`

Biologia ogólna komórki

Wiadomości z zakresu

1. Organelle komórkowe

2. Funkcje organelli komórkowych

Należy powtórzyć z podręczników podanych na końcu tego rozdziału

Informacja genetyczna (jądrowa i mitochondrialna)

1. Budowa chromatyny

2. Budowa genów

3. Replikacja DNA

4. Regulacja transkrypcji

5. Translacja i regulacja

Wszystkie organizmy eukariotyczne mają struktury, które nazywamy chromosomami. Znajdują się one w jądrze komórkowym. Chromosomy bezjądrowych komórek prokariotycznych zbudowane są natomiast z pojedynczej, kolistej cząsteczki DNA i zawierają niewielką ilość związanych z nimi białek. Struktura ta nazywana jest genoforem, a u bakterii nukleoidem. Każdy chromosom bakteryjny ma jedno miejsce początku replikacji DNA nazywane ORI. Chromosomy komórek eukariotycznych zawierają długą, liniową cząsteczkę DNA, której długość zależy od gatunku i która bywa tysiące razy większa od genomu bakteryjnego. Liczba chromosomów w komórce zależy od gatunku. U człowieka jest ich 46. DNA w każdym chromosomie jest pojedynczą cząsteczką liniową o długości kilku centymetrów. Stosunek długości nici DNA w chromosomie do długości chromosomu metafazowego wynosi prawie 3x10⁶ : 1. DNA jest ok. 3 mln razy dłuższy od chromosomów. Jednostką długości DNA jest para zasad (pz),1000 pz to kpz (kilo pz), a 1000000 pz to Mpz (Mega pz). Cały DNA musi być upakowany w jądrze komórkowym. Odbywa się to dzięki strukturze chromatyny, którą tworzy wysoce uporządkowany kompleks DNA - białko. Struktura ta jest zdolna do zmiany stopnia skondensowania zależnie od etapów cyklu komórkowego. Ponad 50% masy chromatyny stanowi białko. Większość białek chromatyny to białka zasadowe, zwane histonami. Pozostałe białka mają charakter kwaśny. Oba typy białek odgrywają ważna rolę w budowie i funkcji chromatyny.

Histony są małymi białkami o masie od 10 do 20 kilodaltonów (kDa); ich sucha masa jest prawie równa masie DNA w chromatynie. Charakteryzują się one dużą zawartością aminokwasów zasadowych, głównie lizyny i argininy. Mają ładunek dodatni, dzięki któremu mogą silnie wiązać się z ujemnie naładowanym DNA w chromatynie.

Znanych jest 5 typów histonów, z których 4, a mianowicie H2A, H2B, H3 i H4 tworzą rdzeń histonowy, a H1 wiąże rdzeń z wolnym odcinkiem DNA między rdzeniami. Sekwencja aminokwasów w histonach rdzeniowych jest wysoce konserwatywna, co dowodzi ich kluczowej roli oraz, że nie zmieniły się zasadniczo w czasie ewolucji (Ryc. 1).

Chromatyna

Podstawową jednostką składową chromatyny jest nukleosom (Ryc. 2). Składa się on z histonowego rdzenia, wokół którego jest nawinięta nić DNA. Natomiast rdzeń zbudowany jest z 2 dysków ułożonych równolegle, a każdy dysk zawiera po jednej cząsteczce histonów H2A, H2B, H3 i H4; powstaje w ten sposób układ oktamerowy. Helisa DNA biegnie wzdłuż krawędzi dysków. Cały ten kompleks spina histon H1 położony na zewnątrz nukleosomu (Ryc. 3). Z rdzeniem nukleosomu jest połączonych 146 par zasad (pz) DNA, a długość łącznika między nukleosomami jest zmienna gatunkowo i u człowieka wynosi 60 pz DNA. Całkowita długość przypadająca na jeden nukleosom wynosi zatem około 200 pz DNA. Histon H1 z rdzeniem nukleosomu określa się jako chromatosom, zaś jego wpływ na zwijanie się łańcucha pojedynczych nukleosomów w strukturę helisy powoduje przyjęcie kształtu określonego mianem solenoidu, którego średnica wynosi 30 nm (Ryc. 4). W mikroskopie elektronowym widoczny jest on jako włókno chromatynowe, zbudowane z helisy wyższego rzędu, w której na jeden skręt przypada 6 nukleosomów.

Dalsze upakowanie chromatyny wewnątrz jądra występuje w czasie podziału komórki. Najwyższy stopień kondensacji osiągają chromosomy w metafazie podziału mitotycznego (Ryc. 5). Włókna chromatynowe są wtedy połączone z chromosomowym szkieletem, który zbudowany jest głównie z niehistonowych białek jądrowych. Rejonem łącznikowym ze szkieletem chromosomu (SAR) jest odcinek DNA o długości kilkuset par zasad (kpz) z przewagą adeniny i tyminy. Odcinki DNA między sąsiadującymi SAR tworzą pętlę o różnej długości i szerokości ok. 300 nm.

Niehistonowe białka jądrowe uczestniczą w różnych etapach funkcjonowania chromatyny wraz z regulacją ekspresji genów, w której główną rolę odgrywają czynniki transkrypcyjne. Nie wszystkie obszary chromatyny biorą równocześnie udział w procesie transkrypcji genów. Część chromatyny, zwana heterochromatyną, jest nieaktywna transkrypcyjnie, zaś chromatyna aktywnie transkrybowana nazywana jest euchromatyną. W mikroskopie świetlnym po wybarwieniu heterochromatyna widoczna jest jako ciemne miejsca, a euchromatyna jest jaśniejsza. Część chromatyny pozostaje heterochromatyczna we wszystkich tkankach i przez wszystkie stadia rozwoju komórki. Taka chromatyna to heterochromatyna konstytutywna i jej barwienie wykorzystywane jest w metodzie cytogenetycznej zwanej barwieniem prążków C i ujawnia się w chromosomach metafazowych. Przykładem tej chromatyny może być długie ramię ludzkiego chromosomu Y. Fragmenty chromatyny, które mogą występować w postaci hetero- i euchromatynowej tworzą tzw. heterochromatynę fakultatywną. Przykładem chromatyny fakultatywnej jest nieaktywny transkrypcyjnie jeden z chromosomów X, zwany także ciałkiem Barra, który uaktywnia się jedynie w czasie gametogenezy.

Euchromatyna jest regionem w którym zachodzi transkrypcja, jednak nie jest ona homogenna. Oznacza to, że znajdują się w niej regiony częściowo nieaktywne, składające się z pętli chromosomowych upakowanych we włókna 30 nm oraz regiony, w których geny są aktywnie transkrybowane (stanowią one około 10% chromatyny). Regiony te są bardziej wrażliwe na DNazę I, która jest endonukleazą hydrolizującą wolny DNA.

W komórkach ssaków sygnałem do przyjęcia odpowiedniego poziomu upakowania chromosomu w miejscach gdzie występują geny ulegające ekspresji, jest metylacja sąsiadujących ze sobą par cytozyny i guaniny (CpG). U ssaków zwykle miejsca CpG są metylowane, bo rzadko występują one w całym genomie. Metylowane sekwencje CpG mogą łatwo mutować do TpG z powodu spontanicznej deaminacji 5-metylo-cytozyny do tyminy. Metylacja CpG jest związana z transkrypcyjnie nieaktywnymi rejonami chromatyny. W genomie występują jednak nie metylowane wyspy CpG o długości ok. 2000 pz i są one wiązane z regionami szczególnie wrażliwymi na DNazę I. Wyspy otaczają regiony promotorowe genów ulegających ekspresji we wszystkich typach komórek.

