BIOSYNTEZA KWASU GLUTAMINOWEGO (i lizyny przy okazji)

Aktualna światowa produkująca aminokwasy przekroczyła mln ton rocznie. Największy ilościowy udział w tej produkcji mają: kwas L - glutaminowy - około 1 mln ton, i L - lizyna - około 850 000 ton.

Aminokwasy są szeroko wykorzystywane przez różne gałęzie przemysłu. Około 66% wyprodukowanych aminokwasów znajduje zastosowanie w przemyśle spożywczym, 30% jako dodatki do żywności i pasz, a około 4% w medycynie, przemyśle kosmetycznym i jako substraty w przemyśle chemicznym. W przemyśle spożywczym aminokwasy pojedynczo lub w mieszaninie, są wykorzystywane jako polepszacze smaku, wśród których najbardziej znany jest glutaminian sodu, a także jako antyoksydanty i substraty do otrzymywania słodziku (aspartanu). Coraz powszechniej praktykuje się wzbogacanie pasz oraz żywności, zwłaszcza dietetycznej, w deficytowe aminokwasy. W medycynie aminokwasy pełnią rolę czynników terapeutycznych przy zaburzeniach pokarmowych i metabolicznych, są składnikami płynów infuzyjnych. Pochodne niektórych aminokwasów, zwłaszcza N - acilowe pochodne, stosowane są w przemyśle kosmetycznym jako substancje powierzchniowo - czynne. W przemyśle chemicznym aminokwasy stanowią surowce wyjściowe do produkcji polimerów, np. włókien polialaninowych, czy poliglutaminianowych. Ten ostatni wykorzystywany jest do pokrywania powierzchni skór syntetycznych.

Metody otrzymywania aminokwasów:

1. metoda mikrobiologiczna (fermentacja) prowadzona za pomocą rosnących szczepów produkcyjnych

2. synteza enzymatyczna

3. synteza chemiczna

Do prod. aminokwasów, w tym kwasu glutaminowego i L - lizyny, wykorzystywane są metodę fermentacji.

Technologia otrzymywania szczep

L - aminokwasów metodą fermentacji. Inokulum

I etap: namnażanie szczepu

Cukier sterylizacja II etap: namnażanie szczepu (kultura mateczna)

Fermentacja główna

Oddzielenie komórek (biomasy)

Zatężanie

Krystalizacja

Suszenie

Produkt

Do produkcji kwasu glutaminowego, a także lizyny, wykorzystywane są szczepy Corynebacterium glutamicum (z greckiego: coryne - maczuga, buława). Bakterie wykryte przez Japończyka w 1959 roku.

Charakterystyka szczepu:

Komórki są gram (+), nie tworzą przetrwalników i nie wykazują zdolności do ruchu. Mają one charakterystyczny kształt maczugi (coryne), mogą rosnąc w warunkach tlenowych i beztlenowych. Są mezofilami, optymalna temperatura wzrostu 28 - 30°C. Corynebacterium glutamicum nie wykazuje aktywności proteolitycznej, celulolitycznej i amylolitycznej. Wszystkie szczepy są auksotrofami względem biotyny, niektóre wymagają do wzrostu dodatkowo tiaminy. Ich wspólną cechą jest zdolność do sekrecji kwasu glutaminowego, inicjowana przez dodanie środka powierzchniowo - czynnego lub antybiotyku.

BIOSYNTEZA I UWARUNKOWANIA SZCZEPU DO NADPRODUKCJI KW. GLUTAMINOWEGO

I etap: asymilacji jonu amonowego

1. dehydrogenaza L - glutaminianowi

2. syntetaza L - glutaminowa

3. syntaza L - glutaminianowa

Centralny metabolizm u Corynebacterium glutamicum obejmuje:

• glikolizę

• szlak pentozowy (pentozofosforanowy)

• Cykl Krebsa

• System reakcji anaplerotycznych (uzupełniających)

System ten uzupełnia Cykl Krebsa w kwas szczawiooctowy, który jest dalej przekształcany do kwasu 2 - oksoglutanowego. Najważniejszymi reakcjami anaplerotycznymi Są reakcje katalizowane przez karboksylazę fosfoenolopirogronianową oraz karboksylazę pirogronianową. W wyniku tych reakcji tworzą się duże ilości szczawiooctanu. NADPH potrzebny do syntezy kwasu glutaminowego dostarczany jest w dużych ilościach przez cykl pentozofosforanowy.

Bakterie Corynebacterium glutamicum posiadają aktywną dehydrogenazę glutaminianowi i labilną, mało aktywną dehydrogenazę 2 - oksoglutaranową (dalej wprowadzamy do Cyklu Krebsa). W związku z tym 2 - oksoglutaran jest preferencyjnie przekształcany kwasu glutaminowego.

