Elektroforeza DNA plazmidowego w żelu agarozowym. Transformacja komórek drożdży S. cerevisiae DNA plazmidowym.

Część teoretyczna:

ELEKTROFOREZA - WĘDRÓWKA W ŻELU.

Elektroforeza - technika stosowana przy rozdziale, analizie i oczyszczaniu kwasów nukleinowych i białek.

DNA i RNA mają ładunek ujemny i zgodnie z tym ładunkiem, nadawanym przez reszty fosforanowe, migrują w polu elektrycznym w kierunku anody. Szybkość migracji zależy od wielkości i kształtu cząsteczki.

Schemat postępowania jest następujący: żel ulega zestaleniu w formie cienkiej płytki na podstawce tzw. saneczkach wraz z zanurzonym specjalnego typu grzebieniem, który wyznacza „kieszonki”. W zastygłym żelu znajduje się szereg dołków, do których wprowadzane są próbki DNA oraz z reguły tzw. standard czyli mieszanina cząsteczek DNA o znanych masach (np. pochodzące z faga λ po trawieniu), dzięki czemu możliwa jest kalibracja żelu. Przed naniesieniem na żel próbki muszą być odpowiednio przygotowane: dodawany jest barwnik, który informuje nas później jak daleko zaszły najszybsze cząsteczki (co jest niezbędne, ponieważ migrujące DNA w żelu jest niewidoczne) oraz związek interkalujący DNA, czyli wbudowujący się do wnętrza cząsteczki - bromek etydyny, który fluoryzuje w świetle UV co pozwala nam na zlokalizowanie prążków.

Minimalna ilość DNA, którą widać na żelu w postaci prążka to 20 ng. Ilość DNA w prążku nie powinna przekraczać 200 ng ponieważ obserwuje się przeładowanie kieszonki. Żel umieszczony zostaje w specjalnym aparacie do elektroforezy i zalewany buforem przewodzącym prąd (np. TBE). Podłączony zostaje do zasilacza generującego prąd o stałym i określonym napięciu i natężeniu. Jakość rozdziału fragmentów DNA zmniejsza się w miarę zwiększania napięcia w czasie elektroforezy. Dla otrzymania optymalnej jakości stosuje się napięcie nie większe niż 5V na 1cm długości żelu.

Kalibracja wielkości fragmentów cząsteczek w żelu opiera się na zasadzie, że liniowe cząsteczki DNA migrują w żelu agarozowym z prędkością odwrotnie proporcjonalną do logarytmu dziesiętnego ich masy cząsteczkowej wyrażonej w Daltonach lub w tysiącach par zasad czyli kb. Kalibracja żelu polega na wykreśleniu krzywej zależności odległości przebytej w czasie elektroforezy przez poszczególne fragmenty od logarytmu masy cząsteczkowej.

Elektroforezę można przeprowadzać w żelach natywnych lub denaturujących.

1. Żele agarozowe.

Metoda szybka, prosta, powszechnie stosowana. Zdolność rozdzielcza zależy od wielkości porów w żelu, których rozmiary są zdeterminowane przez stężenie agarozy. Żeli bardziej stężonych tj. 1,4-2,0 % używa się do rozdziału cząsteczek mniejszych (0,5-2,0 kb). Żele mniej stężone 0,5-0,7 % stosuje się do rozdziału cząsteczek większych (10-20 kb i więcej).

Zaletą może być niekiedy fakt, że podczas elektroforezy możliwe jest rozdzielenie cząsteczek o tej samej wielkości ale zróżnicowanych pod względem kształtu. Doskonałym przykładem jest rozdział trzech różnych form plazmidu : CCC (ang. covalently closed circle), liniowej i OC (ang. open circle). Pierwsza najszybciej wędruje w żelu, druga nieco wolniej, trzecia najwolniej.

Przykładowy rozdział markera O'GeneRuler™ 100bp DNA Ladder #SM1153

Parametry rozdziału: Stężenie procentowe żelu -1.7% Objętość barwnika nanoszonego na ścieżkę - 0.5µg Długość żelu - 8cm Stosowany bufor - 1X TBE Natężenie prądu - 5V/cm Czas rozdziału - 1.5h

2. Żele akrylamidowe.

