5544


BIOLOGIA MOLEKULARNA wykład 4 27.10.2006

Ekspresja informacji genetycznej u prokariota - TRANSKRYPCJA

Polecany podręcznik: „Biologia molekularna bakterii” (stąd też zdjęcia na slajdach).

Centralny dogmat biologii molekularnej:

Informacja genetyczna zawarta w DNA ulega przepisaniu na mRNA w wyniku transkrypcji, następnie w procesie translacji powstają białka.

Jest wiele odstępstw od tego dogmatu:

- znamy wirusy mające jako materiał genetyczny RNA, czyli informacja płynie z RNA do RNA

- D. Boltimore, R .Dulbecco i H.M .Temin - Nagroda Nobla - informacja może płynąć z RNA na DNA, odkrycie odwrotnej transkryptazy (obecnie szeroko stosowane, np. na matrycy RNA syntetyzuje się cDNA).

E.coli informacje wstępne:

(dygresja: w warunkach laboratoryjnych zmutowano jakiś gen, co nie miało żadnego wpływu na właściwości badanego organizmu, więc wnioskujemy że gen nie jest niezbędny do życia, ale należy pamiętać że tak dzieje się w warunkach laboratoryjnych; gdy organizm znajdzie się w warunkach naturalnych, in vivo (np. E.coli w przewodzie pokarmowym), zupełnie inny zestaw genów może ulegać ekspresji i być potrzebny tej bakterii, bo trudno sobie wyobrazić, że te pozostałe 1688 genów nie bierze w ogóle udziału w rozwoju tej bakterii, takie niepotrzebne geny już dawno zostałyby wyeliminowane w procesie ewolucji. Nie do osiągnięcia są w laboratorium warunki identyczne jak naturalne. Np. gdyby zmutowanego w pewnym genie bakteriofaga / bakterię, który /a normalnie namnaża się w warunkach laboratoryjnych, zmieszano z dzikimi typami i wprowadzono do bardziej naturalnego środowiska, to po kilkunastu pokoleniach organizmy zmutowane zostałyby wyeliminowane, przegrawszy konkurencję. Wniosek - pamiętaj że nie można doświadczeń w warunkach laboratoryjnych w pełni odnosić do potencjalnego efektu w warunkach naturalnych.)

-Przy takiej dysproporcji szeregu białek występujących w dużej ilości kopii i szeregu białek występujących w małej ilości, geny kodujące te białka (a więc większość białek - ponad 80%) ulegają przejściowej ekspresji. W jakimś momencie gen ulega ekspresji, powstaje białko, po czym gen jest wyciszany. Charakterystyczne jest, że ta większość białek ulega ekspresji tuż po replikacji DNA - w momencie kiedy widełki replikacyjne mijają dany gen, ulega on krótkiej ekspresji, powstaje mRNA i białko, a w momencie kiedy dwuniciowa struktura DNA zostaje odtworzona po replikacji, gen pozostaje uśpiony i i czeka do następnej rundy replikacji. (większość genów ulega zatem takiej częściowej ekspresji, co oznacza, że musi istnieć ścisła kontrola tej ekspresji)

Wyrażanie się informacji genetycznej:

Transkrypcja:

Czym różni się RNA od DNA?

- RNA jest jednoniciowe

- RNA cukier jest rybozą

- tworzy pary A-U

Z czego wynika, że nie każde RNA jest mRNA?

- np. rRNA, tRNA - brak translacji, nie tworzy się białko

- RNA ma najczęściej konkretną, ściśle określoną strukturę

- musi spełnić 2 warunki:

1) mieć sekwencję, czy strukturę, dzięki 2) na końcu 3' mieć ogon (sekw.)

której może rozpocząć się translacja (musi poliA, będący zakończeniem

mieć określoną strukturę lub sekwencję, mRNA

do której przyłączają się rybosomy)

Eukariota 5' czapeczka 3'ogon poliA - długi

Bakterie 5' RBS (sekw. Shine-Dalgarno) 3'ogon- znacznie krótszy

Wirusy 5' np. sekw. IRES 3'ogon- bardzo krótki

np.1końcowa Adenina

Różnice między ekspresją u prokariota i eukariota:

bakterie eukariota

- mRNA najczęściej (ale niekoniecznie) - mRNA monocistronowy

policistronowy (zawierający informację (zawierający informację zakodowaną w

zakodowaną w kilku genach) jednym genie)

-niestabilny, okres funkcjonalnego - zazwyczaj stabilny okres funkcjonalnego

półtrwania wynosi ~2min (krótki) półtrwania, wynosi średnio 6 godz.