Inaczej niż chromosomy eukariotyczne zbudowany jest chromosom bakteryjny, zwany nukleoidem. Zawiera on białkowy rdzeń od którego promieniście rozchodzą się pętle superhelikalnego DNA. Dzięki enzymom zwanym topoizomerazy, które regulują upakowanie DNA, czyli powstawanie dodatkowych skrętów i likwidację naprężeń w podwójnej helisie, genofor przyjmuje bardziej zwartą formę. Skręcenie superhelikalne może być dodatnie, gdy po przecięciu nici jest ona zwijana w tym samym kierunku lub negatywne, gdy skręcenie nici zachodzi w odwrotnym kierunku.

Geny eukariota i prokariota

Podstawową jednostką informacji genetycznej, odpowiadającą określonemu segmentowi DNA, kodującego aminokwasową sekwencję polipeptydu jest gen. W sensie fizycznym jest to odcinek DNA o określonej sekwencji zasad azotowych nukleotydów. Wielkość genów jest w granicach od mniej niż 100 do kilku mln pz (np. gen dystrofijny - 2.500 mln pz ). Komórki człowieka zawierają około 30 000 genów w 23 chromosomach. Geny zajmują zawsze te same miejsca czyli loci w tych samych chromosomach. Są one rozproszone i oddzielone długimi sekwencjami repetywnego, niekodującego DNA, zwanymi intergenowymi odcinkami. Taki intergenowy odcinek DNA może być bardzo długi. Geny również zawierają sekwencje niekodujące, zwane intronami. Introny rozdzielają sekwencje kodujące genu, które noszą nazwę eksonów. Geny podzielone intronami nazywamy genami podzielonymi, a informacja jest w nich zapisana w sposób nieciągły. Introny zwykle stanowią większość sekwencji całego genu, a ich liczba i wielkość jest różna w różnych genach. Są one usuwane z transkryptów RNA w procesie splicingu czyli potranskrypcyjnego składania RNA. U człowieka sekwencje genowe to zaledwie 5% całkowitego DNA. Niektóre geny mają kopie, które w swoich sekwencjach nagromadziły błędy (w wyniku licznych delecji, braku odcinków promotorowych i regulatorowych) uniemożliwiające syntezę białek. Kopie takie nazywamy pseudogenami, których przykładem są relikty oryginalnych genów globinowych. Z pojęciem genu ściśle wiążą się określenia używane w praktyce takie jak:

Muton - podstawowa jednostka mutacji genowej (obejmuje parę nukleotydów w

obrębie genu)

Rekon - najmniejsza jednostka odpowiadająca pojedynczemu nukleotydowi DNA,

która może ulec wymianie

Replikon - jednostka replikacji

Cistron - jednostka funkcjonalna genu

Niektóre geny są zorganizowane w postaci zespołów genów: operony i rodziny wielogenowe. Pojęcie operonu, wprowadzone przez Jacob'a i Monod'a oznacza zespół genów występujących u bakterii. Zawierają one geny regulowane w skoordynowany sposób i kodują białka, których funkcje są ściśle powiązane. W komórkach eukariotycznych operonom odpowiadają rodziny wielogenowe. Geny w rodzinach są identyczne lub bardzo podobne i nie są regulowane w skoordynowany sposób. Rodziny wielogenowe mogą być proste lub złożone. Proste rodziny zawierają identyczne geny takie jak gen rybosomowego 5s RNA, którego produkty są wymagane w dużych ilościach. W jednej komórce może być około 2.000 kopii jednego genu. Złożone rodziny wielogenowe zawierają geny podobne takie jak globinowe, które kodują białka o pokrewnych funkcjach.

Inaczej niż w Eukariota wszystkie geny bakteryjne znajdują się w jednym genoforze oprócz kilku, które są w małej kolistej cząsteczce DNA zwanej plazmidem. Organizacja genów prokariotycznych najlepiej została opisana u E. coli (pałeczka okrężnicy). Bakteria ta ma około 2.800 genów o łącznej długości 4,6 mln pz DNA. Geny w większości są zorganizowane w operony. Stanowią one 75% sekwencji DNA, a 25% to DNA międzygenowy o ważnych funkcjach takich jak miejsce startu replikacji ORI. U bakterii nie występują introny. Plazmidy zawierają geny odpowiedzialne za istotne cechy takie jak płodność, oporność na leki, itd. Większość genów występuje u bakterii w jednej kopii. Wyjątek stanowią geny rybosomowego RNA, które są zorganizowane w 7 operonach.

Pewne sekwencje DNA mają zdolność przemieszczania się w genomie i wykorzystują do tego rekombinacje. Te sekwencje to transpozony, które zawierają enzym transpozazę, katalizującą ich przemieszczanie. Transpozony są sekwencjami insercyjnymi; na obu końcach mają krótkie odwrócone powtórzenia sekwencji. Gdy te sekwencje przenoszą się, sekwencja gospodarza w tym miejscu ulega duplikacji. Transpozony powodują też mutacje insercyjne genów.

Organizacja i przekazywanie informacji genetycznej

Nośnikiem informacji genetycznej są więc kwasy nukleinowe, przede wszystkim DNA i RNA. DNA występujący w jądrze komórkowym przekazuje za pośrednictwem RNA informację genetyczną do cytoplazmy, gdzie podlega ona ekspresji. Fakt, że nośnikiem informacji jest kwas nukleinowy udowodnili w swoich doświadczeniach liczni naukowcy, do grona których należą: Gryffith (1928), O.T. Avery, C. M. Mac Leod i M. Mac Carty (1944), A.D. Hershey i M. Chas (1952) oraz J. D. Watson i F. Crick (1953). Tym ostatnim zawdzięczamy również model struktury dwuniciowej kwasu dezoksyrybonukleinowgo (DNA) i sposób replikacji jego cząsteczek.

Aby dany związek mógł być nośnikiem informacji genetycznej musi spełniać następujące warunki:

1. podlegać replikacji -samopowielaniu

2. kodować informację potrzebną do funkcjonowania organizmu.

DNA jest polinukleotydem zbudowanym z dwóch ułożonych przeciwrównolegle i owijających się wokół siebie łańcuchów zbudowanych z nukleotydów, tworzących tzw. podwójny heliks. Każdy nukleotyd (deoksyrybonukleotyd) zbudowany jest z zasady azotowej ( A-adeniny, T-tyminy, G-guaniny, C-cytozyna) połączonej wiązaniem N-glikozydowym z pierścieniem pentozowym cukru (deoksyryboza), do którego przyłączona jest reszta fosforanowa. Rdzeń cząsteczki DNA stanowi cukrowo-fosforanowa część, natomiast zasady azotowe skierowane są do wnętrza helisy i układają się jedna nad drugą (Ryc. 6). Dwuniciowa helisa na ogół jest prawoskrętna (B-forma). W warunkach fizjologicznych w komórkach eukariotycznych mogą istnieć inne jej formy, a mianowicie: A oraz lewoskrętna Z. Średnica heliksu wynosi 2 nm, długości skoku 3,4 nm, a odległość między parami zasad 3,4 Å. Na jeden obrót heliksu przypada 10,5 par zasad dla formy B, 11 dla formy A i 12 dla formy Z. Struktura DNA jest utrzymywana wiązaniami wodorowymi między zasadami dwóch przeciwległych łańcuchów. Zasady te tworzą komplementarne pary, to znaczy adenina występuje zawsze w parze z tyminą, połączona dwoma mostkami wodorowymi, a guanina wiąże się trzema mostkami wodorowymi z cytozyną. W łańcuchu polinukleotydowym deoksyrybonukleotydy połączone są ze sobą wiązaniami fosfodiestrowymi między atomem C5 jednej reszty cukrowej, a atomem C3 sąsiedniej reszty cukrowej.