Powstają przez polimeryzacje monomerów akrylamidu w długie łańcuchy z wytworzeniem wiązań poprzecznych przez bisakrylamid. Można regulować sieciowanie poprzez manipulację proporcjami stężeń akrylamidu do bisakrylamidu. Do zajścia reakcji niezbędna jest obecność odpowiedniego katalizatora (PERS - nadsiarczan potasowy) i związku inicjującego reakcję (TEMED). Żele te stosuje się przy rozdziale fragmentów o wielkości od kilku par zasad (20% poliakrylamid) do tysiąca par zasad (3% poliakrylamid), a także przy rozdziale jednoniciowych cząsteczek DNA np. do sekwencjonowania.

3. Żele denaturujące.

Ponieważ szybkość migracji w żelu jednoniciowych cząsteczek, zależy nie tylko od ich wielkości i ładunku ale także w dużym stopniu od ich struktury przestrzennej (w przypadku dwuniciowych cząsteczek DNA nie ma to większego znaczenia) aby dokładnie określić ich wielkość należy weliminować różnice w szybkości migracji wywołane różną konformacją cząsteczki. Jest to szczególnie ważne w przypadku jednoniciowego RNA, które tworzy miejscowe struktury dwuniciowe. W tym właśnie celu stosuje się żele denaturujące agarozowe lub poliakrylamidowe. Najczęściej używanymi czynnikami denaturującymi są: formaldehyd i glioksal w żelach agarozowych (przy analizie preparatów RNA) lub mocznik w żelach poliakrylamidowych (przy analizie jednoniciowych fragmentów DNA).

4. Elektroforeza w polu pulsacyjnym.

Stosowana do rozdzielenia dużych cząsteczek DNA - od 2*10⁴ do 10⁷ bp czyli od 20 kb do 10 Mb. Można w ten sposób rozdzielić całe chromosomy np. drożdżowe. Pole elektryczne jest włączane i wyłączane w krótkich odstępach czasu. Kiedy pole elektryczne jest włączone, cząsteczki migrują zgodnie ze swoją wielkością, a gdy zostaje wyłączone, mają tendencję do relaksacji i zwijania w przypadkowe pętle. Czas wymagany do relaksacji jest wprost proporcjonalny do długości cząsteczki. Następnie kierunek pola elektrycznego jest zmieniany o 90 lub 180 stopni w stosunku do poprzedniego. Dłuższe cząsteczki zaczynają poruszać się wolniej niż krótsze. Powtarzające się zmiany kierunku pola stopniowo powodują rozdzielenie.

Źródło: http://zguw.ibb.waw.pl/~knbm/bmwi/podrek/lab/lab5.html

RESTRYKTAZY - tną DNA tworząc powtarzalny komplet fragmentów.

Restryktazy (inaczej enzymy restrykcyjne, endonukleazy restrykcyjne) - to enzymy izolowane z bakterii, zdolne do rozpoznawania specyficznych sekwencji w DNA (z reguły są to sekwencje palindromowe) i do przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA w ściśle określonym miejscu, w obrębie lub okolicy sekwencji rozpoznawanej. Otrzymywane fragmenty DNA nie są losowe, a w każdym prążku na żelu znajdują się cząsteczki DNA o identycznej sekwencji nukleotydowej. Z reguły różne enzymy rozpoznają odmienne sekwencje DNA. Istnieją jednak wyjątki - tzw. izoschizomery - enzymy izolowane z różnych organizmów, ale rozpoznające te same sekwencje. Zdarza się także, że dwa enzymy wytwarzają takie same lepkie końce, mimo rozpoznawania różnych sekwencji DNA. Umożliwia to klonowanie DNA strawionego jednym enzymem w wektorze strawionym innym, dającym takie same lepkie końce.

Nazewnictwo opiera się na literowych skrótach, w których pierwsza litera pochodzi od rodzaju bakterii, a druga i trzecia od gatunku. Następna litera oznacza szczep lub typ, a kolejne enzymy z danego szczepu lub typu otrzymują litery rzymskie.