Skąd wynika tak krótki okres półtrwania? - czas życia, pojedynczej komórki bakterii wynosi ~20 godzin, a jeśli w optymalnych warunkach laboratoryjnych czas generacji np. E. coli jest 20 minut, a czas trwania mRNA 2 min, to jest to jednak aż 10% czasu życia tej komórki, zanim się ona podzieli i powstaną dwie potomne. Wobec tego, jeśli mówimy że eukariotyczny mRNA jest stabilny i okres półtrwania wynosi średnio 6 godzin, co jest ogromną różnicą między komórką eukariotyczną i czasem trwania mRNA, a komórką prokariotyczną, to pamiętać należy, że komórka eukariotyczna ma znacznie dłuższy ten czas w większości przypadków podziałowych (od podziału do podziału).

- introny występują bardzo rzadko - introny występują powszechnie

(pojedyncze przypadki u bakterii,

występują też u bakteriofagów)

Czyli w większości przypadków powstający mRNA bakteryjny ulega bardzo niewielkim dalszym przemianom, obróbkom; najczęściej jest on bez zmian używany w procesie translacji. W organizmach eukariotycznych podlega on różnym modyfikacjom posttranskrypcyjnym

- zawiera obszary międzygenowe - brak obszarów międzygenowych

nie kodujące białek

- posttranskypcyjne modyfikacje są rzadkie - posttranskrypcyjnie modyfikowany

- zazwyczaj zaangażowane w procesie - często w stanie spoczynku

translacji (od razu)

W przypadku organizmów eukariotycznych utworzony mRNA, już z czapeczką i poliA, może pozostawać w stanie uśpionym, niezaangażowanym bezpośrednio w proces translacji.

- transkrypcja sprzężona w czasie z translacją i - transkrypcja, translacja i degradacja

degradacją mRNA mRNA rozdzielone w czasie i miejscu

Typy RNA:

- mRNA - istotne są 3 zasady (kodon)

- rRNA - wchodzi w skład 70S rybosomów

- tRNA - przenosi aminokwasy do rybosomów przy syntezie białek

- zawiera antykodon (3 zasady komplementarne do kodonu na mRNA)

- sn RNA

- sc RNA

- siRNA (z ang. small interfering RNA - tzw. małe interferujące RNA) -

- oligonukleotydy odpowiedzialne za degradację (zniszczenie) mRNA , charakteryzują się 100%-ową homologią sekwencji do ich celu. Wchodzą w skład specjalnej rybonukleazy i nadają jej specyficzność do sekwencji. Mechanizm siRNA powstał najprawdopodobniej jako mechanizm obronny przed dwuniciowymi wirusami RNA (dsRNA). W konsekwencji degradacji mRNA odpowiedni gen jest wyciszany, bo nie powstaje kodowane przez niego białko.

- miRNA (tzw. mikro-RNA) - są mediatorami w przypadku mechanizmu interferencji

z translacją mRNA; kodowane są przez genom komórki, jak normalne geny. Prekursorem są niewielkie RNA, o strukturze szpilki do włosów, które ulegają obróbce podobnie do siRNA. Kompleks wchodzą w skład kompleksów rybonukleoproteinowych blokujących specyficznie translację mRNA i nadają im specyficzność. W odróżnieniu od siRNA, miRNA nie posiadają 100%-owej homologii sekwencji do docelowego mRNA. miRNA są zaangażowane w negatywną regulację ekspresji genów podczas rozwoju.

(Interferencja RNA (RNAi, z ang. RNA interference) - zjawisko wyciszania albo wyłączenia ekspresji genu przez dwuniciowy RNA (dsRNA, z ang. double stranded RNA) o budowie i sekwencji zbliżonej do sekwencji DNA wyłączanego genu. Wyłączenie może się odbywać na trzech poziomach: a) degradacja mRNA; b) blokowanie translacji mRNA; c) prawdopodobnie również przez indukcję epigenetycznego wyciszenia genu. Bezpośrednimi mediatorami interferencji RNA są małe, 21-23 par zasad, dwuniciowe RNA, będące produktem obróbki większych fragmentów RNA przez specjalne nukleazy.)