Bakterie Corynebacterium wykazują wysoką aktywność ureazy rozkładającej mocznik do amoniaku. Jony amonowe wprowadzane są do komórki na drodze dyfuzji, a przy niskim stężeniu tych jonów za pośrednictwem białkowego nośnika (transport aktywny). Pierwszym biorcą jonów NH₄⁺ jest 2 - oksoglutaran, który przekształcany jest do kwasu glutaminowego i dalej do glutaminy. W procesie włączania NH₄⁺ do aminokwasów uczestniczą 3 enzymy:

1. dehydrogenaza glutaminianowi

2. syntetaza glutaminowa

3. syntaza glutaminianowa

Głównym enzymem jest enzym nr 1. Dwa pozostałe zabezpieczają syntezę kwasu glutaminowego przy niskim stężeniu Janów amonowych. Kolejnym uwarunkowaniem jest brak izoenzymów i związanych z tym dodatkowych mechanizmów i związanych z tym dodatkowych mechanizmów regulacji. Brak enzymów degradujących wytworzony kwas glutaminowy. Komórki Corynebacterium glutamicum są naturalnymi auksotrofami wymagającymi do wzrostu biotyny ( biotyna uczestniczy w syntezie kwasów tłuszczowych (fosfolipidów) - tworzą warstwę w błonie cytoplazmatycznej). Transport kwasu glutaminowego z komórki do podłoża zachodzi wyłącznie przy bardzo niskim stężeniu biotyny w podłożu (dla lizyny jest odwrotnie).

WARUNKI PRODUKCJI KWASU GLUTAMINOWEGO I LIZYNY

1. Źródła węgla

Melasa z trzciny cukrowej - zaw. 38% sacharozy i 20% cukrów redukujących (np. glukoza)

Melasa buraczana - zaw. 50% sacharozy

Hydrolizaty skrobi (około 60% glukozy)

2. Źródła azotu

Amoniak gazowy lub w roztworze wodnym

Nieorganiczne sole amonowe (najczęściej siarczan amonu)

Mocznik (bo mają aktywną ureazę)

Jony amonowe pełnią podwójną rolę - jako źródło azotu i jako czynnik regulujący pH podłoża fermentacyjnego. Stężenie tych jonów w pożywce należy utrzymywac na umiarkowanym poziomie, dlatego dodawane są one porcjami w trakcie procesu biosyntezy (sprzyjające warunki dla dehydrogenazy glutaminianowej).

3. Czynniki wzrostu: aminokwasy i witaminy

W Przypadku lizyny obowiązkowe dodawanie aminokwasów. Aminokwasy wymagane do prawidłowego wzrostu szczepu wprowadzane są do podłoża z ekstraktem mięsnym, hydrolizatem białka sojowego, wyciągiem narokowym kukurydzy itp.

Rys. Wpływ stężenia biotyny na biosyntezę kwasu glutaminowego przez Corynebacterium glutamicum.

2,5 μg/l - optymalne stężenie biotyny w podłożu (po przekroczeniu synteza zablokowana)

W przypadku lizyny - optymalne stężenie biotyny minimum 30 μg/l (do 60 μg/l)

Dodatek tiaminy (witaminy B1) do podłoża korzystnie wpływa na wzrost szczepu.

4. Sole nieorganiczne: mikro- i makroelementy.

Szczególnie ważną rolę odgrywają makroelementy: K, Mg, oraz mikroelementy Mn²⁺, Fe²⁺. Wpływają na aktywność i konformację białek enzymatycznych, decydują o kierunku metabolizm i o transporcie substratów i produktów.

5. Odczyn środowiska

Optymalnym dla wzrostu bakterii jest naturalne lub słabo alkaliczne pH. Dla produkcji kwasu glutaminowego optimum pH mieści się w granicach 7 - 8 (jony amonowe powodują charakter alkaliczny).

6. Natlenianie

Ilość dostarczanego powietrza: 2 vvm (2 objętości powietrza na 1 objętosc pożywki w ciągu 1 min). Szybkość obrotu mieszadła: około 550 obr/min (rpm, min^-1).

Nadmiar tlenu sprzyja syntezie kwasu 2 - oksoglutaranowego, a nie glutaminowego. Nadmiar zaś powoduje tworzenie się kwasu bursztynowego i mlekowego.

7. Temperatura 30 - 32°C

Biosynteza kwasu glutaminowego i lizyny - system fermentacji okresowej z zasilaniem pożywką. Bioreaktory o pojemności do 1000 m³ (większe niż w lizynie). Proces biosynteza kwasu glutaminowego, podobnie jak lizyny, jest procesem dwu fazowym:

1. wzrost szczepu

2. właściwa biosynteza kwasu glutaminowego

W przypadku nadmiernej biotyny w podłożu hodowlanym należy do podłoża (na początku hodowli) dodac antybiotyk (Penicylina) lub środek powierzchniowo - czynny. Penicylina blokuje tworzenie się wiązań peptydowych. Środki powierzchniowo - czynne działają też na warstwę lipidową nie dopuszczając do jej utworzenia się.

METABOLIZM - ogół przemian biochemicznych zachodzących w komórce umożliwiających przemianę materii i zdobywanie energii. U organizmów jednokomórkowych metabolizm warunkuje spełnianie funkcji życiowych.

• ANABOLIZM (synteza) są to reakcje chemiczne w ramach których następuje TWORZENIE związków bardziej złożonych i reakcje te wymagają dostarczenia energii.

• KATABOLIZM (rozpad) degradacja związków złożonych zasobnych w energię w związki bardziej proste. Procesom rozkładu towarzyszy zwykle uwalnianie energii i są to reakcje egzoergiczne.

Charakterystycznym jest to, że procesy anaboliczne i kataboliczne przebiegają w sposób ciągły w organizmach, są ze sobą wzajemnie powiązane i nie można ich rozpatrywać oddzielnie. Zarówno anabolizm jak i katabolizm podlegają złożonym procesom kontrolnym. W organizmach przebiega właściwa gospodarka energetyczna i odbywa się to dzięki regulacji aktywności poszczególnych systemów enzymatycznych.