Na powierzchni heliksu DNA przebiegają dwie równoległe bruzdy zwane rowkami: dużym i małym, stanowiące miejsce oddziaływań DNA z białkami. Łańcuchy polinukleotydowe w DNA ułożone są antyrównolegle tzn., biegną w przeciwnych kierunkach oznaczonych jako 5'3', i 3'5'. Zapis informacji genetycznej zaczyna się od końca 5'. Jedna nić może być wykorzystana do replikacji drugiej. Stanowi to mechanizm zachowania informacji genetycznej i jej przekazywania komórkom potomnym. Przedstawiony tu model „podwójnej helisy” DNA dominuje w jądrze komórek eukariotycznych. W naturze występuje także w komórkach DNA kolisty dwuniciowy, którego komplementarne nici połączone są wiązaniem 5' 3' w kolistą formę. Oznacza to, że cząsteczka taka pozbawiona jest wolnych końców, a obydwie nici są splecione ze sobą. Większość naturalnie występującego DNA wykazuje ujemne skręty superhelisy, co oznacza częściowe rozplecenie dwuniciowej helisy DNA. Ma to miejsce także w przypadku liniowego DNA (u Eukariota), który oddziałując z białkami szkieletu jądrowego tworzy duże pętle. DNA kolisty występuje w komórkach bakteryjnych, w plazmidach oraz w wirusach DNA. W komórkach eukariotycznych jest obecny w mitochondriach i chloroplastach.

Stopień super zwinięcia cząsteczek DNA regulują enzymy zwane topoizomerazy. W celu zmniejszenia naprężeń w niciach DNA enzymy te przecinają jedną lub obie jego nici najczęściej w rdzeniu cukrowo-fosforanowym, odcinając resztę fosforanową, a przyłączając się do jednego z końców DNA poprzez wiązanie fosfotyrozynowe. Znane są dwie klasy topoizomeraz. Topoizomerazy I - przecinają jedną nić DNA i zmieniają liczbę opleceń o ±1. Topoizomerazy II - wymagające hydrolizy ATP do przecięcia dwóch nici zmieniają liczbę opleceń o ±2. Topoizomerazy występują u wszystkich organizmów.

Replikacja

Zachowanie informacji genetycznej i jej przekazywanie komórkom potomnym zachodzi w procesie zwanym replikacją, zgodnie z mechanizmem zaproponowanym przez Watson'a i Crick'a w 1953 roku, który mimo iż jest stale poznawany to i tak jego szczegóły nie do końca są znane. Każda nić dwuniciowej helisy DNA zawiera tą samą informację, ponieważ sekwencja ich zasad jest komplementarna. Podczas replikacji dwie nici rodzicielskie rozplatają się i każda działa jako matryca do syntezy nowej, komplementarnej nici potomnej. Synteza ta odbywa się według zasady parowania: A z T i G z C. Jest to mechanizm semikonserwatywnej replikacji DNA, który został opisany przez Meselsona i Stahla w 1958 roku. Wszystkie cząsteczki DNA replikują się w ten sam sposób. Nici matrycy są czytane w kierunku 3'  5' natomiast nowe są syntetyzowane w kierunku 5'  3' (Ryc.7).

Substratami do syntezy DNA są: 5' - trifosforany deoksyrybonukleozydów (dNTP - dATP, dGTP, dCTP i dTTP. Mechanizm reakcji polega na ataku grupy 3'-OH nukleotydu z końca 3' nici podlegającej wydłużaniu na atom fosforu α w dNTP komplementarnym do następnej zasady w matrycy. Towarzyszy temu uwolnienie pirofosforanu. Energia do polimeryzacji pochodzi częściowo z hydrolizy dNTP i częściowo z uwolnionego pirofosforanu.

Za jednostkę replikacji (replikon) przyjęto odcinek DNA, który zawiera miejsce inicjacji replikacji ( „ori” - origin u bakterii, obejmujący odcinek o dł. ok. 100 pz ) oraz sekwencje do niego przylegające, które są pod jego kontrolą i replikują się razem z nim. Replikon może zawierać też miejsce terminacji replikacji. Replikacja jest kontrolowana tylko na poziomie inicjacji tzn. przebiega do zakończenia syntezy całego replikonu. W komórkach prokariotycznych replikon obejmuje cały genofor, albowiem występujące w nim tylko jedno miejsce inicjacji kontroluje replikację całego genomu. W komórkach eukariotycznych miejsc inicjacji jest wiele i dlatego jest wiele replikonów. Komórka ssaka zawiera od 30 tys. do 100 tys. replikonów o wielkości od 20 do 40 kpz. Wszystkie miejsca inicjacji mają sekwencje bogate w pary AT, w których następuje początkowe rozplecenie nici. Mimo iż replikony eukariotyczne są relatywnie małe, a szybkość syntezy DNA w chromosomach jest 1 do 2 razy mniejsza niż u bakterii, to szybkość replikacji całego genomu jest wielokrotnie większa.

Miejsce, w którym zachodzi rozdzielenie nici i synteza nowego DNA nazywane jest widełkami replikacyjnymi. Obie nici matrycowe zorientowane względem siebie w przeciwnych kierunkach są kopiowane w obrębie tych samych widełek jednocześnie (Ryc. 8). Jedna z powstałych nowych nici DNA jest wydłużana w sposób ciągły (tak jak przesuwają się widełki), druga natomiast jest syntetyzowana w kierunku przeciwnym w postaci krótkich fragmentów Okazaki o długości 1.000 do 2.000 pz. Są one następnie łączone przez ligazę w ciągłą nić. Nić syntetyzowana w sposób ciągły 5'3' nosi nazwę nici wiodącej, a nić syntetyzowana w sposób nieciągły zwana jest nicią opóźnioną lub następczą. Jej synteza przebiega ale z opóźnieniem w kierunku 5'3' „przeciwnym” do miejsca inicjacji, tworząc pierwszy fragment Okazaki. W rzeczywistości fizyczna orientacja syntezy obu nici jest taka sama ponieważ nić opóźniona jest zwinięta w pętlę i w widełkach replikacyjnych jest odwrócona o 180°. Badając dokładnie fragmenty Okazaki okazało się, że kilka pierwszych nukleotydów na ich końcu 5' to rybonukleotydy, podobnie jak kilka pierwszych na nici wiodącej. Synteza DNA rozpoczyna się od starterów RNA, do których polimerazy DNA dołączają kolejne trifosfonukleotydy. Za syntezę tych odcinków o dł. 10 pz odpowiedzialne są enzymy zwane primazy. Przed połączeniem fragmentów Okazaki startery RNA są usuwane przez enzym nukleazę, a powstające przerwy są wypełniane w drodze syntezy nici DNA.

