^{A. Ekiel}

PRELEKCJA 7

Badanie bakteriologiczne moczu i pałeczki Gram(-)

Pałeczki Gram(-):

- występują w glebie, wodzie, przewodzie pokarmowym zwierząt i człowieka

- rosną na zwykłych podłożach

- w znacznym stopniu oporne na środki dezynfekujące, antybiotyki, chemioterapeutyki

- poprzez koniugację uczestniczą w procesie rozpowszechniania genów oporności na antybiotyki

- częsty czynnik etiologiczny zakażeń szpitalnych

Charakterystyka:

- posiadają fimbrie płciowe i adhezyjne

- nie produkują spor

- urzęsione (kilka wyjątków)

- niekiedy wytwarzają otoczki

- wytwarzają dużą różnorodność antygenów (O, H, K)

- szybko nabywają oporność na liczne antybiotyki (ma tu wielką rolę wymiana materiału genetycznego w mechanizmie koniugacji)

- są często przyczyną zakażeń wewnątrzszpitalnych

Podłoże McConkeya:

- wybiórcze - uniemożliwia wzrost bakteriom Gram(+) -> ponieważ zawiera fiolet krystaliczny i sole źółciowe

- różnicujące -> laktoza (różnicowanie laktozo-ujemnych i laktozo-dodatnich)

Podłoże zawiera barwnik (zwykle obojętny barwnik czerwony) barwiący kolonie fermentujące laktozę na różowo.

W preparacie mikroskopowym wszystkie Gram(-) wyglądają identycznie!

Antygen somatyczny stanowią łańcuchy polisacharydowe.

Pałeczki G(-) dzielimy na:

1. Enterobacteriaceae:

- względne beztlenowce

- fermentują glukozę

- oksydazo (-)

- redukują azotany do azotynów

2. pałeczki niefermentujące

- nie fermentują glukozy (rozkładają ją tylko w warunkach tlenowych)

- z reguły oksydazo (+), niektóre są oksydazo(-) jak Acinetobacter i Stenotrophomonas

Różnicowanie pałeczek Gram(-) - posiew na podłoże McConkeya:

1. kolonie różowe - laktozo-dodatnie (powstający w fermentacji kwas powoduje zmianę barwy wskaźnika):

- E. coli

- Klebsiella

- Enterobacter

- Citrobacter

2. kolonie bezbarwne - laktozo-ujemne:

a) fermentujące glukozę = oksydazo-ujemne:

- Salmonella

- Shigella

- Serratia

- Proteus

- Morganella

- Yersinia

b) nie fermentujące glukozy:

-> oksydazo-dodatnie:

- Pseudomonas

- Burkholderia

- Flavobacterium

-> oksydazo-ujemne:

- Acinetobacter

- Stenotrophomonas

Grupy nr 1 oraz 2a należą należą do Enterobacteriaceae!

Czynniki warunkujące chorobotwórczość Enterobacteriaceae:

a) czynniki adhezyjne:

- fimbrie pospolite CFA I-II, fimbrie agregacyjne, intimina EPEC

- Yad A (?), PsaA

b) oporność na bakteriobójcze działanie układu dopełniacza i fagocytozę:

- białko zewnętrzne Yersinia spp.

- wydłużone łańcuchy LPS Salmonelli spp.

- otoczki polisacharydowe E. coli, Klebsiella,

- Vi od salmonelli

c) inwazyny umożliwiające inwazję komórek nabłonka

d) toksyny: LPS, egzotoksyny (cytotoksyny, enterotoksyny)

e) siderofory - wiązanie jonów Fe

f) bakteriocyny (np. kolicyny) - substancje bakteriobójcze

znaczenie LPS:

- powoduje wstrząs i posocznicę

- aktywuje makrofagi, które zaczynają wydzielać cytokiny prozapalne Il-1, Il-6, Il-8, TNF-a

- cytokiny te odpowiadają za większość ogólnoustrojowych objawów zespołu wstrząsu toksycznego: spadek ciśnienia krwi, gorączkę, leukopenię, biegunkę