Z racji na funkcje metabolizm dzielimy na: podstawowy (centralny, pierwotny, pierwszorzędowy) i peryferyjny (wtórny, drugorzędowy).

Wśród procesów metabolicznych wyróżniono zespoły reakcji określane jako:

1. metabolizm centralny - jest to zespół reakcji potrzebny do życia komórki. Obejmuje to zarówno reakcje kataboliczne, anaboliczne, jak i amfiboliczne i przemiany te mają charakter UNIWERSALNY dla znakomitej większości grup taksonomicznych mikroorganizmów i organizmów wyższych.

2. metabolizm pośredni - dotyczy on głównie przemian katabolicznych. Zaliczane są tu reakcje, które dostarczają substratów dla metabolizmu centralnego (np. hydroliza skrobi) oraz usuwają nadmiar produktów (np. aminokwasy).

3. metabolizm peryferyjny - jest to zwykle zespół reakcji anabolicznych. Dostarczają organizmom produkty bardzo SPECYFICZNE niespełniające podstawowych funkcji metabolicznych, ułatwiające jednak tworzenie takich substancji jak antybiotyki, toksyny i substancje powierzchniowo - czynne.

Klasycznym zjawiskiem jest to, że metabolity pierwotne powstają w wykładniczej fazie wzrostu.

Podstawowe szlaki metaboliczne:

• Glikoliza (zachodzi w warunkach tlenowych i beztlenowych) - z glukozy powstają dwie triozy

W ramach glikolizy następuje podwójne ufosforylowanie heksozy i jej rozbicie na dwie triozy i są to cząsteczki pirogronianu bądź fosfoenolopirogronianu. Trioza po reakcji dekarboksylacji w postaci acetyloCoA włączona jest do Cyklu Krebsa.

• Cykl Krebsa

W ramach Cyklu Krebsa dzięki wysokiej reaktywności szczawiooctanu powstają pośredniki zawierające 4 i 5 atomów węgla, co daje możliwość synteza aminokwasów zawierających 4 bądź 5 atomów węgla. Cykl Krebsa zachodzi w warunkach tlenowych (powiązany z układem oddechowym) i reakcje zachodzące w tym szlaku należą do najbardziej wydajnych energetycznie. Synteza aminokwasów takich jak glicyna, lizyna, kwas asparaginowy opiera się właśnie na tych przemianach.

Zasadniczym szlakiem degradacji heksoz jest glikoliza. W wyniku glikolizy powstają fragmenty trójwęglowe (kwas pirogronowy), które w warunkach tlenowych ulegają dekarboksylacji do acetyloCoA i etap ten stanowi punkt wejścia do Cyklu Krebsa. Glikolizę zapoczątkowuje podwójne ufosforylowanie cząsteczki heksozy i powstające wysokoenergetyczne wiązania fosforanowe w fosfotriozach zostają wykorzystane do synteza 2 cząsteczek ATP w ramach fosforylacji substratowej. Przemiany produktów glikolizy w warunkach tlenowych powodują znacznie wyższy zysk energetyczny (fosforylacja oksydacyjna, w ramach której powstaje 36 cząsteczek ATP). Łączny bilans glikolizy, Cyklu Krebsa i łańcucha oddechowego daje 38 cząsteczek ATP (2 z fosforylacji substratowej, 36 z oksydacyjnej). Z biotechnologicznego punktu widzenia w ramach przemian zachodzących w warunkach tlenowych możemy liczyc na pośredniki bioproduktów zawierających 3, 4 i 6 atomów węgla. W warunkach beztlenowych, przy deficycie tlenu lub przy niskim natlenieniu, zachodzą procesy fermentacyjne tzn. nie dochodzi do pełnego spalenia substratu i powstają takie produkty jak etanol, kwas mlekowy, kwas bursztynowy, masłowy, propionowy, octowy, aceton, butanol, izopropanol, wodór, diacetyl, acetoina i butandiol.

PORÓWNANIE WZROSTU DROŻDŻY SACCHAROMYCES CEREVISIAE W WARUNKACH TLENOWYCH I BEZTLENOWYCH

100 g glukozy

Warunki tlenowe warunki beztlenowe

43 g biomasa 2 g biomasa

41 g H₂O 46 g etanol

67 g CO₂ 7 g produkty uboczne

45 g CO₂

Ze względu na deficyt związków czterowęglowych i pięcioęglowych w ramach szlaku glikolitycznego funkcjonują reakcje wspomagające (anaplerotyczne) powodujące, że główne produkty glikolizy takie jak fosfoenolopirogronian i pirogronian ulegają karboksylacji do szczawiooctanu. Szczawiooctan jest najbardziej relatywnym pośrednikiem Cyklu Krebsa, a tym samym siłą napędową tego cyklu i procesu oddychania. Enzymy prowadzące do przemiany to karboksylaza fosfoenolopirogronianowa i pirogronianowa.

Szlakiem funkcjonującym równolegle z glikolizą jest szlak heksozomonofosforanowy. W ramach tego szlaku glukoza zostaje fosforylowana do 6 - fosfoglukozy, a następnie utleniona do 6 - fosfoglukonianu. W wyniku reakcji dekarboksylacji powstają pentozy (ryboza, ksyloza), tetrozy i sedoheksulozo - 7 - fosforan, a nastepnie eryttroza (4C). W ramach tego szlaku powstają związki zawierające 5, 7 i 4 atomy węgla. Zysk energetyczny z funkcjonowania tego szlaku wynosi 36 ATP.

