Zakład Zaburzeń Krzepnięcia Krwi Katedry Diagnostyki Laboratoryjnej.

Konspekt do zajęć prowadzonych w ramach przedmiotu Fizjologia kliniczna dla studentów II roku Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Medycznego w Łodzi.

Rok akademicki 2006/2007.

Ćwiczenie 1

Mechanizmy prowadzące do powstania czopu hemostatycznego
oraz testowanie ich sprawności za pomocą badań diagnostycznych

Wprowadzenie

Hemostaza to zespół mechanizmów fizjologicznych, które zapewniają sprawne hamowanie krwawienia po przerwaniu ciągłości ściany naczyń krwionośnych, szczelności łożyska naczyniowego i płynności krążącej krwi.

Głównymi elementami hemostazy są: układ krzepnięcia, układ fibrynolizy, płytki krwi (inne elementy morfotyczne), ściana naczyń krwionośnych, układ fagocytarny (siateczkowo-śródbłonkowy).

W celu zrozumienia funkcjonowania hemostazy można wprowadzić „roboczy” podział na układ prokoagulacyjny i antykoagulacyjny. Układ prokoagulacyjny obejmuje wszystkie mechanizmy biorące udział w tworzeniu czopu hemostatycznego - jego funkcją jest hamowanie krwawienia.

Układ antykoagulacyjny obejmuje wszystkie mechanizmy ograniczające tworzenie zakrzepów - jego funkcją jest więc zachowanie płynności krwi.

Zakrzep to czop hemostatyczny, który rozwinął się w sposób niedostatecznie kontrolowany lub w niewłaściwym miejscu.

Zator to zakrzep całkowicie blokujący przepływ krwi przez naczynie krwionośne.

Hemostaza pierwotna - inicjacyjna faza aktywacji układu hemostazy: płytki krwi rozpoznają uszkodzenie naczynia i tworzą czop płytkowy uwalniając substancje wspomagające układ krzepnięcia (`płytki krwi jako pierwsze na miejscu wypadku')

Hemostaza wtórna - uszkodzona ściana naczynia jest źródłem czynnika tkankowego (TF, Tissue Factor), który uaktywnia układ krzepnięcia. Następuje wzmocnienie czopu płytkowego i tworzenie czopu hemostatycznego.

Przerwanie ciągłości naczynia krwionośnego zapoczątkowuje sekwencję zdarzeń - uruchamiane są kolejne elementy (mechanizmy) układu hemostazy.

Poszczególne warstwy ściany naczyń krwionośnych odgrywają istotna rolę w regulacji układu hemostazy:

• śródbłonek - mechaniczna izolacja od warstwy prokoagulacyjnej, uwalnianie do krwioobiegu czynników regulujących funkcje łożyska naczyniowego i układu hemostazy (t-PA, u-PA, prostacyklina, EDGF, EDRF, PAI, cz. vW, PAF), pełni rolę organu endokrynnego ( masa około 2 - 3 kg),

• warstwa podśródbłonkowa - aktywacja płytek krwi z udziałem białek włókienkowych (kolagenu) oraz ekspresja TF i aktywacja układu krzepnięcia,

• mięśniówka - skurcz naczyń.

Aktualnie brak jest powszechnie dostępnego badania testującego sprawność hemostatyczną ściany naczyń krwionośnych. Badaniem o praktycznie historycznym znaczeniu jest test opaskowy Rumpela-Leedego, stosowany jest również czas krwawienia, a z badań specjalistycznych biopsja skóry.

Diagnostyka sprawności śródbłonka obejmuje przede wszystkim czynnościowe i obrazowe badania hemodynamiczne, wykraczające poza zakres tradycyjnej diagnostyki laboratoryjnej.

Do najważniejszych należą:

1. FMD (Flow Mediated Dilatation) - badanie zdolności rozkurczowej naczyń krwionośnych po zwolnieniu kontrolowanego ucisku,

2. Pletyzmografia - rejestracja zmian tętna (ciśnienia) w naczyniach; PAT (Peripheral Artery Tonometry) to uproszczona wersja tej metody wykorzystywana do badań śródbłonka,

3. pomiary IMT (Intima Media Thickness) - pomiary grubości kompleksu błona wewnętrzna-błona środkowa, wykonywane dla tętnicy szyjnej.

Opisano liczne, biochemiczne markery uszkodzenia sródbłonka. W osoczu oznaczane są stężenia białek adhezywnych uwalnianych z powierzchni uszkodzonego śródbłonka (ICAM-1, VICAM-1, endoteliny, selektyny). W czasie uszkodzenia śródbłonka wzrasta we krwi stężenie czynnika von Willebranda i kwasu moczowego. Badania opisanych markerów są kosztowne i mało swoiste, stąd nie znalazły szerszego zastosowania w diagnostyce laboratoryjnej.