Replikacja DNA u bakterii została najlepiej poznana u E. coli. Cykl replikacyjny przebiega tu wieloetapowo. Pierwszym z nich jest aktywowanie miejsca ori C. Dochodzi do zwinięcia całego odcinka DNA w dodatkowe lewoskrętne superzwoje potrzebne do otwarcia dwuniciowej struktury heliksu. W drugim etapie następuje związanie białka inicjatorowego DnaA sekwencją 9-nukleotydową DNA. Powstaje tzw. kompleks zamknięty. Przy pomocy białek chromatyny FIS i IHS oraz HU w obecności ATP, DNA owija się wokół białek DnaA powodując silne naprężenia. Doprowadza to w konsekwencji do zrywania wiązań wodorowych. Dzięki energii ATP i aktywności ATPazy, dochodzi do dalszego rozdzielania nici. Tworzy się kompleks otwarty, do którego przyłącza się helikaza replikacyjna, która dalej rozwija nić DNA w obie strony wypierając białko DnaA. Rozdzielone nici DNA są stabilizowane przez białka SSB. Dalej tworzy się „oczko” replikacyjne o wielkości 45-60 pz, które włącza primazę potrzebną do katalizowania syntezy starterowego RNA. Po inicjacji następuje elongacja. W inicjacji i elongacji wymagana jest obecność polimeraz DNA - poli DNA I, poli DNA II i poli DNA III.

Polimeraza I DNA, która jest równocześnie egzonukleazą usuwa odcinki starterowe z fragmentów Okazaki oraz wycina uszkodzone odcinki DNA w procesie naprawy. Ma ona zdolność do rozpoczynania replikacji w układzie in vitro z dwuniciowych matryc z jedną przerwą w łańcuchu. U E. coli występuje w ilości około 400 cząsteczek na komórkę i nie bierze udziału w elongacji łańcuchów dlatego nie jest replikazą.

Polimeraza II DNA występuje w liczbie 40 cząsteczek na komórkę, bierze udział w naprawie DNA i do swej aktywności wymaga obecności białek SSB i udziału ATP. Właściwą replikazą DNA w komórce bakteryjnej jest polimeraza III DNA, będąca holoenzymem (tzn. wymaga do swojej aktywności połączenia kilku jednostek). Występuje ona w liczbie 10 do 20 cząsteczek na komórkę. Posiada ona aktywność 15 razy większą niż poli I i aż 300 razy większą niż poli II. Rdzeń tego enzymu stanowią podjednostki ε i θ oraz α, która jest największą podjednostką o aktywności polimeryzującej. Podjednostka ε jest egzonukleazą kontrolującą, o kierunku syntezy 3'5'. Jest ona niezbędna do zachowania dokładności replikacji. Rola podjednostki θ jest nieznana. Z ważniejszych podjednostek występujących w komórce w nadmiarze jest podjednostka β. Jej rola polega na rozpoznaniu struktury starter - matryca, z którą się wiąże. Do niej dołączają się pozostałe składniki holoenzymu. Bierze też udział w przenoszeniu się holoenzymu na nowe miejsce matrycy.

Terminacja replikacji w komórce bakteryjnej znajduje się pod kontrolą dość specyficznego mechanizmu. Miejsce terminacji w kolistym DNA znajduje się naprzeciwko miejsca ori C w odcinku o długości około 800 par zasad. Występują tam 4 sekwencje nukleotydowe zwane ter, po dwa po obu stronach nici w tej samej odległości od osi symetrii. Sekwencje te są miejscami wiązania białka terminacyjnego tus, które blokuje replikację. Białko tus jest inhibitorem helikazy DnaB o kierunku działania 5' 3'. Po replikacji dwie cząsteczki są splecione. Za ich rozdzielenie odpowiedzialny jest enzym topoizomeraza II katalizująca pęknięcie w obu niciach jednej cząsteczki DNA. Następnie topoizomeraza II łączy ponownie ze sobą końce pękniętych nici. Działająca wcześniej topoizomeraza I powoduje przejściowe pęknięcie jednej nici DNA w pobliskiej odległości przed widełkami replikacyjnymi, a także usuwa superskręty.

W komórkach eukariotycznych replikacja DNA zachodzi podczas fazy S cyklu komórkowego. Wejście w fazę S jest regulowane przez cykliny i kinazy białkowe zależne od cyklin (CDK), które są kolejno aktywowane przez sygnały wzrostu z zewnątrz. Niektóre z CDK fosforylują i aktywują białka, które są potrzebne do uaktywniania miejsc inicjacji replikacji. Replikony w komórkach eukariotycznych są inicjowane w zespołach (tandemowych grupach) powodując równoczesną inicjację replikacji około 20-50 replikonów. W pierwszej kolejności ulegają replikacji odcinki euchromatyny, zawierające transkrypcyjnie aktywny DNA, a następnie w późnej fazie S jest replikowana heterochromatyna. Na końcu jest replikowany DNA tworzący centromery i telomery.

Inicjacja replikacji każdego replikonu w komórkach ssaków może następować w losowo wybranych miejscach leżących w obrębie strefy inicjacji o długości kilku tysięcy par zasad (kpz) i stanowi część rozproszonych sekwencji powtórzonych w obszarach międzygenowych. Replikony eukariotyczne mogą ulegać inicjacji tylko raz w jednym cyklu komórkowym, ponieważ do inicjacji jest bezwzględnie potrzebny białkowy czynnik ograniczający. Białko to ulega asocjacji z materiałem genetycznym dopiero po rozpuszczeniu się otoczki jądrowej. Istniejąca otoczka jądrowa wyklucza wniknięcie do jądra nowych cząsteczek czynnika ograniczającego. Wydaje się, że białka struktury chromatyny blokują dostęp białek inicjacyjnych do DNA. Dlatego nazywane są represorami replikacji. Białka struktur jądrowych powodują natomiast rozluźnienie struktury chromatyny w tym obszarze. Umożliwia to przyłączenie się białek inicjacyjnych i otwarcie „oczka” replikacyjnego. Przed skopiowaniem DNA w widełkach replikacyjnych nić DNA musi zostać odwinięta z nukleosomów. Powoduje to opóźnienie w przesuwaniu się widełek replikacyjnych do około 50 pz na sekundę. Po przejściu widełek replikacyjnych nowe nukleosomy zostają odtworzone z mieszaniny starych i nowo syntetyzowanych histonów.

Do rozdzielenia nici DNA potrzebne są enzymy helikazy DNA, oraz białko replikacyjne A (RP-A), wiążące jednoniciowy DNA. W fazie S poza podwojeniem DNA zostaje również podwojona ilość histonów.

W komórkach eukariotycznych czy prokariotycznych? replikony nie mają sekwencji terminalnych. Replikacja każdego replikonu kończy się z chwilą zetknięcia się widełek podążających ku sobie z przeciwnych kierunków. Inaczej wygląda moment zakończenia syntezy chromosomu eukariotycznego zbudowanego z liniowych cząsteczek DNA, zakończonych telomerami, czyli setkami tysięcy kopii, nieinformacyjnej sekwencji np. TTAGGG z końcem 3' wystającym poza koniec 5'. Telomery, otoczone białkami fragmenty DNA, pełnią rolę „skuwek”, dzięki którym chromosomy unikają uszkodzenia. Z każdym podziałem komórki telomery stają się coraz krótsze, a komórka traci zdolność do dalszych podziałów. Ale enzym telomeraza potrafi przedłużać telomery .Telomeraza zawiera krótką cząsteczkę RNA, której kolejność zasad jest komplementarna do powtarzających się sekwencji w telomerach. RNA jest więc matrycą do syntezy powtórzeń tych sekwencji na wystającym końcu 3'. Synteza ta przebiega w powtarzających się cyklach wydłużania i translokacji. Nić komplementarna jest syntetyzowana jako nić opóźniona. W komórkach somatycznych organizmów wielokomórkowych telomeraza jest nieaktywna. Występuje jedynie w komórkach płciowych i macierzystych. Gdy skracanie telomerów dociera do obszarów DNA informacyjnych, komórki starzeją się i umierają. Hamowanie telomerazy nie występuje w komórkach rakowych. Mechanizm tego zjawiska jest nieznany. Jego konsekwencją jest „nieśmiertelność” komórek rakowych, prowadząca do zwiększonej zdolności proliferacyjnej poza kontrolą organizmu i tkanek.