Egzotoksyny:

Cytotoksyny:

a) Cytotoksyny:

- toksyna Shiga: ShT

- SLT1, SLT2 - toksyny podobne do toksyny Shiga spotykane u E. coli

- czynnik nekrotyzujący CNF

b) CDT - cytotoksyna rozciągająca komórki:

- egzotoksyna białkowa

- powoduje reorganizację aktyny w komórce

- powoduje apoptozę komórek nabłonka hodowanych inwitro

Hemolizyny:

- wydzielane poza komórkę, do środowiska

- powodują powstanie porów w błonie komórkowej i co za tym idzie lizę komórek eukariotycznych, nie tylko erytrocytów

- działają też na leukocyty powodując leukopenię - zaburzają odpowiedź immunologiczną

- hemolizyny kontaktowe - wymagają do działania bezpośredniego kontaktu bakterii z komórką eukariotyczną, ponieważ nie są wydzielane (wytwarzane przez EAEC - enteroagregacyjne E. coli oraz przez Shigella flexneri)

Enterotoksyny:

- powodują zachwianie równowagi jonowej poprzez zaburzenie pracy pompy jonowej

- toksyny ST i LT u E. coli, ciepłostała toksyna Yersinia enterocolitica (YST), toksyna CT Shigella flexneri, toksyna Vibrio cholerae

- wywołują biegunkę sekrecyjną

Schorzenia powodowane przez poszczególne drobnoustroje:
E. coli	ZUM, ZOMR (antygen HI?), posocznica, biegunki
Shigella	czerwonka
Salmonella	Dur, dury rzekome, salmonelloza
Klebsiella spp. (najważniejsza K. pneumoniae)	Zapalenie płuc, ZUM, posocznica, biegunki
Klebsiella rhinosclerosis	Twardziel
Klebsiella ozene	Cuchnący nieżyt nosa
Enterobacter	ZSZ-ZUM
Citrobacter	Posocznica
Serratia	ZSZ ran, ZUM, ZUO, posocznica
Proteus	ZUM
Morganella	ZUM, zapalenie płuc
Yersinia pestis, Yersinia enterocolica	Odpowiednio: Dżuma, jersinioza
Burkholderia mallei	Nosacizna
Burkholderia pseudomallei	Melioidoza

Proteus wytwarza ureazę, Pseudomonas żółty barwnik, Flavobacterium zielony barwnik

Do rodzaju Pseudomonas zaliczano: rodzaj Burkholderia (B. capacia, B. mallei, B. pseudomallei) i Flavobacterium

Diagnostyka:

- posiew

- różnicowanie biochemiczne

- różnicowanie serologiczne - Salmonella, Shigella, szczepy E. coli

- serodiagnostyka - odczyn Widala

Mechanizmy oporności na antybiotyki:

1. ESBL:

- są to β-laktamazy o rozszerzonym spektrum działania (extended spectrum β-lactamases)

- warunkują oporność na penicyliny, cefalosporyny I-IV generacji (wyjątek - cefamycyny!) oraz na monobaktamy (aztreonam)

- są wrażliwe na inhibitory β-laktamaz, choć często efekt ten nie wystarcza, by szczepy były wrażliwe na połączenie beta-laktam+inhibitor

- geny tych enzymów znajdują się na plazmidach

- występują głównie u fermentujących, najczęściej u Klebsiella pneumoniae

- wywodzą się od β-laktamaz o szerokim spektrum, które dodatkowo poszerzone zostało o II-IV generację cefalosporyn (są wtórnymi beta-laktamazami)

- bakterie posiadające ESBL są wrażliwe na: karbapenemy, cefamycyny oraz na beta-laktamy w połączeniu z inhibitorami beta-laktamaz!