Płytki krwi najmniejsze upostaciowione, pozbawione jądra, elementy krwi, 130000 do 350000 w mm³ jako pierwsze wykrywają uszkodzenie naczynia.

Aktywacja płytek krwi obejmuje szereg następujących po sobie procesów (zmiana kształtu, adhezja, degranulacja, agregacja) wywołanych przez kontakt z powierzchnią uszkodzonego naczynia lub działaniem agonistów (ADP, trombina).

Rola płytek krwi w tworzeniu czopu hemostatycznego:

1. adhezja i agregacja - tworzenie pierwotnego czopu hemostatycznego,

2. przyśpieszanie tworzenia ostatecznego czopu hemostatycznego (wpływ na funkcję wszystkich elementów układu hemostazy).

Czop płytkowy jest zbyt słaby aby zahamować wypływ krwi z uszkodzonych naczyń. Dzięki procesom biochemicznym „kaskady krzepnięcia” następuje wzmocnienie czopu płytkowego i tworzenie stabilnego czopu hemostatycznego.

Oznaczenie czasu krwawienia jest najprostszą metodą badania sprawności hemostatycznej płytek krwi. Metoda ta jest mało czuła i specyficzna, szczególnie w wersji znanej jako metoda Duke'a. W naszym przypadku stanowi wstęp do omawiania fizjologii układu hemostazy.

Wersja klinicznie użyteczna to metoda Ivy'ego. W obecnej chwili czas krwawienia wypierany jest przez instrumentalne metody badania płytek krwi (np. PFA-100).

W przypadku wydłużonego czasu krwawienia konieczne jest zbadanie funkcji płytek krwi.

Metody pomiaru agregacji płytek krwi:

1. agregacja turbidymetryczna

2. agregacja we krwi pełnej: metoda impedancyjna, określanie ubytku płytek po aktywacji

3. pomiar czasu okluzji - PFA-100 (adhezja/agregacja płytek)

Hemostaza wtórna

Końcowym efektem działania układu hemostazy jest przekształcenie przez trombinę rozpuszczalnego fibrynogenu w nierozpuszczalną fibrynę.

Czynniki krzepnięcia występujące w osoczu w postaci nieaktywnej po aktywacji układu krzepnięcia tworzą trzy zespoły enzymatyczne. Każdy kompleks składa się z kofaktora zakotwiczonego w dwuwarstwie fosfolipidów błony komórkowej oraz z migrujących, zależnych do witaminy K, proteaz serynowych. Nieczynne zymogeny, przyłączając się do kompleksów enzymatycznych, przekształcane są w formy aktywne przemieszczające się między kompleksami. Występuje nieustanny dopływ nieaktywnych form enzymów z osocza, ich aktywacja w obrębie kompleksów, oraz przemieszczanie aktywnych form między kompleksami.

Kompleksy wytwarzają aktywne formy enzymów przenoszących między kompleksami sygnał aktywacji (IXa, Xa, IIa).

W toku ewolucji wykształcone zostały liczne sprzężenia zwrotne oraz alternatywne ścieżki generacji trombiny. Prosty i klarowny schemat kaskadowy niestety ma już jedynie wartość historyczną.

Kompleksy te to:

Kompleks związany z czynnikiem tkankowym (rdzeń-TF, VII, VIIa, przejściowo nieaktywne czynniki IX, X, aktywne Xa, IXa)

Kompleks tenazy (rdzeń VIII, przejściowo nieaktywne X, aktywne IXa, Xa)

Kompleks protrombinazy (rdzeń V przejściowo II, IIa, Xa)

Wykonanie oznaczenia czasu protrombinowego (PT) symuluje aktywację układu krzepnięcia przez tromboplastynę tkankową powstającą po uszkodzeniu naczynia i częściowej degradacji tkanki. Układ jest oczywiście sztuczny, lecz ze wszystkich badań najbardziej zbliżony do rzeczywistości.

Po uszkodzeniu naczynia krwionośnego eksponowany wówczas TF rozpoznawany jest przez krążącą formę aktywnego cz. VII, która jest w stanie rozpoznać TF, lecz posiada nieaktywne centrum serynowe i dopiero po połączeniu z TF nabywa zdolności aktywowania kolejnych cząsteczek czynnika VII, a po przekroczeniu „progu masy krytycznej” efektywnie aktywuje czynnik IX i czynnik X.