Transkrypcja

Informacja biologiczna, która zapisana jest w sekwencji zasad, jest wykorzystana przez komórkę według głównego dogmatu Cricka tzn. przepływie informacji od DNA do RNA i do białka w wyniku transkrypcji i translacji.

_{transkrypcja translacja}

_{DNA RNA białko}

_{odwrotna transkrypcja}

Według tego dogmatu przepływ informacji jest jednokierunkowy. Jednak w przypadku retro wirusów, gdzie materiałem genetycznym jest RNA, przepisanie informacji może odbywać z RNA na DNA dzięki enzymowi odwrotnej transkryptazie.

Ekspresja informacji biologicznej zawartej w genach podlega ścisłej regulacji, tzn. nie wszystkie geny ulegają jednocześnie ekspresji, ale w różnych rodzajach komórek są aktywne różne geny. Regulacja odbywa się poprzez odcinek sekwencji DNA zawierającej elementy regulatorowe i promotor. Promotor znajduje się zwykle przed sekwencją kodującą. Polimeraza RNA i inne białka (czynniki transkrypcyjne) rozpoznają zachowawcze sekwencje promotora i wiążą się z nimi co prowadzi do syntezy RNA. Ekspresja genów w komórce zależy od sekwencji promotora i jego zdolności do wiązania polimerazy RNA i czynników transkrypcyjnych do obszarów regulatorowych.

Informację zawiera tylko jedna z dwóch nici helisy DNA zwana matrycową. Służy ona do syntezy komplementarnej cząsteczki RNA, która jest matrycą do syntezy polipeptydu.

Sekwencja nukleotydów w częściach kodujących genu jest współliniowa z sekwencją aminokwasów w polipeptydzie. Aminokwasy są kodowane przez 64 triplety zasad zwane kodonami. Są one odpowiedzialne za wprowadzenie 20 aminokwasów do polipeptydów. Dla większości aminokwasów oprócz metioniny i tryptofanu kodowanie odbywa się kilkoma kodonami. Ta cecha kodu genetycznego, określana również jako jego degeneracja, przypuszczalnie minimalizuje efekty mutacji. Kodony odpowiadające za wprowadzenie tych samych aminokwasów nazywamy synonimami. Różnią się one zwykle trzecią, czasami także drugą zasadą w triplecie. Kod genetyczny jest powszechny i wszystkie organizmy wykorzystują jednakowe kodony z wyjątkiem genów mitochondrialnych.

Kodonem inicjującym translację jest AUG, kodujący metioninę, zaś kodony UAG, UGA i UAA są kodonami stop, kończącymi translację. Z dowolnej sekwencji nukleotydów rozpoczynając od zasady początkowej kodonu można odczytać trzy zestawy kodonów, które są określane każdy z osobna jako ramka odczytu. Ramka odczytu zawarta pomiędzy kodonami start i stop to tak zwana otwarta ramką odczytu (ang. Open Reading Frame - ORF). W programach sekwencjonowania genomów ORF wykorzystuje się do identyfikacji sekwencji DNA kodujących białko (Ryc 9).

Pierwszym etapem ekspresji genów jest transkrypcja polegająca na syntezie RNA na matrycy DNA przez polimerazę RNA. Powstały mRNA ma taką samą sekwencję zasad jak nić DNA kodująca. Synteza RNA przebiega w kierunku 5'3', odwrotnym niż ułożenie matrycy 3'5' i obejmuje polimeryzację trifosforanów rybonukleozydów (ATP, GTP, UTP, CTP). Transkrypcja przebiega w trzech etapach. Rozpoczyna ją inicjacja, po której następuje elongacja, a kończy terminacja.

U Prokariota synteza wszystkich rodzajów RNA przebiega przy udziale jednej polimerazy RNA zbudowanej z kilku podjednostek. U E. coli występuje 5 podjednostek: 2α, 1β, 1β', 1σ tworzących holoenzym. Inicjacja transkrypcji u E. coli rozpoczyna się od sekwencji zasad promotora do którego przyłącza się polimeraza RNA. Dwa typy sekwencji są rozpoznawane przez polimerazę E. coli. Są to sekwencje -10 i -35 zorganizowane jako kasety. Podjednostka σ wiąże się z kasetą -35. Po związaniu się enzymu z promotorem powstaje najpierw zamknięty kompleks promotorowy. Enzym wiąże się z DNA na odcinku ok. 60 pz. Aby rozpoczęła się transkrypcja dwuniciowa helisa ulega dysocjacji w rejonie kasety -10 bogatej w pary AT, tworząc otwarty kompleks promotorowy. Podjednostka σ oddysocjowuje od tego kompleksu pozostawiając rdzeń enzymu. Powstałe dwa pierwsze rybonukleotydy wiążą się z DNA tworząc pierwsze wiązanie fosfodiestrowe (Ryc. 10).

Podczas elongacji polimeraza RNA przesuwa się wzdłuż DNA zrywając wiązania wodorowe między zasadami, co powoduje rozplecenie dwuniciowej helisy. Enzym dołącza rybonukleotydy do końca 3' rosnącego łańcucha RNA. Najpierw transkrypcji ulega sekwencja liderowa (wiodąca) o różnej długości, a dopiero po niej sekwencja kodująca genu. Podczas transkrypcji rozpleceniu ulega tylko niewielki odcinek 2-niciowej helisy o dł. 12-17 pz. Na dł. 12 zasad rosnący RNA jest sparowany z nicią matrycową rozplecionego odcinka DNA. W miarę wydłużania się RNA jego rejon 5' końcowy oddziela się od matrycy by umożliwić odtworzenie się 2-niciowej helisy DNA.

Również terminacja zachodzi w określonych miejscach znajdujących się w pewnej odległości za sekwencją kodującą genu. U E. coli działają sekwencje palindromowe. Charakteryzują się one symetrią wyrażającą się tym, że pierwsza ich połowa jest komplementarna do drugiej. W 1-niciowej cząsteczce RNA umożliwia to tworzenie się komplementarnych par zasad między dwoma następującymi po sobie odcinkami łańcucha tworząc strukturę typu spinki RNA. Struktura ta zwana też nasada - pętla działa jako sygnał terminacji. Polimeraza RNA zatrzymuje się za strukturą spinki, a występujące za nią pary AU, potrzebne są do odłączenia się transkryptu od matrycy. U Prokariota działa też inny mechanizm, polegający na zrywaniu par zasad przez białko rho. W tym czasie uwolniona zostaje polimeraza, która ponownie może łączyć się z podjednostką σ.