(To małe rozwinięcie dodałam, bo profesor o tym tylko wspomniał, a propos Nagrody Nobla. Na pewno wyczerpująco tematem zaopiekuje się profesor Jerzmanowski))

Budowa polimerazy E.coli (DNA zależna polimeraza RNA):

Proces transkrypcji, czyli syntezy mRNA, odbywa się przy udziale dwóch typów polimeraz:

- DNA zależna polimeraza RNA (polimeraza, która syntetyzuje RNA na matrycy DNA)

- u niektórych wirusów RNA zależna polimeraza RNA (na matrycy RNA syntetyzuje mRNA)

U wszystkich innych bakterii polimerazy są podobnego typu co polimeraza E.coli. Wszystkie są holoenzymem zbudowanym z 3 podjednostek, choć w nieco innym wzajemnym stosunku molarnym i wykorzystują określone czynniki transkrypcyjne δ - ta sama zasada budowy.

DNA zależna polimeraza RNA:

Zbudowana z 3 podjednostek, w skład holoenzymu wchodzą:

- 2 podjednostki α

- podj. β - oraz dodatkowo podj. δ

- podj. β'

- łączy wszystkie podjednostki

- oddziałuje z czynnikami regulacyjnymi

- masa cząsteczkowa 36511 Da

- odpowiada za wierność transkrypcji ( DNA zależne polimerazy RNA mają właściwości korekcyjne i zachowują dużą wierność syntezy, co sprowadza się do właściwego wyboru nukleotydu, który jest dołączany na zasadzie komplementarności oraz rozpoznaniu i skorygowaniu popełnionego przez siebie błędu

- 150615 Da

- 155159 Da

rozpoczęcie transkrypcji - nadaje enzymowi zdolność rozpoznawania określonych promotorów)

- 70 Da

- jest ich kilkanaście, zależnie od tego jaki gen ma być

transkrybowany, będzie on czytany przez holoenzym i dołączoną odpowiednią podjednostkę δ.

Czynniki δ polimerazy RNA E.coli:

(RNA polimerase core enzyme + sigma factor = active enzyme)

W standardowych warunkach wzrostu ponad 90% aktywności polimerazy RNA w komórce E. coli odpowiada δ70 (poznaje klasyczne regiony w promotorze). Alternatywne jednostki δ, występujące w niewielkich stężeniach, kontrolują ekspresję genów umożliwiających komórce odpowiednie reagowanie na sytuacje stresowe i zmiany środowiska, jak np. szok cieplny, szok chemiczny i głodzenie oraz geny związane z procesami rozwoju. W określonych warunkach dochodzi do znacznego zwiększenia udziału określonej podjednostki δ w aktywności polimerazy RNA w komórce przez przyspieszenie syntezy tej podjednostki i/lub zahamowaniu jej rozpadu.

Np. δ70 (613aa) rpo D - ekspresja większości genów (housekeeping genes) kodujących funkcje niezbędne do życia w każdych warunkach (ten czynnik

transkrypcyjny odpowiada za odczytywanie większości genów E.coli, ale nie wszystkich)

δ32 rpo H (heat-shock) - udział w odpowiedzi na stan stresu cieplnego

(ekspresja genów szoku cieplnego), a także działanie etanolu, odczynników utleniających, promieniowania UV lub zakażenia fagowe (najwcześniej odkryty); powstają głównie białka opiekuńcze - chaperoniny, które utrzymują strukturę II, II i IV-rzędową białek w niekorzystnych warunkach, chroniąc je przed zmianą konformacji.

δ54 rpo N (Nitrogen regulated genes) - udział w odpowiedzi na głód azotowy (uruchamia wszystkie geny związane z metabolizmem azotu)

δ28 fli A (Flagellar-based motility)

δ24 rpo E (Extreme heat-shock, periplasmic stress - ECF)

δfecI fec I (Ferric citrate uptake - ECF)

Czym się różnią?

Są one zaangażowane w ekspresję różnych grup genów i różnią się sekwencjami paromotorowymi, blokami -10 i -35 i odległością między tymi dwoma blokami.