Czynnik X w obecności czynnika V łączy się w kompleks protrombinazy i ostatecznie protrombina przekształcana jest w trombinę.

Ten fragment jest języczkiem spustowym aktywacji układu krzepnięcia i zostaje szybko wyhamowany przez inhibitor tkankowego aktywatora (TFPI, Tissue Factor Pathway Inhibitor).

Jednakże minimalna ilość wygenerowanej trombiny (jak iskra na beczce prochu) wystarcza do uruchomienia układu wzmożonej generacji trombiny (dawniej zwanym „wewnątrzpochodnym” szlakiem aktywacji). Powstaje kompleks tenazy (X-azy). Powstanie kompleksu, a następnie uruchomienie głównego szlaku generacji trombiny odbywa się za pośrednictwem głównie czynnika VIII, istotną rolę odgrywa także czynnik IX. Co do roli czynnika XI zdania są podzielone (sądzi się, że jest aktywowany przez trombinę powstałą w kompleksie z TF i aktywuje czynnik IX). Uaktywnione przez trombinę powstałą w kompleksie TF wymienione czynniki (czynnik IX prawdopodobnie uruchamiany jest także przez kompleks czynnika tkankowego) mają wielokrotnie większą wydajność (50 razy) generowania trombiny niż „wygaszony” szlak TF. Dopiero ta droga generacji aktywnej formy czynnika X pozwala wytworzyć wystarczającą ilość ognisk aktywacji (kompleksów protrombinazy) do wytworzenia takiej ilości trombiny, która przekształca fibrynogen we włóknik. Włączają się także systemy samoograniczające. Prawdopodobnie uruchamiane są one w momencie lokalnego przekroczenia pewnego progu stężenia trombiny. Uruchamiany zostaje system antykoagulacyny. Układ białka C, układ antytrombiny, równolegle do aktywacji krzepnięcia uruchomiony już został układ fibrynolityczny.

W świetle aktualnej wiedzy aktywacja tzw. „szlaku wewnątrzpochodnego” nie ma znaczenia fizjologicznego, jednakże w warunkach laboratoryjnych możliwe jest zastosowanie tak wysokich stężeń aktywatorów powierzchniowych, które uruchamiają zespół czynników kontaktu.

W powszechnie wykonywanym badaniu - APTT (czas częściowej tromboplastyny po aktywacji) wykorzystywane są aktywatory powierzchniowo czynne (kaolin, celit) i fosfolipidy (rekompensata braku płytek krwi).

Badania podstawowe:

diagnostyka skaz krwotocznych: płytki, czas krwawienia, PT, TT, APTT, fibrynogen

diagnostyka stanów nadkrzepliwości: APCR, białko C, białko S, AT, D-dimery.

Badania molekularne:

ELISA: t-PA, PAI, F1+2, PAP, TAT, β-TG; chromatografia - homocysteina; cytometria przepływowa - diagnostyka białaczek, ocena funkcji płytek krwi

Badania genetyczne:

PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy): wykrywanie mutacji Leiden cz. V, mutacji 20210 genu protrombiny

W jakim celu wykonujemy badania?

Diagnostyka skaz krwotocznych

Skazy krwotoczne - stany, w których występuje niewydolność jednej lub kilku składowych ustrojowego układu hemostazy. Ogólnie mówiąc skaza krwotoczna to skłonność do krwawień: długotrwałych, zbyt obfitych, pojawiających się bez istotnej przyczyny. Skazy krwotoczne mogą być uwarunkowane genetycznie lub mają charakter nabyty.

Uwzględniając trzy podstawowe elementy hemostazy wyodrębnia się skazy naczyniowe, skazy płytkowe i zaburzenia krzepnięcia krwi. Jest to jednak podział uproszczony, ponieważ w wielu nabytych skazach krwotocznych występują złożone zaburzenia dotyczące zarówno osoczowych czynników krzepnięcia jak i drobnych naczyń krwionośnych czy płytek krwi.

Naczyniowe skazy krwotoczne związane są z zaburzeniami budowy i czynności drobnych naczyń krwionośnych - tętniczek, naczyń włosowatych i małych naczyń żylnych. U podłoża tego typu zaburzeń są wrodzone wady naczyń lub nabyte uszkodzenie ściany naczyniowej na tle immunologicznym, w wyniku działania toksyn, leków, w przebiegu zakażeń, zmian zakrzepowych a także zmiany naczyń związane z procesem starzenia, działania urazów mechanicznych czy nieznanych dotąd czynników. Skaza objawia się najczęściej wybroczynami lub krwotocznymi wykwitami na skórze i błonie śluzowej, krwawieniami z dziąseł i łatwym siniaczeniem. Rzadziej występują krwawienia z nosa, dróg rodnych, dróg moczowych czy przewodu pokarmowego. W badaniach laboratoryjnych nie stwierdza się odchyleń w zakresie badań płytek krwi, osoczowych czynników krzepnięcia i fibrynolizy. Zwraca uwagę natomiast dodatni objaw opaskowy.