U Eukariota w transkrypcji uczestniczą trzy polimerazy RNA, I, II i III. Polimeraza RNA II transkrybuje geny kodujące białko. Aby polimeraza ta mogła związać się z promotorem, muszą występować sekwencje promotorowe w formie kasety TATA. Element ten ma sekwencję zgodną 5' TATA (A/T) a (A/T) 3' położoną w odległości ok. - 25 pz od miejsca startu transkrypcji. Przy łączeniu enzymu towarzyszą czynniki transkrypcyjne TFIIA i B itd., które wiążą się z DNA w pobliżu kasety TATA i tworzą rodzaj platformy, z którą łączy się polimeraza II RNA. Czynniki te przyłączają się do promotora w określonym porządku: pierwszy TFIID, potem TFIIA i B. Następnie przyłącza się polimeraza II RNA a za nią TFIIF, E, H i J tworząc funkcjonalny kompleks inicjujący transkrypcję. Przy braku kasety TATA w genach, do inicjacji transkrypcji dochodzi w miejscach gdzie geny zawierają sekwencje bogate w GC znajdujące się w odległości 100-200 pz przed miejscem startu transkrypcji. Znane są też kasety CCAAAT (kat) występujące przed kasetą TATA lub sekwencje wzmacniające, stymulujące transkrypcję. Położone są one poza miejscem promotorowym. Podobnie ulokowane są sekwencje wyciszające, które hamują transkrypcję.

Sygnały warunkujące terminację nie są dobrze poznane. Przypuszczalnie następuje ona w bliżej nie znanym miejscu za końcem sekwencji kodującej białko.

Polimeraza I RNA transkrybuje 3 z 4 genów kodujących rybosomowe RNA (18S, 28S, 58S rRNA). Promotor zawiera element rdzeniowy pokrywający się częściowo z miejscem startu transkrypcji oraz element kontrolny w odległości około 100 pz przed miejscem startu. Sekwencje te wraz z czynnikami transkrypcyjnymi TFI wiążą polimerazę I RNA. Pierwszy element promotora w ogóle umożliwia transkrypcję, drugi stymuluje jej szybkość i inicjację. Sygnałem terminacji jest sekwencja zgodna o długości 18 pz znajdująca się w odległości 600 pz za końcem genu.

Polimeraza III RNA transkrybuje geny kodujące transportujący RNA i 5S rRNA. Promotory tych genów znajdują się w obrębie sekwencji kodujących geny około 100 nukleotydów za miejscem startu i nazywane są wewnętrznymi regionami kontroli (ICR).

Gen 5S rRNA zawiera kasetę C i położoną przed nią kasetę A. Są to miejsca wiązania polimerazy oraz czynników transkrypcyjnych. W genach tRNA ICR występuje w postaci kasety A i B. Terminacja następuje w miejscu DNA gdzie dominuje ciąg reszt A tzw. Ogon poli A w niewielkiej odległości od końca genu.

Ostatnio, uczonym z Howard Hughes Medical Institute (Science 2003 ) udało się opisać rolę jednego z transkrypcyjnych czynników elongacyjnych współdziałających z polimerazą IIRNA. Czynnik ten o nazwie FACT jest białkowym kompleksem złożonym z dwóch podjednostek : spt16 i SSRP1. W trakcie transkrypcji rozluźnia on chromatynę poprzez zmianę struktury nukleosomów. FACT może w sposób odwracalny wiązać się dimerem histonowym H2A - H2B oraz tetrametrem H3-H4, osłabiając ich wzajemne interakcje.

mRNA powstaje w jądrze na drodze transkrypcji genów kodujących białka katalizowane przez polimerazę II RNA. Początkowo tworzy się transkrypt zwany pre-mRNA. Populację różnych pre-mRNA nazywamy heterogennym jądrowym RNA (hnRNA). Tak zwane „dojrzewanie” eukariotycznego hnRNP zachodzi poprzez związanie się hnRNA ze swoistymi białkami. Obejmuje ono cztery etapy: „kapowanie” końca 5' (czapeczka), cięcie i poliadenylacja końca 3', splicing oraz metylację.

Transkrypt hnRNA łączy się z białkami budując kompleks hnRNPA-U. Białka A, B, C występują w dwóch formach dając trzy kopie różnych tetramerów. Przyjmuje się, że białka wchodzące w skład hnRNP pomagają hnRNA w utrzymaniu 1-niciowej formy oraz uczestniczą w różnorodnych reakcjach dojrzewania RNA. W jądrze komórek eukariotycznych jest wiele bogatych w uracyl cząsteczek suRNA transkrybowanych przez poli II RNA, które wspólnie ze swoistymi białkami tworzą suRNP. Cząsteczki te biorą udział w splicingu oraz metylacji miejsc w pre rRNA.

Składanie RNA (splicing) polega na usuwaniu intronów z pre-mRNA (Ryc. 11 i 12). Na końcach intronów występują sekwencje GU (koniec 5') i AG (koniec 3'), które są sygnałem miejsc splicingowych 5' i 3'. Inna sekwencja sygnałowa 5' CURAY3' określana jako punkt rozgałęzienia, zlokalizowana jest w odległości 10-40 nukleotydów przed sekwencją sygnałową 3'. Splicing przebiega w dwóch etapach. W pierwszym, grupa 2' hydroksylowa adeniny znajdująca się w punkcie rozgałęzienia atakuje wiązanie fosfodiestrowe znajdujące się po stronie 5'G sekwencji GU. Wiązanie ulega zerwaniu a uwolniony koniec 5' intronu zostaje połączony z grupą 2'-OH reszty A w miejscu rozgałęzienia, a intron tworzy strukturę przypominający lasso. W drugim etapie zostaje zerwane wiązanie za G w sekwencji AG po stronie 3' intronu, intron zostaje usunięty a dwie sekwencje eksonowe ulegają połączeniu. Splicing katalizują jądrowe rybonukleoproteiny. Jedna z nich suRNP - U₁ wiąże się z miejscem 5', a druga suRNP- U₂ z miejscem rozgałęzienia. Pozostałe czynniki U₅, U₄/U₆ suRNP tworzą z U₁ i U₂ kompleks powodujący wypętlenie intronu i zbliżenie końców eksonów. Cały kompleks pre-mRNA i suRNP jest określany mianem spliceosomu. Również kompleks ten odpowiedzialny jest za sfałdowanie i przyjęcie przez pre-mRNA odpowiedniej komformacji do przebiegu składania. Po zakończeniu splicingu kompleks ulega dysocjacji.

Końce 5' eukariotycznego mRNA podlegają zmianie obejmującej syntezę czapeczki czyli kapowanie końca 5' poprzez przyłączenie, zanim jeszcze RNA osiągnie długość 20-30 nukleotydów (nt) zmodyfikowanego nukleotydu 7-metyloguanozyny. Czapeczka (kap) jest przyłączona do pre-mRNA w obecności enzymu guanylotransferazy, który łączy GTP z pierwszym nukleotydem mRNA poprzez wiązanie 5'- 5' trifosforanowe. Następnie enzym metylotransferaza łączy grupę metylową z azotem 7 pierścienia guaniny oraz z grupami hydroksylowymi reszt rybozy następnych dwóch nukleotydów. Blokowanie końca 5' chroni mRNA przed egzonukleazą i przez to stabilizuje transkrypt. Struktura czapeczki jest sygnałem dla rybosomu o początku cząsteczki mRNA.

Dojrzały koniec 3' pre mRNA powstaje w wyniku odcięcia, a następnie dodania około 250 reszt A, głównie adenylowych, dlatego zwanego poliadenylacją, która wymaga obecności odpowiednich sekwencji sygnałowych w pre-m RNA.

