicznymi (dysplazje, malformacje, deformacje, dystrupcje)

• funkcjonalnymi (ślepota, głuchota, upośledzenie rozwoju umysłowego)

Talidomid - powodował fokomelia (brak rozwoju kończyn górnych i lub dolnych), blokuje IGF-1 i FGF-2, które są odpowiedzialne za regulacje transkrypcji, podjednostki av i β3 integryn stymulujących angiogeneze w kończynach. Sekwencje promotorowe genów IGF-1 i FGF-1 oraz av i β3 nie posiadają sekwencji TATA, ale sekwencje powtarzalne GG.

Kwas retinoidowy - reguluje rozwój szkieletu poprzez: jądrowe receptory hormonów RARs oraz RXRs, zaburzenia w syntezie RARs zaburzają proces tworzenia chrząstek, co w konsekwencji powoduje zaburzenie różnicowania się chondroblastów.

Nikotyna - powoduje wzrost ekspresji genu c-fos, który indukuje apoptozę w prawidłowych komórkach, prowadzi to do zaburzenia procesów różnicowania komórek neuronalnych.

Teratogeny swoiste: toksoplazma, różyczka, ospa wietrzna, alkohol etylowy, talidomid

Efekt teratogenny dawki - zależy od dawki progowej, nie ma dawki bezpiecznej, po przekroczeniu jej następuje wzrost wystąpienia i ciężkości uszkodzeń płodu

Genopatie - czynniki mutagenne działające na komórki rozrodcze przed zapłodnieniem prowadzące do mutacji

Blastopatie - uszkodzenie zapłodnionej komórki jajowej do 14 dnia po zapłodnieniu, zasada „wszystko albo nic”

Embriopatie - wada w okresie 14-60 dzień po zapłodnieniu

Fetopatie - wady indukowane działaniem czynników po 60 dniu od zapłodnienia (śmierć, zaburzenie funkcjonowania, upośledzenie wzrostu, dysfunkcja OUN)

Efekt teratogenny: poronienie, opóźniony rozwój płodu, przedwczesne porody, wzrost śmiertelności noworodków

Etiologia wad wrodzonych:

• >50% przypadków - etiologia nieznana

• 10% to abberacje chromosomalne

• 10% to znane czynniki mutagenne

• 20% to mutacje pojedynczego genu

Indywidualne zróżnicowanie wrażliwości/podatność na działanie teratogenów zalezy od getoypu matki i od genotypu dziecka

Podatność zależy od: transportu łożyskowego, absorbcji i dystrybucji, metaboliźmie teratogenów chemicznych, sprawności mechanizmów naprawy DNA

Wady budowy ciała:

• malformacje - wady rozwojowe narządu lub części ciała powstające w wyniku zaburzenia ich rozwoju w pierwszym trymestrze ciąży, co prowadzi do niepewnej lub nieprawidłowej morfogenezy. Są to zmiany wywołane przez pierwotne zaburzenie rozwoju w okresie zarodkowym, charakteryzują się trwałymi wadami budowy, im później powstaje defekt, tym prostsza jest malformacja, mogą być wywoływane przez 3 typy zaburzeń morfogenezy (niecałkowita (najczęściej), nadmierna, ektopiczna), malformacje (ograniczone, zespół malformacyjny ze zmianami w wielu układach)

• deformacje - nieprawidłowości budowy, kształtu lub ułożenia jakiejś części ciała spowodowanych jej uciskiem wewnątrz macicy. Wady powstające zwykle w III trymestrze ciąży pod wpływem czynników mechanicznych

• przyczyny: wady rozwojowe macicy, np. macica dwurożna, mała macica, mała miednica, guzy macicy (mięśniaki, włókniaki), małowodzie, nieprawidłowe ułożenie płodu, choroby ograniczające możliwości poruszania się płodu - zaburzenia neurologiczne, pierwotne choroby mięśni, wady stawów, zdeformowaniu ulegają najczęściej kości, stawy i chrząstki, po urodzeniu - widoczne w postaci (skręcenia lub skrzywienia kości, ograniczenia ruchomości stawów, spłaszczenia nosa i uszu), większość deformacji podlega samoistnemu odkształceniu w ciągu kilku miesięcy lub lat, sekwencja deformacyjna - gdy ucisk mechaniczny wywołuje wiele deformacji, np. sekwencja Potter

• sekwencja Potter: agenezja nerek, małowodzie, ucisk wewnątrzmaciczny (deformacje wygięciowe kończyn, przykurcze stawowe, „twarz Potter”)

• Zespół Crouzona: najczęstsza kraniosynostoza, charakteryzuje się przedwczesnym zarośnięciem szwów wieńcowych i hipoplazja środkowej części twarzy z uwypukleniem czoła, początek w 1 rż, zarośnięcie szwów - 3rż, spłycenie oczodołów, uwypuklenie gałek ocznych, przewlekłe zapalenia spojówek i rogówek, niedosłuch przewodzeniowy, nie stwierdza się wad kończyn, AD, mutacje FGFR2