Najczęściej występujące skazy naczyniowe (plamice):

wrodzone:

choroba Rendu-Oslera (wrodzona naczyniakowatość krwotoczna)

zespół Marfana

nabyte:

zespół Schonleina-Henocha

plamice polekowe

plamice w przebiegu zakażeń

plamica w dysproteinemiach

plamica starcza

plamice związane ze wzrostem ciśnienia żylnego

Plamice naczyniowe o nieznanej etiologii

plamica zwykła

plamica psychogenna

Płytkowe skazy krwotoczne są związane z nieprawidłową liczbą płytek (małopłytkowości, nadpłytkowości) lub/i z zaburzeniami czynności płytek krwi (trombocytopatie).

Do najczęściej występujących płytkowych skaz krwotocznych należą małopłytkowości. Mechanizm ich powstawania polega na niedostatecznym wytwarzaniu (małopłytkowości „centralne”) lub nadmiernie szybkim usuwaniu płytek z krążenia (małopłytkowości „obwodowe”), nieprawidłowym rozdziale płytek w organizmie lub ich rozcieńczeniu. Objawy skazy pojawiają się zwykle wtedy, gdy liczba płytek jest mniejsza niż 30 000/ µl. W wielu przypadkach nie obserwuje się jednak korelacji między liczbą płytek, długością czasu krwawienia a nasileniem skazy. W diagnostyce małopłytkowości „centralnych” duże znaczenie ma badanie aspiracyjne szpiku, które umożliwia ocenę ilości i morfologii magakariocytów. Z zastosowaniem cytometrii przepływowej można określić frakcję młodych płytek (płytek retykulocytarnych). Inne badanie diagnostyczne to oznaczenie stężenia trombopoetyny we krwi. Charakterystyczną cechą skazy małopłytkowej są krwawienia skórno-śluzówkowe - pojawienie się wybroczyn na skórze kończyn, tułowia, rzadziej twarzy, oraz błonie śluzowej jamy ustnej. Często występują krwawienia z nosa, dziąseł i dróg rodnych u kobiet. Do ciężkich powikłań należą krwawienia z przewodu pokarmowego lub krwawienia śródczaszkowe. Małopłytkowości mogą mieć charakter wrodzony (dziedziczna małopłytkowość, niedobór trombopoetyny) lub nabyty (małopłytkowość o podłożu immunologicznym, małopłytkowości polekowe, zakrzepowa plamica małopłytkowa). W diagnostyce ważny problem stanowi wykluczenie tzw. małopłytkowości rzekomej (pseudotrombocytopenia), która jest artefaktem pomiarowym, wynikającym z aglutynacji płytek we krwi pobranej na EDTA.

W nadpłytkowościach liczba płytek krwi przekracza 500 000/µl i wiąże się ze zwiększeniem wytwarzania płytek przy prawidłowym czasie ich przeżycia. W zależności od przyczyn nadpłytkowości dzielimy na pierwotne i wtórne. W nadpłytkowościach pierwotnych zwiększenie liczby płytek jest wynikiem autonomicznego procesu rozrostowego (samoistna nadpłytkowość, zespoły mieloproliferacyjne), we wtórnych - objawem innych chorób (ostre i przewlekłe zapalenia, choroba nowotworowa). Nadpłytkowości pierwotne objawiają się nawracającymi krwawieniami z przewodu pokarmowego, dróg moczowych lub zmianami zakrzepowymi w obrębie naczyń śledzionowych, krezkowych czy mózgowych. Nadpłytkowości wtórne najczęściej przebiegają bezobjawowo a zmniejszenie liczby płytek następuje po wyleczeniu choroby podstawowej.

Przedłużenie czasu krwawienia przy prawidłowej ilości płytek krwi może być związane z wrodzonym lub nabytym zaburzeniem czynności płytek. Wrodzone zaburzenia czynności płytek krwi obejmują:

• anomalie błony płytkowej: zespół Bernarda-Souliera (przedłużony czas krwawienia, nieznaczna małopłytkowość, olbrzymie i morfologicznie nieprawidłowe płytki), trombastenia Glanzmanna (przedłużony czas krwawienia, brak agregacji płytek pod wpływem ADP, kolagenu), defekt receptora kolagenu, zaburzenie prokoagulacyjnej aktywności płytek (zespół Scotta),

• zaburzenia sekrecji ziarnistości płytkowych: choroba puli magazynowej, zaburzenia mechanizmu sekrecji.