Sygnałami tymi są: sekwencja sygnałowa poliadenylacji 5' AAUAAA3' występująca w pobliżu końca 3' pre mRNA, sekwencja YA znajdująca się w odległości 11-120 zasad za sygnałem poliadenylacji oraz poniżej sygnału sekwencja bogata w GU. Sekwencje te są rozpoznawane i wiązane przez szereg białek, tworzących kompleks, który rozcina pre mRNA w odległości ok. 20 nt za sekw. 5'AAUAAA3'. Dalej poli A polimeraza przyłącza nukleotydy adenylowe do końca 3' cząsteczki RNA. Podobnie jak kap poli A chroni mRNA przed egzonukleazami 3'.

Ostatnim etapem dojrzewania, któremu podlega wiele cząsteczk pre mRNA jest metylacja określonych zasad. Najczęściej jest to modyfikacja reszt A w pozycji N6 jeżeli występują one w sekwencji 5' - RRACX- 3'.

W porównaniu z rRNA i tRNA, mRNA jest stosunkowo niestabilny, co umożliwia komórkom regulację poziomu białek przez zmiany szybkości transkrypcji genów. Prokariotyczny mRNA ma znacznie krótszy okres półtrwania (kilka minut u bakterii) niż mRNA komórek eukariotycznych (6 godzin).

Dojrzewanie RNA może także odbywać się poprzez tzw. redagowanie, które polega na tym, że sekwencja nukleotydowa pierwotnego transkryptu jest zmieniona w określonych miejscach poprzez zamianę, insercję lub delecję zasad,wytwarzając białko o krótszym łańcuchu. Przykładem genu produkującego w 2 wersjach białko apo B jest gen apolipoproteiny B redagowany na poziomie RNA. Białko to występuje na powierzchni lipoprotein krwi człowieka i jest wykorzystywane do transportu cholesterolu z jelit do wątroby. Zmiana nukleotydu C w U powoduje powstanie kodonu nonsensownego i zakończenie translacji. Zamiast białka apo B 100 powstaje mniejsze białko apo B 48. W rzeczywistości więc mamy więcej hnRNA niż mRNA oraz kilka różnych wersji białka kodowanego przez ten gen.

Translacja

Translacja przebiega podobnie u Prokariota i Eukariota. Wymaga ona dostarczenia energii z hydrolizy ATP i GTP, a także udziału cząsteczek tRNA dostarczających aminokwasy do rybosomów oraz obecności enzymów i czynników inicjujących i terminujacych. Translacja zachodzi na rybosomach w obrębie siateczki wewnątrzplazmatycznej. Składa się ona z trzech etapów. W etapie inicjacji powstaje kompleks rybosomów z mRNA. Podczas elongacji dostarczane są aminokwasy i tworzone wiązania peptydowe oraz następuje translokacja rybosomu wzdłuż mRNA. Ostatni etap - terminacja polega na uwalnianiu łańcucha polipeptydowego.

Podczas translacji informacja zakodowana w cząsteczce mRNA zostaje wykorzystana do ustalenia kolejności aminokwasów w białku. Kluczową rolę pełnią cząsteczki tRNA, których jest od 31 do 40 rodzajów. Dostarczają one do rybosomu aminokwasy w kolejności wyznaczonej przez sekwencję trójnukleotydową mRNA. Kilka rodzajów tRNA (izoakceptory) może wiązać ten sam aminokwas. Przed rozpoczęciem translacji aminokwasy zostają połączone kowalencyjnie ze specyficznymi tRNA w reakcji aminoacylacji. Połączenie następuje z ramieniem akceptorowym tRNA o sekwencji 5`CCA3' a grupą karboksylową aminokwasu. Obecna przy tym musi być syntetaza aminoacylo tRNA, a reakcja ta wymaga energii z hydrolizy ATP. Transportujący RNA z przyłączonym prawidłowo aminokwasem rozpoznaje kodon mRNA kodujący ten aminokwas. Rozpoznanie kodonu przez tRNA odbywa się poprzez pętlę antykodonową tRNA (3 kolejne nukleotydy antykodonu). Obowiązuje tu zasada komplementarności kodon-antykodon. 61 kodonów koduje 20 aminokwasów, a 3 trójki są kodonami stop, w sumie występują 64 kodony.

Inicjacja rozpoczyna się od związania małej podjednostki rybosomowej z mRNA (UP-30S, UE-40S) (Ryc. 13). Pierwszym kodonem mRNA jest AUG (u Prokariota może być również GUG, UUG), który koduje metioninę i inicjuje translację. Mała podjednostka rybosomu wiąże się z mRNA powyżej kodonu AUG. U Eukariota mała podjednostka rozpoznaje strukture czapeczki na 5' końcu mRNA i przesuwa się aż do miejsca AUG. Dalej przyłącza się tRNA z metioniną w wyniku czego powstaje kompleks inicjujący.

W inicjacji biorą udział także inicjujące czynniki białkowe. U bakterii występują trzy takie czynniki: IF1, IF2 i IF3. IF1 i IF3 łączą się z podjednostką 30S rybosomu i blokują wtedy łączenie dużej podjednostki z małą. IF2 po związaniu się z GTP przyłącza f-MettRNA do budującego się kompleksu inicjującego. U Eukariota w inicjacji uczestniczy 9 czynników; eIF1 i eIF2 pełnią podobne role jak IF1 i IF2 zaś pozostałe odpowiedzialne są za rozplatanie II-rzędowej struktury mRNA.

Elongacja u Prokariota rozpoczyna się wiązaniem dużej podjednostki 50S z kompleksem inicjującym (Ryc. 14). Powoduje to uwolnienie IF1 i IF2 oraz hydrolizę GTP. Kompletny rybosom ma dwa miejsca wiązania dla cząsteczki tRNA. Pierwsze, to miejsce P (peptydylowe- zajęte przez tRNA MET, drugie miejsce to miejsce A (aminoacylowe- obejmuje drugi kodon mRNA). W momencie zajęcia miejsca A przez aminoacylo tRNA i parowanie jego antykodonu z drugim z kolei kodonem mRNA etap elongacji został rozpoczęty. Przy zajęciu równoczesnym dwóch miejsc, aminokwasy przyłączone do tRNA wiążą się wiązaniem peptydowym w reakcji katalizowanej przez enzym peptydylotransferaza. W elongacji biorą udział dodatkowe białka. U Prokariota są to dwa czynniki elongacyjne: EF-Tu i EF-Ts. Pierwszy z nich wiąże aminoacylo tRNA z miejscem A, który po hydrolizie GTP uwalniany jest w formie związanej z difosforanem guanozyny od rybosomu. Zostaje on zregenerowany przez EF-Ts. U Eukariota eEF1 pełni podobną rolę jak EF-Tu. Po powstaniu wiązania peptydowego rybosom ulega translokacji do następnego kodonu a dipeptyd związany z tRNA przesuwa się do miejsca P wypierając inicjatorowy tRNA. Nowy aminoacylo tRNA zajmuje miejsce A i cykl elongacji zostaje powtórzony. U Prokariota za translokację jest odpowiedzialny czynnik EF-G u Eukariota funkcję tę pełni eEF2.