Druga grupa polimeraz RNA DNA zależnych

- np. polimeraza faga T7, różni się od bakteryjnej tym, że jest to jedno białko, posiadające wszystkie funkcje tamtych podjednostek (rozpoznawanie odpowiedniego promotora, rozpoczęcia i prowadzenia procesu transkrypcji, oddziaływania z czynnikami regulacyjnymi)

Taka DNA zależna polimeraza RNA, homologiczna do polimerazy faga T7, występuje też w mitochondriach. DNA zależna polimeraza RNA mitochondrialna jest typu polimerazy faga T7 (poszukiwanie homologi sekwencji w BLAST). Jest to kolejny argument na pochodzenie mitochondriów od bakterii (pierwotne komórki eukariotyczne miały jako symbionta bakterię, a ta bakteria być może miała jakiegoś faga i to zostało jako relikt).

Sekwencje promotorowe u E.coli:

Aby rozpoczęła się transkrypcja, oprócz matrycowego DNA, polimerazy RNA i nukleotydów potrzebna jest sekwencja, którą polimeraza rozpoznaje i od której zaczyna proces syntezy mRNA - sekwencja promotorowa.

Czyli przed każdym operonem w sekwencji DNA musi być określona sekwencja, która jest rozpoznawana przez polimerazę RNA.

Przeważnie każda sekwencja promotorowa składa się z dwóch bloków nukleotydowych

-10 i -35 (jako 1 uważamy pierwszy nukleotyd w mRNA)

blok -35 blok -10

sekw. najwyższej zgodności 5'TTGACA3' 5'TATAAT3'

operon laktozowy 5'TTTACA3' 5'TATGTT3'

operon tryptofanowy 5'TTGACA3' 5'TTAACT3'

Co to znaczy że promotor jest silny / słaby?

Silny promotor stabilnie wiąże polimerazę RNA. Słaby promotor np. na 100 cząsteczek posiadających taką sekwencję ~10 wiąże polimerazę RNA, czyli nie ze wszystkich kopii danego genu rozpoczyna się transkrypcja. Pojęcie silny/słaby promotor odnosi się do stopnia (stałej) wiązania polimerazy RNA.

W warunkach laboratoryjnych siłę promotora bada się za pomocą genów reporterowych np. β-gal, xyl-E, GFP. Pod badaną przez nas sekwencję promotorową podłączamy jakiś gen reporterowy (bez jego własnego promotora - wtedy ekspresja zależy tylko od siły promotora) i oznaczamy jego ekspresję (np. oznaczamy poziom β-galaktozydazy).

Pojęcie operonu:

U bakterii np. E.coli powstający transkrypt jest policistronowy, tzn. że obejmuje kilka (1,2,3) różnych genów. Operon jest to zespół genów (tu geny strukturalne, jest ich kilka).

Jakie sekwencje muszą być zachowane przy operonie?

Na ogół jest gen regulatorowy (np. represorowy lac I), sekwencja promotorową (odczytywana przez określoną podjednostkę δ) i sekwencja RBS (Shine-Dalgarno). W przypadku bakteriofagów np. faga T7, u którego synteza mRNA zachodzi za pomocą innej polimerazy, ta sekwencja promotorowa jest zupełnie inna niż sekwencje promotorowe u E. coli.

Jakie jest wykorzystanie faga T7?

Fakt, że ta polimeraza to tylko jedno białko, powoduje, że łatwiej nią manipulować przy konstrukcji odpowiednich wektorów do układów do ekspresji i to, że polimeraza ta rozpoznaje niezwykle specyficzne, unikatowe sekwencje promotorowe.

Jeżeli mamy taki system, że w komórce mamy gen kodujący polimerazę faga T7 oraz geny podstawione pod promotor faga T7, to jeśli produkcja polimerazy faga T7 zostanie uruchomiona, będzie ona po odczytaniu swojego promotora syntetyzować mRNA na bazie podstawionego genu. Dodatkowo promotor faga T7 jest jednym z najsilniejszych znanych promotorów. Drugim takim jest promotor pochodzący z eukariotycznego wirusa cytomegalii (bakulowirusa). Jest to układ wykorzystywany nie tylko w biologii molekularnej i inżynierii genetycznej u bakterii, ale i przy konstrukcji wektorów służących do przenoszenia i ekspresji genów u roślin, czy u człowieka (przenoszony gen jest pod promotorem faga T7). Jest to tak silny i unikatowy promotor, że wiemy iż możemy sprawnie go kontrolując uzyskiwać duże ilości produktu danego genu.

Promotor jest w operonie jeden, natomiast RBS musi być przed każdym genem w operonie. Jeśli takiej sekwencji nie będzie przed genem, to będzie tworzone policistronowe białko.