Nabyte zaburzenia czynności płytek są często występującym ubocznym skutkiem działania wielu leków (kwas acetylosalicylowy, antybiotyki laktamowe) i niektórych produktów spożywczych (wysokonienasycone kwasy tłuszczowe, alkohol etylowy, cebula, czosnek), mogą pojawić się również w schorzeniach niehematologicznych (mocznica, choroby wątroby).

Osoczowe skazy krwotoczne związane są z wrodzonymi lub nabytymi niedoborami, zaburzeniami funkcji czynników krzepnięcia krwi.

Wrodzone:

• Choroba von Willebranda

• Hemofilia A

• Hemofilia B

Nabyte

• W przebiegu chorób wątroby

• Zespół rozsianego krzepnięcia wewnątrznaczyniowego (DIC)

• Masywne transfuzje

Hemofilia (inaczej zwana "krwawiączką" czy też "chorobą królów") - grupa chorób spowodowanych genetycznie uwarunkowanym niedoborem czynników krzepnięcia.

Cecha ta dziedziczy się z chromosomem X, co oznacza, iż chorują jedynie osoby z pełną ekspresją recesywnego genu.

Hemofilia (niezależnie od typu) występuje w Polsce z częstością 1 : 12300 mieszkańców (1 : 5600 mężczyzn).

• Hemofilia A - niedobór VIII czynnika krzepnięcia krwi (czynnika antyhemolitycznego), "klasyczna hemofilia"

• Hemofilia B - niedobór IX czynnika krzepnięcia krwi (czynnika Christmasa), "choroba Christmasa"

Stosunek częstości występowania hemofilii A do B wynosi w Polsce 6,2 : 1

Zależnie od niedoboru czynnika wyróżniamy trzy postacie hemofilii.

• postać ciężka - poziom czynnika poniżej 1% normy. Charakteryzuje się częstymi wylewami pourazowymi i występowaniem tzw. krwotoków samoistnych (bez wyraźnej przyczyny urazowej)

• postać umiarkowana - poziom czynnika poniżej 1-5% normy,

• postać lekka - poziom czynnika powyżej 5% normy.

Choroba von Willebranda najczęściej występująca skaza krwotoczna (1 osoba na 8000 mieszkańców).

Rozpoznanie i właściwa klasyfikacja tej choroby, ze względu na małą dostępność wiarygodnych badań przesiewowych (pomiar czasu okluzji w analizatorze PFA-100) sprawia wiele trudności.

Wyróżniane są trzy typy z kolejnymi podtypami chvW.

TYP 1 (80% chorych) obniżenie poziomu ale czynnik jest prawidłowy

TYP 2 (20% chorych) budowa i funkcja czynnika jest nieprawidłowa, poziom może być prawidłowy lub obniżony

TYP 3 (rzadki) o ciężkim przebiegu klinicznym z bardzo niskim poziomem czynnika von Willebranda i czynnika VIII.

Godna odnotowania jest częstość występowania niedoboru czynników VII i XII (około 1:400000 mieszkańców),. pozostałe niedobory występują bardzo rzadko.

Zespół rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego - zespół DIC (disseminated intravascular coagulation), zespół chorobowy polegający na niekontrolowanej aktywacji (w przebiegu różnych chorób) kaskady krzepnięcia i wytworzenie licznych „rozsianych” mikrozakrzepów w świetle małych naczyń krwionośnych. Dochodzi do zużycia czynników krzepnięcia oraz płytek krwi, powodując z jednej strony niewydolność narządów a z drugiej objawy skazy krwotocznej ("koagulopatia ze zużycia").

DIC występuje jako powikłanie w wielu sytuacjach klinicznych

• uogólnione zakażenie (sepsa), najczęściej bakteriami gram-ujemnymi,

• powikłania ginekologiczne - zator wodami płodowymi, przedwczesne odklejenie łożyska,

• uszkodzenia tkanek, takie jak przy oparzeniach, po zabiegu chirurgicznym, po wypadku,

• hemolityczna reakcja poprzetoczeniowa,

• gorączki krwotoczne wywołane przez różne wirusy (Ebola),

• ostra białaczka promielocytowa,

• ukąszenie przez niektóre jadowite węże,

• choroby trzustki (rak, nawracające zapalenia).

Rozpoznanie skazy krwotocznej opiera się na wywiadzie, badaniu przedmiotowym i badaniach laboratoryjnych i sprowadza się do ustalenia czy skaza ma charakter wrodzony lub nabyty, czy towarzyszy innej chorobie lub jest wynikiem stosowanych leków, jaki jest charakter i nasilenie skazy.