Szlak Endnera - Doudoroffa

Pierwszy etap tego szlaku - jak w HMP (powstaje 6 - fosfoglukonian). Dalsze etapy szlaku - jak w glikolizie. Zysk energetyczny tych przemian bardzo niski (zaledwie 1 mol NADPH i 1 mol NADH).

PRZEMIANY PERYFERYJNE METABOLIZMU MIKROORGANIZMÓW PRZEMYSŁOWYCH (metabolizm wtórny, metabolizm drugorzędowy, metabolizm przemian specyficznych)

Mikroorganizmy oprócz metabolitów niezbędnych dla rozwoju mogą wytwarzać produkty
nie spełniające funkcji metabolicznych wykazujących jednak ważne właściwości.
Są to głównie związki niskocząsteczkowe i związki organiczne, czyli organiczne substancje niskocząsteczkowe. Substancje te określa się ogólnie terminem IDIOLITY,
ponieważ ich synteza ma miejsce głównie w fazie stacjonarnej, czyli idiofazie.
(Faza, w której pobierane są składniki odżywcze nazywa się tropofaza). Jakkolwiek synteza idiolitów może rozpoczynać się już w tropofazie, przy czym główne ilości idiolitów powstają w fazie stacjonarnej. Z chemicznego punktu widzenia idiolity są to np.: aminokwasy, alkaloidy, chinony, antocyjany, flawonoidy, fenazyny, nitryle, wybrane peptydy, piperazyny, pirydyny, pirole, polieny, steroidy, tetracykliny, polipeptydy, itp. Jeżeli chodzi o ich wykorzystanie biotechnologiczne to są to np.:

• antybiotyki, które znalazły zastosowanie w leczeniu chorób: infekcyjnych, nowotworowych, antybiotyki wykorzystywane są przy wykonywaniu przeszczepów - antybiotyki zapewniają to, że przeszczepy nie są odrzucane, antybiotyki stosowane są do konserwowania żywności,

• probiotyki - są to substancje stosowane do stymulowania kiełkowania roślin, zwiększania plonowania roślin oraz stosowane do stymulowania wzrostu zwierząt,

• toksyny - wytwarzane przez mikroorganizmy wykorzystywane są głównie do zwalczania owadów jako insektycydy,

• inhibitory enzymów - są związane z metabolizmem peryferyjnym, najczęściej wykorzystywane w farmakologii przy leczeniu nadciśnienia, bo ogranicza funkcje określonych enzymów, stosowane przy leczeniu chorób nowotworowych i owrzodzenia żołądka,

• polisacharydy: dekstran (w farmakologii jako środek zastępczy osocza krwi), pululan (w przemyśle spożywczym jako powłoki ochronne), alginianu (środek żelujący), ksantan (środek żelujący).

Generalnie idiolity są substancjami wykazującymi określoną aktywność biologiczną i wśród tych aktywności najważniejsze są właściwości:

• anaboliczne,

• cytotoksyczne,

• hemolityczne,

• herbicydowe,

• immunostymulujące,

• przeciw drobnoustrojowe (ukierunkowane),

• przeciw nowotworowe,

• przeciw zapalne,

• uspokajające i pobudzające.

Idiolity tworzone są tylko przez wybrane grupy mikroorganizmów, nie jest to umiejętność powszechna. W produkcji idiolitów wyspecjalizowane są promieniowce (Streptomyces), grzyby strzępkowe (Penicillium, Aspergillus, Mucor) oraz bakterie (Bacillus, Azotobacter). Ten sam szczep może wytwarzać równocześnie idiolity należące do różnych klas chemicznych. Cechą charakterystyczną jest to, że produkcja idiolitów uzależniona jest w dużym stopniu od warunków hodowli (dostępności pożywek, rodzaju hodowli, warunków zasolenia, temperatury i pH). * Ponieważ te metabolity specyficzne powstają w momencie kiedy ta dana kultura mikroorganizmów jest w jakiś sposób zagrożona. Synteza idiolitów jest najbardziej intensywna w warunkach ograniczonego czy limitowanego składu podłoża, niskich stężeń źródła węgla i azotu.

Rola tych związków przede wszystkich ekologiczna. Jest to forma metabolizmu mająca na celu zapewnienie nierosnącej komórce utrzymanie jej aktywności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu stanu równowagi z otoczeniem w warunkach, w których normalny metabolizm (związany ze wzrostem populacji i rozmnażaniem) jest już niemożliwy. Biochemicy produkcję metabolitów peryferyjnych traktują jako tzw. wentyl bezpieczeństwa i nazywają to formą życia, w której dochodzi do nadprodukcji niektórych metabolitów w sposób niezbilansowany i jest to efekt rozregulowania podstawowych mechanizmów zarządzających życiem populacji.

Najszerszym pojęciem definiującym przyczyny powstawania tych związków jest tzw. wolna gra ewolucyjna zachodząca na marginesie wcześniej ukształtowanych procesów życiowych.