• Zespół Aperta (acrocephalosyndaktylia): zaburzenie zarastania wszystkich szwów czaszkowych, poza szwem węgłowym, wysoka czaszka ze zmniejszonym wymiarem przednio-tylnym, płaska środkowa część twarzy, wyraźnie zaznaczone bruzdy nadoczodołowe,płytkie oczodoły, skośno-dolne ustawienie szpar powiekowych, syndaktylia „rękawicowa” (2,3 i 4 palca), bloki kostne kręgów szyjnych, opóźnienie rozwoju psychoruchowego - u większości, AD, mutacje FGFR2

• Zespół Pfeiffera: charakterystyczna - kranosynostoza szwu wieńcowego , niekiedy - strzałkowego, brachycefalia, wysokie czoło, hiperteloryzm, mały nos z pogłębioną nasadą, szerokie kciuki i paluchy, częściowa syndaktylia 2 i 3 palców dłoni oraz 2,3 i 4 palców stóp

• dystrupcje (przerwania) - wady wynikające z zaburzenia prawidłowego dotychczas rozwoju danego układu lub narządu. są wadami morfologicznymi wynikającymi z przerwania lub zakłócenia pierwotnie prawidłowego procesu rozwojowego, w przeciwieństwie do deformacji - nie sa wyłącznie skutkiem działania sił mechanicznych, ale mogą być wywołane przez niedokrwienie, wylew krwi lub zrosty tkankowe, mogą być skutkiem działania czynnika teratogennego lub pojawiać się z nieznanej przyczyny, występują sporadycznie ( w przeciwieństwie do deformacji, malformacji i dysplazji), sekwencja przerwania - jeśli czynnik wywołujący przerwanie powoduje wiele defektów

• zespół pasm owodniowych: przerwanie dotyczy różnych tkanek, lokalizacja uszkodzenia nie odpowiada określonym granicom anatomicznym embriogenezy

• dysplazje - są to stany, w których nieprawidłowa organizacja lub czynność komórek określonej tkanki ustroju prowadzą do zmian budowy ujawniających się klinicznie, większość dysplazji - choroby monogenowe (dysplazje kostne, dysplazje ektodermalne, wrodzone defekty kolagenu, choroby spichrzeniowe), wyjątkiem dysplazji niegenetycznego pochodzenia - odpryskowce (hamartoma), t.j. naczyniaki i znamiona, zmiany dysplastyczne mogą nasilać się przez całe życie

• dysplazja tanatoforyczna: znacznego stopnia skrócenie kończyn, wąska, „gruszkowata” klatka piersiowa, hipotonia mięśniowa, brak odruchów ścięgnistych, wypukłe czoło, płaska nasada nosa, wytrzeszcz gałek ocznych, deformacja czaszki w kształcie liścia koniczyny (Kleeblattschadel)

• achondroplazja: skrócenie odcinków bliższych kończyn, duża głowa z wydatnymi guzami czołowymi, niedorozwojem szczęk i prognacją żuchwy, niski wzrost, krótkie i szerokie dłonie, opóźnienie rozwoju motorycznego

• zespół Marfana: arachnodaktylia, szczupła sylwetka, klatka piersiowa szewska lub kurza, skolioza, lordoza piersiowa, gotyckie podniebienie, zwichnięcie soczewek, krótkowzroczność, ew. niebieskie twardówki, wypadanie płatka zastawki dwudzielnej/niedomykalność, poszerzenie części wstępującej aorty/rozwarstwienie aorty

Typy wad wrodzonych:

• wady duże: wady, które upośledzają czynność ustroju lub skracają życie, np. zespół Downa, rozszczep wargi, zaćma, przerostowe zwężenie odźwiernika, 2-3% noworodków

• wady małe (anomalie): z reguły mają znaczenie kosmetyczne, są pomocne w rozpoznawaniu zespołów, mogą być wskazówką, że istnieją inne, większe zaburzenia morfogenez, większość małych wad to malformacje, występują najczęściej na obszarach o złożonej budowie, t.j twarz, dłonie

• przykłady małych anomalii: wyrośla na kości potylicznej, dołki, wyrośla przeduszne, hiperteloryzm, różnobarwność tęczówek, ubytek tęczówek, zmarszczka nakątna, rozdwojony języczek, klinodaktylia V palca, syndaktylia, pojedyncza bruzda zgięciowa dłoni, dodatkowe wiry włosów, biały kosmyk, plamy „cafe au lait”, spodziectwo

Skojarzenia wad wrodzonych:

• są to nielosowe połączenia wad, których poszczególne składowe występują razem częściej, niż mogłyby występować przypadkowo

• np. skojarzenie VACTERL (Vartebral anomalies, Anal atresis, Cardiac abnormalities, Tracheo-Esophageal fistula, Renal abnormalities, Limb abnormalities)

Sekwencje wad:

• oznaczają, że jeden podstawowy defekt wywołuje kaskadę zmian strukturalnych, które wydają się nie być ze sobą powiązane

• pierwotny defekt jest najczęściej malformacją

• przykłady: sekwencja Pierre-Robin, sekwencja otwartej wady cewy nerwowej, sekwencja skąpowodzia (Potter)

---