- należą do klasy AID

- powstały i powstają na nowo z beta-laktamaz o szerokim spektrum substratowym: TEM-1, TEM-2, SHV-1; w wyniku mutacji punktowych dochodzi do poszerzenia spektrum substratowego enzymów

- wspomniane enzymy (beta-laktamazy) o szerokim spektrum nadają oporność na aminopenicyliny, karboksypenicyliny, również (w dużych ilościach): ureidopenicyliny, cefalosporyny I generacji i cefoperazon; (w przypadku ESBL spektrum dodatkowo rozszerzone o II-IV generacja cefalosporyn)

- ok. 150 wariantów ESBL należących do 10 rodzin: TEM, SHV, CTX-M itd. - najczęściej występują u Klebsiella pneumoniae i E. coli

- poszczególne enzymy mają różną selektywność, aktywność -> preferencje substratowe

- poszczególne enzymy różnią się też aktywnością enzymatyczną i poziomem produkcji

- często szczepy produkujące ESBL pozostają wrażliwe in vivo na niektóre beta-laktamy należące do spektrum ESBL

- znane są gatunki Enterobacteriaceae u których gatunkowo specyficzne beta-laktamazy spełniają kryteria ESBL

Leczenie zakażeń szczepami produkującymi ESBL:

- nie stosować penicylin, cefalosporyn I-IV generacji (wyjątek - cefamycyny), monobaktamów

- w terapii stosujemy połączenia penicyliny z inhibitorami beta-laktamaz oraz antybiotyki innych grup (aminoglikozydy, fluorochinolony, karbapenemy)

Wykrywanie ESBL:

a) test dwóch krążków:

• krążki:

• CAZ - ceftazidym - najlepszy wskaźnik ESBL wywodzących się z klas TEM i SHV, które są wobec niego bardzo aktywne

• CTX - (cefotaxym - najlepszy wskaźnik ESBL wywodzących się z klasy CTX-M, które są wobec niego bardziej aktywne niż inne ESBL),

• AMC (amoksycylina-klawulonian - w centrum)

Krążki ułożone są w odległości 2 cm (25-30 mm) od siebie.

• wynik odczytujemy jako dodatni (obecne ESBL), jeśli strefa zahamowania wzrostu wokół krążka z ceftazidymem (lub cefotaksymem) rozszerza się też na rejon wokół krążka z połączeniem penicyliny i inhibitora (AMC - amoksycylina+klawulonian) - synergizm inhibicyjny

Rys. - test dwóch krążków:

- po lewej cefotaxym (30 mg), w środku - co-amoxyclav (amoksycylina + klawulonian, 20+10 mg), po prawej cetazydym (30 mg), krążki oddalone od siebie o 25-30 mm

- wynik: wysiany szczep wytwarza ESBL z klasy TEM, która jest bardzo aktywna wobec ceftazydymu, dlatego wokół krążka z ceftazydymem (po prawej) jest tylko niewielka strefa zahamowania wzrostu (w zasadzie tylko tam gdzie penetrował klawulonian ze środkowego krążka)

b) metoda :krążków kombinowanych” (combined disc method):

• porównuje się strefę zahamowania wzrostu wokół krążka z połączeniem cefalosporyny i inhibitora beta-laktamaz (kwas klawulanowy; jest to tzw. krążek „kombinowany”) ze strefą zahamowania wzrostu wokół krążka z samą cefalosporyną (bez inhibitora)

Powyższe metody mają największe znaczenie w detekcji ESBL u E. coli oraz Klebsiella spp. Nie są one natomiast miarodajne dla Enterobacter, Citrobacter ani Serratia, które są wyposażone w indukowalne beta-laktamazy AmpC, które mogą zostać indukowane przez kwas klawulanowy i całkowicie zaburzyć wynik testu.