(To zjawisko wykorzystuje się przy tworzeniu tzw. fuzji białkowych, a np. promotor + gen reporterowy to fuzja transkrypcyjna, wykorzystanie obcego promotora do ekspresji tego genu). Jeżeli nie ma, albo usuniemy RBS, i wszystko będzie w jednej fazie odczytu, to powstanie nam białko, które nazywamy białkiem fuzyjnym (np.składa się z dwóch całych białek). Gdzie wykorzystuje się takie fuzje białkowe? Oprócz doświadczeń podstawowych, w praktyce inżynierii genetycznej - białko rozumiane jako poliaminokwasowa sekwencja, przy czym to poli- może być różnej długości - wszystkie te ogony typu np. HisTag dodawane do naszego białka. Tak tworzymy nasze białko aby na początku lub na końcu była sekwencja 6, 8 czy 10 reszt histydynowych w jednej ramce odczytu wraz z naszym białkiem. Otrzymujemy w rezultacie badane białko, mające na N- lub C- końcu kilka reszt histydynowych. HisTag łączy się z niklem, co wykorzystujemy do oczyszczania badanego białka w kolumnowej chromatografii powinowactwa (na kolumnach ze złożem niklowym - NiNTA - absorbuje się nasze białko, inne białka nie, więc je z łatwością wymywamy, a następnie eluujemy badane białko z kolumny). Dzięki temu białko możemy oczyścić z dużą wydajnością już na jednej kolumnie, także do homogenności.

Schemat operonu:

- w większości przypadków w operonie występują geny kodujące białka jednego szlaku metabolicznego, o jednej funkcji

- w genomach bakteriofagów transkrypcja z pojedynczego promotora może obejmować wiele genów, niekoniecznie związanych z tą samą funkcją np. synteza wszystkich białek główki fagowej

Geny strukturalne

i p o Z Y A + sekw. RBS

0x08 graphic
0x01 graphic

W większości przypadków u bakterii operon grupuje w sobie albo geny jednego szlaku metabolicznego albo syntezy pojedynczego metabolitu, dlatego np. operon laktozowy koduje geny związane z rozkładem laktozy, tryptofanowy białka związane z syntezą tryptofanu, i in. np.argininowy (rozkład Arg), histydynowy, arabinozowy itd.

Są przykłady, że taki operon może dotyczyć genów nie związanych z tą samą funkcją:

Np. operon faga λ - z prawego promotora zachodzi odczytywane są geny, dotyczące zupełnie różnych funkcji w rozwoju bakteriofaga, np. białek wchodzących w skład główki fagowej, białek wchodzących w skład ogonka, białek potrzebnych do składania tych wszystkich elementów - są to białka związane z „morfologią” faga, można powiedzieć, że związane z jedną funkcją - tworzenia cząstki faga, ale jest to znacznie bardziej rozbudowane niż taki typowy operon np. laktozowy.

Geny zaczęto klonować w E. coli, ale okazało się to nieopłacalne. Najbardziej przydatne okazały się promieniowce, bo produkują antybiotyki - z przemysłowego punktu widzenia -, ale także do klonowania oraz Bacillusy, gdyż produkują użyteczne enzymy (i duża częśc przemysłu środków piorących i czystości opiera się o Bacillusy).

Kiedy już ukazywały się prace o klonowaniu do E. coli, nie opisywano jeszcze klonowania do szczepów promieniowców z przyczyn czysto komercyjnych i patentowych(firmy farmaceutyczne bały się konkurencji). Np. produkcja erytromycyny wymaga udziału dwudziestukilku genów (białek), a okazało się że tworzą one zgrupowania genów, których ekspresja idzie z kilku promotorów, tak aby zapewnić, że białka będą w równej ilości produkowane.

Reakcja transkrypcji:

Transkrypcja zawsze zachodzi w kierunku 5'→3' (mRNA jest syntetyzowane w kierunku 5'→3' - w stosunku do tworzącego się RNA) (a z punktu widzenia DNA to jest 3'→5').