Dla podsumowania, do najczęściej stosowanych testów przesiewowych w diagnozie skaz krwotocznych stosuje się badanie liczby płytek krwi, czasu krwawienia oraz oznaczenie czasów krzepnięcia: czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (APTT), czas protrombinowy (INR), czas trombinowy.

W przypadku badań przesiewowych w kierunku występowania choroby von Willebranda należy zwrócić szczególna uwagę na stosowanie odpowiednio czułych odczynników do wykonania APTT. Pomiary czasu okluzji w analizatorze PFA-100, mimo ich potwierdzonej wartości w wykrywaniu chvW, w Polsce, ze względu na wysokie koszty są wykonywane bardzo rzadko.

Badania specjalistyczne obejmują natomiast oznaczenie funkcji płytek krwi, poziomu czynników krzepnięcia oraz inhibitorów krzepnięcia.

Pod względem przebiegu i obrazu klinicznego skazy naczyniowe i płytkowe różnią się od skaz uwarunkowanych zaburzeniem krzepnięcia krwi (tabela).

Objawy kliniczne skaz krwotocznych

	Skazy osoczowe	Skazy płytkowe i naczyniowe
Najczęstsze objawy	wylewy krwi do mięśni i stawów, późne krwawienia pourazowe	plamica, skłonność do siniaczenia, krwawienia z błon śluzowych
Krwawienia pooperacyjne	często późne krwawienia, bardzo niebezpieczne	krwawienia podczas zabiegu, mało niebezpieczne
Wybroczyny i sińce	wybroczyny występują rzadko, sińce pojedyncze	często liczne wybroczyny i sińce
Wynik ucisku miejsca krwawienia	po zwolnieniu ucisku nawrót krwawień	krwawienie zatrzymuje się często na stałe

Diagnostyka laboratoryjna skaz krwotocznych

Przykłady zestawów badań koagulologicznych

koagulogram: liczba płytek krwi, czas krwawienia (BT), czas protrombinowy, APTT, stężenie fibrynogenu.

skrócony koagulogram: liczba płytek krwi, czas protrombinowy, APTT.

Przykłady zastosowania wypranych badań układu hemostazy w diagnostyce skaz krwotocznych

Rodzaj zaburzenia	Wyniki badań
		PT	APTT	TT	BT
Skazy płytkowo-naczyniowe	N	N	N	⇑
Choroba von Willebrandta	N	⇑	N	⇑
Hemofilia A i B, niedobór czynników XI, XII, krążące antykoagulanty	N	⇑	N	N
Hypo-, dysfibrynogenemie	⇑	⇑	⇑	N

Należy zaznaczyć, że w badaniach przesiewowych, w diagnostyce choroby von Willebranda często stosowany jest analizator PFA-100. Wydłużony czas okluzji sugeruje konieczność dalszej diagnostyki w tym kierunku.

Przykładowe zmiany parametrów układu hemostazy w zespole rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego - zespół DIC

• Obniżone miano płytek krwi < 100 x 10⁹/L z tendencją spadkową.

• Przedłużone „czasy”(PT, APTT).

• Istotnie podwyższone stężenie FDP/D-Dimerów.

• Obniżone stężenie inhibitorów (AT, białka C).

• Obniżone stężenie czynników krzepnięcia (V, VIII, X, XIII).

Diagnostyka zaburzeń układu hemostazy po zabiegach chirurgicznych

Zależnie od rodzaju zabiegu chirurgicznego występuje różne ryzyko powikłać ze strony układu hemostazy, możemy mieć do czynienia zarówno z krwawieniami jak i zakrzepicą.

Ze szczególnie dużym ryzykiem powikłań należy się liczyć w przypadku zabiegów kardiochirurgicznych, ortopedycznych a także, w pewnych przypadkach w czasie zabiegów ginekologicznych.

• W okresie operacyjnym.

aktywacja układu krzepnięcia, aktywacja układu fibrynolizy, aktywacja płytek krwi

• W okresie okołooperacyjnym (do 6 godzin po zabiegu).

wzmożona fibrynoliza, dysfunkcja układu krzepnięcia (zużycie czynników krzepnięcia oraz efekt niezneutralizowanej heparyny, spadek liczby płytek krwi i ich dysfunkcja (osłabiona agregacja) mogą prowadzić do krwawień - obserwujemy wydłużenie PT, APTT, TT, spadek stężenia fibrynogenu i miana płytek krwi.