Podział restryktaz według rodzaju wytwarzanych końców :

• tępe końce - nici rozcięte naprzeciwko siebie (w osi symetrii rozpoznawanej sekwencji) - wszystkie nukleotydy są sparowane z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnym łańcuchu

• lepkie końce - 3' lub 5' ssDNA (jednoniciowe) ogony na obu końcach utworzone przez niesymetryczne cięcie, komplementarne do podobnych tworzonych w innych cząsteczkach DNA przez te same enzymy restrykcyjne niezależnie od źródła DNA, co pozwala na ligowanie DNA nawet bardzo różniących się gatunków czyli formowanie chimerycznych molekuł.

Modyfikacje końców :

• tępych, poprzez dołączenie adaptorów (krótkich fragmentów DNA zakończonych z jednej strony na tępo z drugiej na lepko, specyficznie dla danej restryktazy) lub linkerów (krótkich fragmentów DNA zawierających określone miejsce restrykcyjne, zakończonych na tępo), przed dołączeniem tych ostatnich należy zmetylować genomowy DNA odpowiednią metylazą a po ligacji strawić DNA daną restryktazą uzyskując lepkie końce

• lepkich, które mają cofniętą nić 3'. Można je wypełnić przy pomocy fragmentu Klenowa polimerazy DNA E.coli i kompletu nukleotydów.

• lepkich, które mają cofniętą nić 5'. Można je wytępić obcinając wysunięty jednoniciowy odcinek DNA przy użyciu nukleazy S1 lub polimerazy I E.coli wykorzystując jej aktywność egzonukleolityczną 3'(R)5'.

Podział restryktaz według sekwencji rozpoznawanej :

• czwórkowe, rozpoznają sekwencję DNA złożoną z czterech nukleotydów. Statystycznie w dowolnym DNA takich miejsc jest dużo - co 256 bp. Restryktazy takie mogą strawić DNA na bardzo małe kawałki.

• szóstkowe, rozpoznają sekwencję DNA złożoną z sześciu nukleotydów. Dowolne miejsce restrykcyjne złożone z sześciu nukleotydów występuje statystycznie co około 4096 bp w DNA, w którym ilości poszczególnych nukleotydów są równe. Proporcje te zmieniają się w zależności od organizmu, dlatego dobór enzymu szóstkowego i warunki należy ustalić eksperymentalnie.

• ósemkowe, stosowane niezbyt często. Tną DNA bardzo rzadko.

• dłuższe, stosowane wyjątkowo rzadko.

Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi

• przeprowadza się zwykle przy stężeniu 0,05 - 0,5 μg DNA/μl

• należy zastosować bufor odpowiedni dla danego enzymu, najlepiej ten zalecany przez producenta (bufory najczęściej przygotowane są w postaci 10-krotnie stężonych roztworów)

• jeśli DNA ma być strawiony dwoma enzymami wymagającymi różnych buforów, należy najpierw przeprowadzić trawienie w buforze o niższym stężeniu soli, a następnie podwyższyć stężenie soli w mieszaninie reakcyjnej poprzez dodanie odpowiedniej objętości stężonego roztworu NaCl

• ilość enzymu jaką należy wziąć do reakcji oblicza się korzystając z następującej definicji: 1 jednostka enzymu trawi kompletnie 1μg DNA faga λ (ok. 50 kb) w czasie 1 godz.

• nie należy dodawać więcej enzymu niż 1/10 objętości mieszaniny reakcyjnej. Glicerol obecny w preparatach enzymów może bowiem hamować aktywność enzymu lub zmieniać jego specyficzność

• niektóre enzymy mają dodatkowe aktywności, pojawiające się w pewnych warunkach trawienia, określane jako aktywność „star”. Informacje o takiej aktywności podawane są przez producentów tych enzymów

• przy sporządzaniu mieszaniny reakcyjnej enzym dodaje się na końcu

• należy bezwzględnie pamiętać, że enzymy muszą być trzymane w temperaturze -20°C, a więc pobyt enzymu poza zamrażarką powinien trwać krótko. Po użyciu enzymy należy natychmiast odstawić na miejsce

• trawienie można zatrzymać przez dodanie EDTA, grzanie przez 10-15 min. W temp. 65-70°C lub ekstrakcję fenolem. Należy pamiętać, że niektóre enzymy są termostabilne i nie ulegają termicznej inaktywacji (należy to sprawdzić w katalogu).