2. β-laktamazy AmpC:

- gatunkowo specyficzne, występują u szczepów: Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Morganella, niektóre szczepy E. coli

- enzymy o bardzo szerokim spektrum: warunkują oporność na: aminopenicyliny, ureidopenicyliny, piperazynopenicyliny, cefalosporyny I-III generacji, monobaktamy, cefalosporyny o szerokim spektrum działania (cefamycyny)

- są niewrażliwe na działanie inhibitorów β-laktamaz

- geny tych enzymów znajdują się na chromosomie bakteryjnym - genoforze

- istnieją mutanty konstytutywnie wytwarzające β-laktamazy AmpC - określane są mianem szczepów zdereprymowanych

- leczenie: imipenem, meropenem

3. MBL - metalo β-laktamazy czyli karpapenemazy:

- metalozależne - kofaktorem jest przede wszystkim cynk

- są elementem naturalnej oporności na antybiotyki u Stenotrophomonas maltophila

- u Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter oraz Enterobacteriaceae (Serratia, Shigella, Klebsiella, Citrobacter itd.) są elementem oporności nabytej

- występują głównie u pałeczek niefermentujących

Wykrywanie MBL:

- CAZ, kwas 2-merkaptopropionowy

- IMP, EDTA (imipenem + EDTA)

- E-test

Kwas 2-merkaptopropionowy i EDTA są inhibitorami MBL, dlatego:

- pojawia się strefa przejaśnienia wokół krążka z ceftazidimem lub imipenemem od strony krążka zawierającego inhibitor

4. inne mechanizmy oporności

- mutacje

- aktywny efflux

ZUM:

- zakażenia dotyczące dolnego i/lub górnego odcinka układu moczowego

- zakażenia ograniczone do cewki moczowej nie zaliczają się do ZUM, należy do infekcji przenoszonych drogą płciową

Etiologia ZUM:

a) E. coli - najczęściej:

- 65-70% przypadków pozaszpitalnych

- 50% przypadków szpitalnych

b) Staphylococcus saprophyticus

c) inne:

- Enterococcus faecalis

- Klebsiella

- Proteus spp.

- Enterobacter spp.

- Acinetobacter spp.

- Pseudomonas spp.

- Candida albicans

- beztlenowce

- Streptococcus agalactiae

- Mycobacterium tuberculosis

- Serratia marcescens

- CNS

- Stenotrophomonas maltophila

Czynniki zjadliwości:

- zdolność do szybkiego namnażania się

- wytwarzanie ureazy

- zdolność do kolonizowania cewki

Droga zakażenia:

- zakażenie wstępujące

- zakażenie krwiopochodne

- zakażenie drogą limfatyczną

Rozpoznanie znamiennej bakteriurii zależy od:

- metody pobierania moczu

- wieku pacjenta

- czynnika etiologicznego

- postaci zakażenia

- czasu przebywania moczu w pęcherzu

Bakteriuria znamienna = ZUM rozpoznajemy, gdy stwierdzimy:

>1000 komórek bakterii (CFU) w 1 ml moczu ze środkowego strumienia + objawy kliniczne zapalenia pęcherza moczowego

>10 000 (10 000 - 50 000) komórek bakteryjnych w 1 ml moczu + objawy przy zakażeniu górnych dróg moczowych (odmiedniczkowego zapalenia nerek)!

- w moczu cewnikowanym powinno być mniej niż 100 komórek bakteryjnych w 1 ml moczu!!

- w moczu ze środkowego strumienia powinno być mniej niż 1000 komórek bakteryjnych w 1ml!!

Z materiałów z katedry:

- próba Goulda: wykrywa substancje hamujące wzrost bakterii w moczu

- zestaw lateks E. coli O157 - wykrywanie antygenu O szczepu O157 E. coli

- zestaw lateks EPEC

- API 20 E - zestaw do identyfikacji bakterii z rodzaju Enterobacteriaceae przy użyciu 23 zminiaturyzowanych, wystandaryzowanych prób biochemicznych; wykrywanie: deaminazy tryptofanu (TDA), indolu (JAMES), acetoiny (VP), azotynów (NIT), oksydazy (OX);

- CPS ID 2 - służy do ilościowego badania bakterii w moczu oraz do identyfikacji 3 rodzajów bakterii: E. coli (różowe do czerwonych lub niebieskie), Proteus (niebieski) i Enterococcus (brunatny); odczynniki DMACA (R1) i chlorek żelaza (R2) pozwalające wykryć odpowiednio: indol i deaminazę tryptofanu (TDA)

7

---