• W okresie pooperacyjnym (powyżej drugiej doby po zabiegu)

zahamowanie układy fibrynolizy, wzrost stężenia czynników układu krzepnięcia i białek ostrej fazy (fibrynogen), zwiększona liczba płytek krwi i wzmożona ich reaktywność.

Praktyczne zastosowanie podstawowych badań układu krzepnięcia

1) Czas protrombinowy (PT)

1. Testowanie sprawności szlaku aktywacji uruchamianego przez TF

2. Monitorowanie leczenia doustnymi antykoagukantami

Sposoby wyrażania czasu protrombinowego:

• wskaźnik % -PT (sek) wzorcowe x 100

PT (sek) badane

• % aktywności - obliczany z krzywej rozcieńczeń osocza prawidłowego

• współczynnik - PT (sek) badane

PT (sek) wzorcowe

• INR - ( współczynnik ) ^ISI

W celu ujednolicenia wyrażania czasu protrombinowego, dla potrzeb monitorowania leczenia doustnymi antykoagulantami, wprowadzono międzynarodowy współczynnik znormalizowany INR (International Normalized Ratio). Współczynnik INR uwzględnia różnice w czułości stosowanych odczynników i aparatury.

Laboratoryjna kontrola leczenia doustnymi antykoagulantami:

INR - zakres terapeutyczny

Mechaniczne zastawki serca: 3.0 - 4.0

Biologiczne zastawki serca: 2.0 - 3.0

Migotanie przedsionków: 2.0 - 3.0

Leczenie ŻChZZ: 2.0 - 3.0

Leczenie zatoru tętnicy płucnej: 2.0 - 3.0

2) Czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (APTT)

1. Testowanie sprawności szlaku aktywacji uruchamianego przez czynniki kontaktu.

2. Monitorowanie leczenia heparyną, wykrywanie hemofilii.

Laboratoryjna kontrola leczenia heparyną niefrakcjonowaną:

Do uzyskania terapeutycznego konieczne jest utrzymanie w osoczu aktywności heparynowej w granicach 0.2 - 0.6 j./ml

metoda zakres terapeutyczny

Czas krzepnięcia met. LW: przedłużenie 1.5 - 3.0 razy

Czas krzepnięcia po aktywacji (ACT): przedłużenie 1.5 - 3.0 razy

APTT: przedłużenie 1.5 - 2.5 razy

Instrukcja wykonania ćwiczenia

1. Omówienie wykonania objawu opaskowego

2. Wykonanie (prezentacja) oznaczenia czasu krwawienia - 2 grupy po 5 osób

Materiały: nożyki do nakłuwania, gaziki, spirytus, rękawiczki jednorazowe

Czas krwawienia metodą Duke'a.

Płatek ucha nakłuwa się igłą. Wypływającą krew usuwa się gazikiem do chwili ustania wypływu krwi.

Prezentacja czasu krwawienia wykonywanego metodą Ivy'ego.

Sposób przedstawiania wyników: czas wyrażony sekundach

3. Badania układu krzepnięcia

Pięcioosobowe grupy studentów mają wykonać oznaczenia, które ułatwią zrozumienie złożonych mechanizmów regulacyjnych hemostazy wtórnej (badania układu krzepnięcia i fibrynolizy).

Aktywacja układu krzepnięcia

1. aktywacja za pomocą tromboplastyny tkankowej (w tzw. dawniej w układzie „zewnątrzpochodnym”) - wykonanie oznaczenia czasu protrombinowego

2. badanie układu wspomagającego (tzw. dawniej układ „wewnątrzpochodny”) - wykonanie oznaczenia APTT

Materiały: łaźnia wodna, pipety na 100 μl, końcówki do pipet, odczynniki (tromboplastyna, APTT reagent, ProC Global, bufor boranowy, roztwór kwasu octowego), chlorek wapnia, probówki, osocze mrożone, rękawiczki

3a. Wykonanie oznaczenia czasu protrombinowego

Czas protrombinowy wg Quicka:

Zasada. Po dodaniu do osocza tromboplastyny i chlorku wapniowego następuje aktywacja protrombiny, a następnie zamiana fibrynogenu w fibrynę. Wynik pomiaru zależy od zawartości w osoczu protrombiny, czynników V, VII i X oraz fibrynogenu.

Odczynniki

tromboplastyna

0.025 M roztwór CaCl₂

Wykonanie. Do probówki zawierającej 100 µl osocza ubogopłytkowego należy dodać 100 µl roztworu tromboplastyny. Całość dokładnie wymieszać i inkubować przez
1 min. w łaźni wodnej (37^oC). Po inkubacji dodać 100 µl roztworu CaCl₂. Mierzyć czas upływający od momentu dodania chlorku do wykrzepienia próby.