Charakterystyczne dla syntezy idiolitów jest to, że w czasie wzrostu mikroorganizmów (tropofaza) występuje silna represja dróg metabolicznych odpowiedzialnych za produkcję idiolitów w warunkach, w których wzrost szczepu w jakiś sposób zostaje zagrożony następuje natychmiastowa derepresja enzymów metabolizmu wtórnego. Podstawowymi sygnałami do tej derepresji enzymów jest ograniczenie ilości źródła węgla, azotu i fosforu. Głównym mechanizmem odpowiedzialnym za uaktywnienie tych dróg jest sprzężenie zwrotne. Wymiana sygnałów między metabolizmem centralnym i metabolizmem peryferyjnym zachodzi w tzw. węzłach metabolicznych. Metabolizm centralny i metabolizm peryferyjny mają te same prekursory, są to przede wszystkim ufosforylowane cukry, fosfoenolopirogronian, acetylo-CoA, malonylo-CoA (cykl Krebsa), aminokwasy (białkowe). Punktem wyjścia tych przemian peryferyjnych są te same związki, które zarządzają w metabolizmie centralnym.

GENETYCZNE UWARUNKOWANIA METABOLIZMU PERYFERYJNEGO

Mikroorganizmy posiadają genofory, które mogą pomieścić kilka tysięcy genów. U promieniowców, które produkują większość antybiotyków jest ich około 7 tysięcy. Ponieważ w całym cyklu życiowym wykorzystana jest informacja zawarta tylko w około 2 tysięcy genów, tak wiec istnieje spory zapas DNA, które nie zawierają istotnych informacji dla funkcji życiowych mikroorganizmów Są to tzw. milczące geny (silnet genes) i potencjał tych genów tłumaczy najprawdopodobniej dlaczego mikroorganizmy w określonych warunkach mogą syntetyzować tysiące różnych produktów o specyficznym charakterze zawsze aktywnych biologicznie. Wyzwaniem dla biotechnologów jest to, że trudne są do zdefiniowania i odtworzenia warunki, w których synteza idiolitów zostaje uruchomiona. Istotnym jest również to, że geny strukturalne kodujące enzymy swoiste dla tych szlaków są zlokalizowane w chromosomach i tylko w niewielu przypadkach w plazmidach. Geny chromosomalne odpowiedzialne za syntezę związków specyficznych zlokalizowane są obok siebie tworząc tzw. klaster. Liczba genów strukturalnych dla różnych metabolitów specyficznych jest różna. Do biosyntezy dekstranu potrzebny jest zaledwie 1 gen (odpowiedzialny za syntezę enzymu dekstranosacharaza). Natomiast synteza gramicydyny wymaga 2 genów, a antybiotyki (ampicylina i cefalosporyna) - kilkanaście genów strukturalnych. Biosynteza metabolitów specyficznych powiązana jest ściśle z szlakami centralnymi i mają wspólne metabolity pośrednie. Podstawowym związkiem łączącym obie formy metabolizmu jest acetylo - CoA. Ponadto takie substancje jak malonylo - CoA, aminokwasy niebiałkowe, fosfoenolopirogronian i fosforylowane cukry.

(SCHEMAT)

Szlak poliketydowy to zespół reakcji enzymatycznych wyróżniający się dużą różnorodnością, funkcjonującym według trybu podobnego do szlaku synteza kwasów tłuszczowych. Tak więc reakcjami charakterystycznymi dla tego szlaku będą:

1. wiązanie grupy arylowej

2. kondensacja kolejnej cząsteczki malonylo - CoA

3. redukcja grupy ketonowej

4. wydzielenie cząsteczki wody

5. redukcja podwójnych wiązań

Szlak poliketydowy działający na użytek synteza metabolitów specyficznych stanowi modyfikację szlaku synteza kwasów tłuszczowych polegającą na tym, że:

1. wykorzystywane są tutaj różne prekursory

2. różny jest stopień redukcji podwójnych wiązań

3. włączone są reakcje cyklizacji

4. istnieje możliwość włączania podstawników wywodzących się ze środowiska hodowlanego (fenylooctan - prekursor do syntezy penicyliny) lub będący związkiem powstającym w ramach szlaków centralnych.

PODSUMOWUJĄC:

1. Duża różnorodność struktury chemicznej idiolitów spowodowana jest NISKĄ SPECYFICZNOŚCIĄ SUBSTRATOWĄ ENZYMÓW FUNKCJONUJĄCYCH W RAMACH SZLAKÓW PREFYFERYJNYCH.

2. Istnienie licznych rozgałęzień szlaków peryferyjnych - dzięki temu zjawisku powstać mogą substancje różnorodne chemicznie (łańcuchowe, cykliczne, aromatyczne, wiążące pierścienie nie tylko węgiel ale również azot, siarka i tlen).

3. Istnienie węzłów metabolicznych łączących szlaki centralne ze szlakami peryferyjnymi.

Aktualnie przedmiotem szczególnego zainteresowania z zakresu metabolizmu peryferyjnego jest mikroflora mórz i oceanów z różnych stref klimatycznych, poziom zasolenia i głębokości. Interesującym polem działań są również mikrobakterie izolowane z gruntu biofilmów szczątków roślin.

WYKORZYSTANIE POSZCZEGÓLNYCH GRUP MIKROORGANIZMÓW W PROCESACH BIOSYNTEZY

Termin mikroorganizmy nie jest jednoznaczny i do tej grupy zalicza się bakterie, liczne grzyby, niektóre glony (algi), pierwotniaki. Odrębną grupę stanowią wirusy, które stanowią przedmiot zainteresowania biotechnologów, a są to niekompletne jednostki z pogranicza życia i materii nieożywionej.