Rozpoznanie sekwencji promotorowej, tworzony jest zamknięty, a potem otwarty kompleks polimerazy; najważniejsze jest przy tym aby rozplątać dwuniciową strukturę DNA, bo wtedy dopiero możliwe jest przyłączanie polimerazy i tworzenie mRNA. Do tego wykorzystywany jest fakt, że polimeraza tworząc kompleks inicjacyjny powoduje rozplecenie struktury dwuniciowej (inny proces w jakim jest wykorzystywane to, że działanie polimerazy RNA może zapoczątkować drugi proces - replikacja DNA, gdzie sekwencja ori jest blokowana z miejsca jakiegoś innego promotora, tak żeby polimeraza RNA mogła niejako zapoczątkować możliwośc procesu replikacji, bo replikacja również musi zachodzić na jednoniciowej matrycy, gdy nastąpi otwarcie struktury DNA).

Regulacja ekspresji genów - w jaki sposób możemy określić czy ekspresja genów jest regulowana, jakimi parametrami możemy to określić?

- ile powstaje mRNA lub białka (liczbowo ile cząsteczek danego białka powstaje, choć najpierw oceniamy ekspresję na poziomie mRNA) - jeśli brak, to ekspresja jest zerowa.

- większość genów tylko przejściowo ulega ekspresji, wtedy kiedy zachodzi replikacja genu.

Są geny konstytutywne, wyrażane stale (ekspresja ciągła), choć na ogół na niskim poziomie, niezależnie od tego w jakiej fazie wzrostu jest dana bakteria. Są też geny ulegające ekspresji czasowo, w określonym momencie, np. zespół genów eksprymowany gdy bakteria znajdzie się w warunkach głodu azotowego (nie są aktywne w obecności łatwo dostępnych źródeł azotu, stwierdza się brak tych białek, ale po przeniesieniu w warunki głodowe ich poziom gwałtownie wzrasta) - regulacja czasowa syntezy mRNA i białka.

To, że dane geny podlegają regulacji, rozumiemy przez regulację ilościową (ile danego białka powstaje) oraz regulację momentu (czasu) rozpoczęcia ekspresji genów tego białka (kiedy się to białko pojawia).

Np. dla bakteriofagów - W momencie zapoczątkowania procesu namnażania się bakteriofagów prawie nie stwierdzamy obecności białek strukturalnych (białek główki, czy ogonka), ale gdy ilość jego materiału genetycznego jest w komórce dostatecznie duża, obserwujemy gwałtowny przyrost ilości białek strukturalnych (bo one są dopiero wtedy potrzebne, po co główka gdy nie ma jeszcze materiału genetycznego - ekonomika wykorzystania informacji genetycznej w ewolucji).

W większości przypadków regulacja w tym rozumieniu sprowadza się do momentu zapoczątkowania procesu transkrypcji. Czyli regulacja transkrypcji dotyczy głównie jej inicjacji (aktywatory, represory itd.) - w przypadku organizmów prokariotycznych, u eukariota trochę inaczej.

Po inicjacji, struktura zamknięta polimerazy przekształca się w strukturę otwartą i nastepuje rozpoczęcie syntezy mRNA wzdłuż nici matrycowej DNA. Czy na tym etapie może zachodzić regulacja transkrypcji? - Tak, choć u prokariota występuje rzadziej. Znamy u bakterii białka takie jak ProE i ProA, które kierują prawidłowym przebiegiem syntezy mRNA, na etapie elongacji. Gdy w tych genach zajdzie mutacja elongacja może się kończyć przedwcześnie, nie tam gdzie powinna zakończyć się transkrypcja, lub powstaje zbyt długi transkrypt, elongacja jest przedłużona, czy spowolniona.

Dwa typy zakończenia transkrypcji:

- terminacja Rho-niezależna

- terminacja Rho-zależna

Rho jest białkiem, wytwarzanym przez E.coli (np.)

W terminacji Rho-niezależnej kluczowym elementem jest tworzenie struktur tzw szpilki do włosów. Sekwencja GGCCAC i GCGGA, czyli rodzaj sekwencji palindromicznej, umożliwia po przepisaniu na RNA utworzenie dużej struktury tzw. szpilki do włosów. Utworzenie tego typu elementów na strukturze RNA powoduje powstanie rodzaju zamka, przez który polimeraza nie może już przejść i po nieudanej próbie przejścia kompleks polimerazy oddysocjowuje od DNA i następuje zakończenie transkrypcji. Nazywamy ją terminacją Rho-niezależną, bo nie ma tu żadnego białka, które by to wspomagało, a wynika to z samej sekwencji DNA, która po przepisaniu na RNA umożliwia utworzenie struktury szpilki do włosów i ta struktura jest odpowiedzialna za terminację.