Zadanie do wykonania

Oznaczyć PT w dwóch oznakowanych próbkach osocza. Wynik czasu protrombinowego przedstawić w postaci wskaźnika czasu protrombinowego, współczynnika czasu protrombinowego oraz INR (ISI=1.0). Porównać i zinterpretować otrzymane wyniki.

Interpretacja wyników: Wartości prawidłowe wynoszą 10-16 sekund. Czas protrombinowy jest przedłużony w następstwie obniżenia aktywności 3 spośród 4 czynników krzepnięcia zależnych od witaminy K (II, VII i X). Przedłużenie czasu protrombinowego obserwuje się w awitaminozie K, chorobach miąższu wątroby czy w zespole rozsianego krzepnięcia śródnaczyniowego.

3b. Wykonanie oznaczenia APTT

(czas częściowej tromboplastyny po aktywacji - Activated Partial Thromboplastin Time)

Zasada. Mierzy się czas krzepnięcia osocza zmieszanego z cytrynianem po maksymalnej aktywacji czynników XI i XII oraz w obecności stałych stężeń fosfolipidu. Czynniki XI i XII są aktywowane podczas wstępnej inkubacji osocza z zawiesiną kaolinu (zamiast kaolinu może być celit). Kaolin jest odpowiednikiem kolagenu, natomiast kefalina - fosfolipidów. Efektem opisanej reakcji jest wytrącenie włóknika i wytworzenie skrzepu.

1. Do dwóch ogrzanych probówek dodać:

• 100 μl osocza,

• 100 μl odczynnika aktywującego (fosfolipidy + aktywator powierzchniowy),

• inkubować 2 min.,

• dodać 100 μl CaCL₂ i zmierzyć czas krzepnięcia.

2. Do dwóch ogrzanych probówek dodać:

• 100 μl osocza,

• 100 μl odczynnika aktywującego (fosfolipidy + aktywator powierzchniowy),

• Do jednej probówki dodać 10 μl odczynnika A do drugiej 10 μl odczynnika B,

• inkubować 2 min.,dodać 100 μl CaCL₂ i zmierzyć czas krzepnięcia.

Sposoby wyrażania APTT:

czas wyrażony sekundach

Współczynnik: czas próby badanej/ czas próby kontrolnej

Zadanie do wykonania

Oznaczyć APTT w dwóch probówkach, należy porównać i zinterpretować otrzymane wyniki.

Interpretacja wyników: Wartości prawidłowe zależą od zastosowanego testu i wynoszą 25-40 sekund. Nieprawidłowy czas APTT występuje u pacjentów leczonych doustnie lub parenteralnie lekami przeciwzakrzepowymi oraz gdy poziom czynników krzepnięcia toru wewnętrznego (prekalikreina, wysokocząsteczkowy kininogen HMGH, czynniki VII, IX, XI, XII) lub wspólnego (I, II, V, X) uległ obniżeniu do 30-40% wartości wyjściowych. Jednoczesne stwierdzenie prawidłowego czasu protrombinowego pozwala wykluczyć niedobór protrombiny, czynników V i X i hipofibrynogemię jako przyczynę przedłużania APTT.

4. Wykonanie agregacji płytek we krwi pełnej

Pomiar agregacji metodą ubytkową - SPC (Single Platelet Couting)

Zasada. Oznaczamy miano płytek we krwi pobranej na EDTAK₂ przed i po dodaniu ADP (aktywatora płytek krwi). Agonista powoduje tworzenie agregatów płytkowych i spadek miana płytek w badanej krwi. Obliczamy współczynnik ubytku płytek jako miara tworzenia agregatów płytkowych:

wsp. agreg. = ((Plt0 - Pltaktyw)/Plt0)*100

Odczynniki

roztwór 1 (0.9% NaCl)

roztwór 2 (1 mM ADP)

Zadanie do wykonania

Do dwóch probówek dodajemy (po zamieszaniu) po 0,5 ml krwi pełnej;

• oznaczyć miano płytek w obu probówkach,

• do jednej probówki dodać 10 μl roztworu 1, a do drugiej 10 μl roztworu 2, mieszamy,

• inkubować 3 minuty,

• oznaczyć miano płytek krwi,

• oznaczyć współczynnik agregacji.

Współczynnik agregacji wyrażany jest w procentach.

Interpretacja wyników: Wartości prawidłowe agregacji wynoszą > 60 %, niższe wyniki związane są z dysfunkcją płytek lub stosowaniem leków przeciwpłytkowych.

1

---