Cechy bakterii takie jak nieposiadanie jądra (nukleoid), różnice w barwieniu grama i wynikające stąd istotne różnice wynikające z budowy ściany komórkowej, zdolność do przetrwalnikowania determinują przydatność poszczególnych grup bakterii do określonych dziedzin biotechnologii. Bakterie nieprzetrwalnikujące posiadające wielowarstwową błonę komórkową stosowane są do produkcji metabolitów niskocząsteczkowych. Wśród najczęściej wykorzystywanych są tu bakterie kwasu glutaminowego i są to bakterie Corynebacterium i Brevibacterium, bakterie kwasu mlekowego (Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus) również tworzą antybiotyki (streptomycynę), bakterie kwasu octowego (Acetobacter i Glukonobacter).

Wśród bakterii gram (-) na szczególną uwagę zasługuje E. coli. Znamy ją jako mikroorganizm zasiedlający nasze jelita i wytwarzające w naszym organizmie szereg witamin, które możemy wykorzystywać. Bakterie E. coli wykorzystywane są do produkcji acylazy penicylinowej (enzym służący do produkcji półsyntetycznych penicylin). Ponadto E. coli zasłużyła się biotechnologii jako doskonały biorca obcego DNA. Kolejne wykorzystanie tej bakterii to wykorzystanie w diagnostyce mikrobiologicznej do oznaczenia tzw. miana coli.

O wiele szersze wykorzystanie znalazły bakterie przetrwalnikujące gram (+). Dzięki szczególnej budowie ściany komórkowej tej bakterii (przewaga peptydoglukanu, brak przestrzeni peryplazmatycznej) powoduje, że bakterie te mogą wydzielać poza komórkę mnóstwo substancji, w tym również wysokocząsteczkowych (enzymy).

Szczególne zastosowanie w biotechnologii znalazły szczepy z rodzaju Bacillus i wydzielać one mogą poza komórkę nie tylko enzymy, ale i antybiotyki i insektycydy.

(TABELA)

Antybiotyki:

• Bacytracyna

• Butylozyna

• Gramicydyny

• Polimyksyny

Są to antybiotyki polipeptydowe, które w większości przypadków stosowane są jako dodatki do pasz w celu ich stabilizacji.

Enzymy:

• Amylaza penicylinowa (do produkcji antybiotyków półsyntetycznych)

• α - amylaza produkują nie tylko bakterie, ale i grzyby strzępkowe. Jedne i drugie są wykorzystywane do produkcji enzymów w świecie. α - amylaza grzybowa funkcjonuje przy niższym pH, zastosowanie w przemyśle owocowym. α - amylaza bakteryjna jest zwykle bardziej termostabilna w porównaniu z amylazą grzybową.

• Podobna sytuacja jest z β - amylazą i izoamylazą.

• Do hydrolizy polisacharydów innych niż skrobia wykorzystywane są jeszcze α i β glukanaza.

• Do hydrolizy laktozy β - galaktozydaza.

• Izomeraza glukozowa konwertuje glukozę do fruktozy, niemu zawdzięczamy wypieki, które nigdy nie wysychają.

• Penicylinaza paszę dla krów się stabilizuje dodatkiem penicyliny; dodaje się do mleka, gdy badania wykazują, że dużo antybiotyku w mleku (dodatek enzymu niweluje)

• Pululanaza (Bacillus) rozkłada wiązania α - 1,6 w skrobii

• Termolizyna do produkcji aspartamu

Bioinsektycydy:

• Bacillus thuringensis (ochrona przed insektami)

• Bakterie Clostridium

Szczepy rodzaju Bacillus należą do tlenowców, jednakże mogą rozwijać się w stosunkowo szerokim zakresie pH i wiele z gatunków należących do tego rodzaju nie ma kompletnego Cyklu Krebsa. W zależności od poziomu natlenienia intensyfikowany lub ograniczany jest etap tworzenia przetrwalników i wydzielania metabolitów. Przedmiotem dużego zainteresowania biotechnologów są bakterie z rodzaju Clostridium należące do grupy beztlenowców, co powoduje, że wiele metabolitów może być uzyskanych w warunkach deficytu tlenu, a tlen stanowi zwykle najdroższą pożywkę w procesach biosyntezy. Szczepy Clostridium wydzielają poza komórkę enzymy hydrolizujące skrobię, celulozę, pektyny i białka.

Cechą wyróżniającą jest to, że szczepy z rodzaju Clostridium fermentują zarówno heksozy, jak i pentozy.

Wytwarzają stosunkowo duże ilości alkoholi (etanol i butanol) oraz kwasy organiczne i ketony. Wśród bakterii Clostridium jest wiele gatunków termofilnych co stanowi szansę uzyskania z ich udziałem enzymów o wysokiej termostabilności.

WYKORZYSTANIE PROMIENIOWCÓW W BIOTECHNOLOGII

Promieniowce - mikroorganizmy o morfologii grzybów, a budowa komórki zbliżona do bakterii. Są to mikroorganizmy bytujące głównie w glebie. Główni producenci antybiotyków i toksyn. Są bardzo zmienne.

Głównymi cec hami wyróżniającymi promieniowce jest ich budowa komórki jak u bakterii i morfologia zbliżona do grzybów. Promieniowace są blisko spokrewnione z takimi bakteriami jak: Corynebacterium, Brevibacterium (produkcja aminokwasów), Micrococcus i Mycobacterium. Największe znaczenie mikrobiologiczne (i biotechnologiczne) ma rodzaj Streptomyces. Większość antybiotyków stosowanych w lecznictwie wytwarzane jest właśnie przez te promieniowce. 2/3 z poznanych dotychczas natybiotyków wytwarzanych jest przez Streptomyces.