Terminacja Rho-zależna:

Rho jest białkiem o charakterze helikazy, które wędruje wzdłuż nici DNA tuż za kompleksem transkrypcyjnym. Aby zapoczątkować Rho-zależne zakończenie transkrypcji, również musi być utworzona struktura szpilki do włosów na sekwencji mRNA, ale struktura ta jest w tym przypadku znacznie mniejsza (jeśli tam tworzy ją 11-12 nukleotydów, to tu 3-4), jej trzonek, gdzie występuje struktura dwuniciowa jest bardzo krótki i ona sama w sobie nie wystarczyłaby do tego żeby spowodować odłączenie się kompleksu polimerazy. Powoduje to jednak, że kompleks transkrypcyjny troczę się zatrzymuje, a to wystarczy żeby białko Rho „dogoniło” kompleks transkrypcyjny i dołączyło się do miejsca w którym występuje szpilka do włosów i gdzie zatrzymał się kompleks. Białko Rho powoduje oddysocjowanie mRNA od DNA i odpadnięcie kompleksu polimerazy od matrycy.

Czyli o tym, czy może zajść Rho-zależne czy Rho-niazależne zakończenie transkrypcji decyduje wielkość tworzonej szpilki do włosów. Przykłady tworzenia takich struktur:

Np. w bakteriofagu λ (lambda) - są tu dwa bardzo silne promotory, tzw. prawy i lewy promotor faga λ, od których zaczyna się proces transkrypcji (ekspresji) genów tego faga. DNA faga wnika do komórki, jest ono liniowe, zamyka się w strukturę kolistą i do tych dwóch silnych promotorów (o bardzo silnym powinowactwie do komórkowej polimerazy RNA) dołącza się polimeraza i rozpoczyna się transkrypcja. Jednak tuż za genem n jest bardzo silny terminator i normalnie w tym miejscu kończy się wydłużanie transkryptu, kompleks transkrypcyjny rozpada się i powstaje w efekcie dość krótki transkrypt (podobnie dzieja się po obu stronach - prawej i lewej). Ten traskrypt koduje jednak gen n, którego produkt działa jako tzw. antyterminator. Kompleks antyterminacyjny, jaki tworzy się w przypadku tej antyterminacji u faga λ, jest bardzo skomplikowany. Jeżeli nie ma tego kluczowego białka N, kompleks antyterminacyjny się nie utworzy, bo białko to decyduje o dołączaniu się wszystkich pozostałych elementów. Biorą w tym udział białka komórkowe NutA i NutG, NutB, S10, polimeraza RNA (następuje konieczność tworzenia się pewnych pętli w RNA), a wytworzenie tego kompleksy antyterminacyjnego powoduje to, że polimeraza, pomimo obecności bardzo silnego terminatora (szpilki do włosów) idzie dalej.

Cały ten kompleks jest potrzebny aby roztopić tą bardzo silną strukturę RNA szpilki do włosów i żeby proces transkrypcji mógł biec dalej.

Gdy jest już dużo produktu tego genu n, transkrypcja ponownie startuje z lewego promotora i biegnie dalej dzięki produktowi tego genu i utworzeniu kompleksu antyterminacyjnego, który roztapia szpilkę terminatora, pozwalając na kontynuację transkrypcji.

U bakterii znany jest szereg genów regulowanych na zasadzie antyterminacji. Nie jest to mechanizm bardzo powszechny, ale istnieją grupy genów, których regulacja odbywa się w ten właśnie sposób.

Zjawisko sprzężenia transkrypcji, translacji i degradacji mRNA u prokariota:

Jedna z zasadniczych różnic między prokariota i eukariota aprowadza się do tego, że u organizmów prokariotycznych proces transkrypcji i translacji jest z sobą sprzężony. Czyli nie jest tak, że jest najpierw syntetyzowany mRNA, które oddziela się od matrycy DNA, wędruje gdzieś lub pozostaje uśpione i dopiero potem następuje translacja. Tworzony jest mRNA i natychmiast przyłączane są rybosomy, a kiedy rybosomy przejdą dalej na mRNA syntetyzując białko, to ta zużyta już część mRNA jest natychmiast degradowana.

Dlatego ten czas półtrwania mRNA jest tak krótki.


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
5544
5544
5544
5544
5544
5544
5544
5544

więcej podobnych podstron