Zastosowania :

• Konstrukcja map restrykcyjnych. Analizując w żelach produkty trawienia danego DNA różnymi enzymami restrykcyjnymi, stosowanymi pojedynczo, w kombinacjach oraz w ilościach wystarczających lub niewystarczających do pełnego strawienia preparatu, można ustalić wzajemne położenie i odległości pomiędzy sekwencjami rozpoznawanymi przez te enzymy. Mapa restrykcyjna to obraz cząsteczki DNA, na którym zaznaczone są miejsca rozpoznawane przez różne enzymy restrykcyjne z uwzględnieniem odległości między nimi wyrażonej w nukleotydach.

• Klonowanie i obróbka DNA. DNA pocięty enzymami restrykcyjnymi można poddawać ligacji z wektorem. W ten sposób tworzone są zrekombinowane plazmidy czyli plazmidy zawierające sklonowany DNA, który można później poddawać różnym manipulacjom przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych.

• Badanie polimorfizmu miejsc restrykcyjnych (RFLP).

Źródło: http://zguw.ibb.waw.pl/~knbm/bmwi/podrek/biotech/biotech2.html

Opracowanie: dr Maria Kowalczuk

Część praktyczna:

1. Omówienie kolokwium.

2. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym

Przygotowanie elektroforezy

1. Przygotować 100 ml 0,8 % żelu agarozowego poprzez rozpuszczenie 800 mg agarozy w 100 ml 1x TBE (UWAGA! agaroza rozpuszcza się po podgrzaniu!!!)

2. Do roztworu dodać 2l bromku etydyny UWAGA!!! MUTAGEN!!!

3. Roztwór agarozy wylać do uprzednio przygotowanej foremki, i poczekać do momentu zestalenia się agarozy.

4. Foremkę z żelem umieścić w aparacie do elektroforezy i zalać buforem 1X TBE.

5. Przygotować próbki DNA do naniesienia na żel; do Eppendorfki dodać:

4l DNA

6 l wody

2 l barwnika

6. Próbki nanieść na żel.

Elektroforezę prowadzić przez ~ 30 min przy natężeniu 120V

Bufor 10X TBE: 100,8g TRIS, 59g kw. borny, 9,35g EDTA

BROMEK ETYDYNY (bromek 5-etylowy-3,6-diamino-6-fenylofenantrydyny)

1. Silny mutagen wiążący się z DNA.

2. Karcynogen!!!

3. Łatwo wchłaniany przez ukł. oddechowy, skórę , niebezpieczny dla oczu.

PAMIĘTAJ!!!

Przy pracy z czynnikami szkodliwymi należy zachować środki szczególnej ostrożności!!!

Należy pracować w fartuchu ochronnym i rękawicach ochronnych.

3. Transformacja komórek drożdży S. cerevisiae DNA plazmidowym.

Szczep drożdży: US50-18c ura3 his1

Plazmid: pFL44L (URA3; AMP) lub pFL38 (URA3; AMP, CEN)

Tok doświadczenia:

1. Zwirować 3 ml 24 godz. hodowli komórek drożdży (3000obr/min; 5min)

2. Odlać podłoże a osad komórek zawiesić w 500l 0.1M octanu litu.

3. Zawiesinę komórek ponownie odwirować jak w pkt. 1, osad komórek zawiesić w 50 l 0.1M octanu litu.

4. Do tak przygotowanej zawiesiny komórek dodać:

UWAGA! Kolejność bardzo ważna!

240 l 50% PEG 4000

36 l 1M octan litu

2-8 l DNA plazmidowego

całość dokładnie zawiesić pipetą.

5. Mieszninę inkubować 30 min w 30°C a następnie zamieszać i szybko przenieść do łaźni wodnej o temp. 42°C i inkubować 15 min (szok termiczny).

6. Mieszninę komórek odwirować (5000 obr./min), supernatant odrzucić a osad komórek zawiesić w 150 l wody i wysiać (rozgłaskać) na płytki z podłożem GO-ura.

7. Płytki inkubować w 30°C przez 3-5 dni.

3

---