Antybiotyki

(promieniowce) (grzyby)

- aktynomycyna - cefalosporyna

- erytromycyna - cyklosporyna

- kanamycyna - fumogilina

- nystatyna - penicylina

- okrytetracyklina - wariotyna

- polifungina

- streptomycyna

- tetracyklina

- gentamycyna

- wiomycyna

- neomycyna

Szczepy Actinomyces to szczepy promieniowców produkujące silne toksyny. Są to Actinomyces bovis i Actinomyces isrealii.

Szczepy Streptomyces wykorzystywane są również do produkcji inhibitorów enzymów i do produkcji witaminy B12 (kobalaniny).

Wykorzystanie grzybów strzępkowych w biotechnologii.

Jeżeli chodzi o ich atuty i ich wpływ na nasze życie to należy na to patrzeć troche inaczej. Są to mikroorganizmy, które rozwiną się wczędzie. Uwielbiają wszystko to co lubimy jeść, a więc stanowią ogromne zagrożenie dla naszej żywności. Z gruntu są tlenowcami, ale mogą się również rozwinąc w warunkach beztelnowych (dobrze zakręcony słoiczek). Żaden inny organizm nie jest t ak wszędobylski. Nie ma na nich sposobu.

Grzyby strzępkowe są w zasadzie organizmami tlenowymi, jednakże mogą się rozwijać również w warunkach silnego deficytu tlenu. Wykorzystują zarówno nieorganiczne, jak i organiczne źródło azotu. Mają intensywną przemianę materii i ogromną tolerancję na zmieniające się warunki otoczenia. Rozwijają się bardzo szybko na powierzchni większości pproduktów spożywczych. Zwykle są to organizmy mezofilne, jednakże chętnie rozwijają się również w temperaturze kilku stopni Celcjiusza (lodówki). Znoszą przez długi okres czasu niewystarczającą wilgotność i w miarę obfity wzrost można obserwować jeszcze przy wilgotności 11 - 14%. pH preferowane 3 - 5, a nawet do 11. Główne znaczenie biotechnologiczne to zdolność do wytwarzania enzymów i innych związków np. kwasów organicznych, które są stosowane w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym (kwas glukonowy), w oczyszczalniach ścieków i w przetwórstwie żywności. Z punktu widzenia przyrodniczego współdziałając z bakteriami uczestniczą w rozkładzie materii organicznej umożliwiając tym samym kolejne okresy wegetacji roślin. Potężną siłą w tym aspekcie jest wytwarzanie przez grzyby enzymów rozkładających celulozę i kompleks lignino - celulozowy (tego bakterie nie posiadają). Negatywne strony funkcjonowania grzybów to:

• straty spowodowane pleśnieniem produktów spożywczych, tkanin, skór, drewna, papieru i różnych materiałów technicznych

• powodują alergie (zarodniki)

• zdolność do obfitej produkcji toksyn (aflatoksyny, patulina)

Grzyby strzępkowe produkują cenne produkty o szczególnych właściwościach (antybiotyki).

NAJWAŻNIEJSZE ENZYMY WYTWARZANE W DUŻEJ SKALI PRODUKOWANE PRZEZ GRZYBY

1. Amylazy

Potrzebujemy amylaz bakteryjnych i pleśniowych. Bakteryje działają przy pH 6 - 7, a pleśniowe 4,5 - 5,5. W przemyśle owocowo - warzywnym mamy pH niższe.

Alfa - amylazy pleśniowe są aktywne już przy pH 4,5, mają niższą temperaturę optymalną (około 40stop) i nie wy magają do stabilizacji jonów wapnia. Tak więc przemysł owocowo - warzywny korzysta głównie z alfa - amylaz pleśniowych.

2. Enzymy pektynolityczne

Zainteresowanie przemysłu owocowo - warzywnego (uzyskanie soków, rozluźnienie tkanki warzyw i owoców). Tutaj grzyby są bezkonkurencyjne - bakterie praktycznie ich nie produkują.

3. Enzymy celulolityczne

4. Dekstranaza

Żeby dekstran dobrze działał w naszym organizmie, musi mieć określoną lepkość i wileko ść cząsteczek. Najpierw produkujemy dekstran, a potem dekstanaza rozkłada nam dekstan tworząc płyn o wymaganej lepkości i wielkości cząsteczek.

5. Inwertaza

6. Katalaza

7. Oksydaza glokozowa

Do produkcji tych enzymów głównie stosowane są szczepy Aspergillus i Penicillium.

WYKORZYSTANIE GLONÓW W BIOTECHNOLOGII

Zalicza się je umownie do mikroorganizmów ze względu na możliwość ich wykorzystania do produkcji specyficznych produktów takich jak agar - agar, karagenan i alginian. Tutaj też glony są bezkonkurencyjne. Ponadto glony wykorzystywane są w krajach o cieplejszym klimacie jako pasza dla zwierząt i nawóz. Szczególnym zainteresowaniem cieszy się glon o nazwie Chlorella, który wykazuje szczególną zdolność wykorzystania energii słonecznej do wzrostu. Aż 20% energii wymaganej dla rozwoju tego glonu zaczerpnięte jest z energii słonecznej. Typowe rośliny lądowe mają o wiele niższą sprawność w tym zakresie i zaledwie 2% tej energii czerpane jest ze słońca. Plony Chlorelli są dwudziestokrotnie wyższe z danej powierzchni uprawy w porównaniu z typowymi roślinami. Tak więc w klimacie tropikalnym, gdzie jest dużo akwenów (zbiorników wodnych) produkcja tych glonów prowadzona jest na szeroką skalę. Przedmiotem zainteresowania jeżeli chodzi o glony są również liczne substancje biologicznie czynne korzystne dla naszego zdrowia. Tak więc trwają liczne prace nad ich wykorzystaniem w przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym.

Biotechnologia środowiska:

• Technologie oczyszczania ścieków, utylizacji odpadów, oczyszczania powietrza

• Technologie bioremediacji i fitoremediacji (technologie ryzoremediacji)

Bioremediacja to technologia usuwania zanieczyszczeń takich jak związki ropopochodne, w tym chlorowcopochodne, metale ciężkie z gleby i zasobów wodnych z wykorzystaniem mikroorganizmów w celu kanalizowania, degradacji lub transformacji tych zanieczyszczeń do form mniej szkodliwych. W procesie bioremediacji wykorzystuje się głównie mikroorganizmy, duży jednak udział w tym procesie mają rośliny i mikroflora rozwijająca się w strefie przykorzeniowej. W zależności od narzędzia biologicznego rozróżniamy procesy bioremediacji, fitoremediacji i rezoremediacji. Cechami szczególnymi procesów bioremediacji są:

1. Niepowtarzalność - zależnie od specyfiki zanieczyszczenia, miejsca, gdzie powstało to zanieczyszczenie, stosuje się różne rozwiązania technologiczne

2. Praca w warunkach nieoptymalnych dla wzrostu mikroorganizmów i niesterylnych

Typowy proces biotechnologiczny prowadzony w warunkach optymalnych z udziałem jednego mikroorganizmu, a podczas procesu zapewniona była możliwość kontroli i regulacji parametrów. W procesie bioremediacji natomiast proces przebiega z udziałem mikroflory rodzinnej, bytującej w tym środowisku i mikroorganizmów wyselekcjonowanych pod kątem likwidacji danego zanieczyszczenia. Warunki temperaturowe, pH, zasolenia, wilgotności (w przypadku gleby) są dalekie od optymalnych i zmienne w czasie procesu oczyszczania.

PODZIAŁ PROCESÓW REMEDIACJI

1. Bioremediacja naturalna - jest to proces przebiegający samorzutnie bez stymulacji człowieka. Przebiega ona z udziałem mikroflory autochtonicznej (rodzimej), która zaadaptowała się do zanieczyszczeń i je degraduje. Bioremediacja naturalna przebiega jednak bardzo długo, trwa kilka, a nawet kilkadziesiąt lat. Bioremediacja ta powinna być jednak monitorowana, by nie doszło do rozprzestrzeniania zanieczyszczeń.

2. Biostymulacja - proces ten przebiega z włączeniem myśli człowieka i polega na wzbogacaniu danego miejsca odpowiedniej pożywki, by uaktywnić wzrost mikroorganizmów w zanieczyszczonym środowisku. Biosynteza obejmuje też takie zabiegi jak spulchnianie zanieczyszczonego gruntu lub napowietrzanie akwenów, by zwiększyć dopływ tlenu dla rozwijającej się mikroflory. W przypadku gleby można prowadzić też zraszanie celem zwiększenia wilgotności w oczyszczanym gruncie.

3. Bioaugmentacja - proces ten obejmuje zastosowanie zabiegów tak jak przy Biostymulacja oraz wprowadzenie do oczyszczanego środowiska mikroorganizmów wyspecjalizowanych w rokładzie danych zanieczyszczeń.

Procesy Bioremediacja mogą być prowadzone w miejscu zanieczyszczenia (In situ) lub zebrane w miejscu zanieczyszczenia i prowadzone w innym miejscu (ex situ).

Mikroorganizmy rozkładające substancje toksyczne, głównie węglowodory, występują w środowisku stosunkowo licznie. W gruntach są to przede wszystkim bakterie, promieniowce i grzyby. W środowiskach wodnych bakterie i drożdże. Wśród bakterii największą aktywność degradacyjną przypisuje się takim gatunkom jak Pseudomonas, Bacillus, Achranobacter, Alcaligenes. Wśród drożdży najważniejszym przedstawicielem jest Candida, a wśród grzybów - szczepy Penicillium, Aspergillus i Mucor. W ostatnich kilku latach wielkim odkryciem jest zaangażowanie w procesy biodegradacji mikobakterii tj. Gardonia, Nocardia, Dietza. Udział zarówno w zakładzie jak i produkcji węglowodorów.

Bioremediacja jest biotechnologią najbezpieczniejszą w tym zakresie i najtańszą. Jednakże z technologicznego punktu widzenia nastręcza wiele problemów z uwagi na zależność procesu i wspomnianą wcześniej niepowtarzalność. Na jej wyniki ma wpływ:

• rodzaj zanieczyszczeń i jego stężenie, toksyczność, biodostępność (problem biodostępności dotyczy głównie węglowodorów aromatycznych i poliaromatycznych, które są silnie absorbowane w porach gruntów i na skutek tego niedostępne dla mikroflory, która mogłaby zdegradować te substancje.

• szybkość rozprzestrzeniania się zanieczyszczenia

• obecność pożywek

• aktywność enzymów glebowych

---