Podczas translacji rybosom przesuwa się wzdłuż mRNA oddalając się od miejsca inicjacji translacji, a wolna sekwencja może związać kolejny rybosom. Jedna cząsteczka mRNA może ulegać translacji prowadzonej przez kilka rybosomów. Kompleks taki tworzy strukturę polisomu. Zakończenie translacji ma miejsce wtedy gdy kodon stop znajdzie się w miejscu A. Z miejscem tym wiąże się czynnik terminacyjny. Dla Prokariota są to RF1, 2 i 3, a dla Eukariota jest to eRF. Powodują one uwolnienie kompletnego polipeptydu. Po terminacji rybosom rozpada się na podjednostki, a mRNA jest uwolniony (Ryc. 15).

Regulacja ekspresji genów u Prokariota.

Komórka bakteryjna w danej chwili uruchamia tylko te geny, w których produkty potrzebne są do jej funkcjonowania. Potrafi więc regulować aktywność swoich genów. Może zmieniać ilość wytwarzanego produktu genu poprzez: a) zmianę tempa transkrypcji, b) okres półtrwania mRNA i c) zmianę wydajności translacji. Z tych trzech mechanizmów najlepiej poznano zmianę tempa transkrypcji.

Geny bakterii są zorganizowane w jednostki zwane operonami, które kodują białka powiązane funkcjonalnie. Wyróżniono dwa typy operonów: indukowany, zwany również katabolicznym i represyjny, zwany anabolicznym. Operony kataboliczne kodują enzymy związane ze szlakami katabolicznymi, a ich induktorem jest substrat danego szlaku. Przykładem takiego operonu jest operon laktozowy. Drugi typ operonu koduje enzymy związane z torami biosyntezy (anabolicznymi), gdzie ekspresja genów tego operonu jest regulowana przez produkt końcowy lub przez atenuację.

Operon laktozowy E. coli jest najlepiej poznanym operonem. Zawiera trzy geny Z,Y,A kodujące enzymy: permeazy laktozowej, β-galaktozydazy i transacetylazy β-galaktozydazowej, niezbędne do przyswojenia i metabolizowania laktozy. Przy obecności laktozy w komórce ich ilość zwiększa się. Geny te leżą za promotorem, który nimi kieruje, a ich ekspresja ulega indukcji w obecności laktozy. Są one wspólnie transkrybowane w postaci jednej cząsteczki mRNA. Inny gen regulatorowy znajduje się przed operonem i koduje on białko hamujące (represor), które ma powinowactwo do operatora (Ryc. 16). Jeśli laktoza jest obecna w środowisku, allolaktoza (induktor) wiąże się z represorem lac uniemożliwiając mu związanie się z operatorem i tym samym dopuszcza do transkrypcji operonu. Jeśli zaś laktoza zostanie całkowicie wykorzystana represor odzyskuje zdolność do wiązania się z operatorem, a transkrypcja zostaje zahamowana. Z promotorem związana jest polimeraza RNA, której droga jest zablokowana lub odblokowana w zależności od wiązania represora lub braku wiązania z operatorem. Ten mechanizm regulacyjny pozwala komórce E. coli wyłączyć operon lac w obecności glukozy. Białko aktywujące geny kataboliczne CAP, wiąże cAMP i stymuluje transkrypcję operonu wiążąc się z DNA przed promotorem lac. Poziom cAMP w komórce jest regulowany przez glukozę, która hamuje aktywność cyklazy adenylowej. Jeśli glukoza znajduje się w komórce to poziom cAMP jest niski a CAP nie może związać się z promotorem i operon jest transkrybowany z bardzo niską wydajnością. Jeśli poziom glukozy w komórce spadnie, to poziom cAMP wzrasta i CAP wiąże się w pobliżu promotora stymulując transkrypcję operonu. Represja kataboliczna umożliwia komórce priorytetowe wykorzystanie glukozy jako źródła energii przy równoczesnym występowaniu glukozy i laktozy (Ryc. 17).

Przykładem operonu anabolicznego jest operon tryptofanowy (trp). Zawiera on 5 genów znajdujących się pod kontrolą promotora. Geny te kodują enzymy niezbędne do biosyntezy tryptofanu. Represor tryptofanowy wiąże się z operatorem w obecności tryptofanu i blokuje transkrypcję operonu. Gdy w środowisku zabraknie tryptofanu represor nie jest w stanie związać się z operatorem; polimeraza RNA wiąże się z promotorem i transkrypcja jest aktywowana. Tryptofan, jako produkt końcowy działa jako korepresor i wspólnie z represorem blokują syntezę tryptofanu.

Nieco inna regulacja genów polega na wykorzystaniu mechanizmu atenuacji. Dotyczy on różnych operonów, także tryptofanowego. Sekwencje DNA znajdujące się między promotorem i pierwszym genem operonu są zdolne do tworzenia dwóch struktur. Pierwsza ma kształt spinki do włosów i nie wpływa na transkrypcję. Drugi rodzaj budowy to pętla terminująca która kończy transkrypcję.

W operonie trp. krótki rejon kodujący zawiera kodony tryptofanowe. Jeśli poziom tryptofanu w komórce jest wysoki to w bliskiej odległości za polimerazą RNA podąża rybosom, co uniemożliwia utworzenie struktury spinki do włosów ale powoduje powstanie pętli terminującej transkrypcję. Przy braku tryptofanu w komórce rybosom przesuwa się wolniej, polimeraza RNA przemieszcza się na DNA i tworzy się struktura spinki do włosów, polimeraza RNA kontynuuje transkrypcję operonu. O ile represor decyduje o włączeniu lub wyłączeniu ekspresji genów operonu, to atenuacja decyduje o efektywności transkrypcji, co pomaga komórce dopasować syntezę tryptofanu do potrzeb życiowych.

Bakteryjna polimeraza RNA zbudowana z 5 podjednostek zawiera czynnik σ odpowiedzialny za inicjację transkrypcji i rozpoznanie sekwencji nukleotydowych promotorów u bakterii. E. coli może syntetyzować alternatywne czynniki sigma, które rozpoznają różne zestawy promotorów. Do znanych czynników sigma należą sigma 70, czynnik termiczny, czynnik sporulacji u Bacillus subtilis, sigma bakteriofagów. Wszystkie te czynniki pojawiają się przy zmianie warunków środowiskowych.

Regulacja ekspresji genów u Eukariota

Regulacja ekspresji genów w komórkach eukariotycznych jest złożona (Ryc. 18). W pojedynczej komórce tylko 15% genów ulega ekspresji, nadając jej określone cechy i rolę w organizmie. Poznanie zasad regulacji ekspresji genów może uniemożliwić niekontrolowane podziały komórkowe, które towarzyszą rozwojowi komórek nowotworowych.

Komórki eukariotyczne kierują ekspresją swoich genów przede wszystkim przez zmianę szybkości transkrypcji, a co za tym idzie wydajnością. Może ona być bardzo różna. Geny białek, które występują w komórkach w dużej ilości są transkrybowane wydajniej niż geny białek występujące w małych ilościach. Regulacja ekspresji genów odbywa się poprzez czynniki transkrypcyjne, które wiążą się z sekwencjami promotorowymi genów. Wydajność inicjacji transkrypcji będzie zależeć od oddziaływań między tymi czynnikami, a krótkimi sekwencjami regulatorowymi w rejonie promotora. Gdy sekwencje regulatorowe obecne w rejonie promotora znajdują się na tej samej cząsteczce DNA co sekwencja kodująca, mówimy że są to sekwencje regulatorowe cis. Wydajność inicjacji transkrypcji jak i ilość wytwarzanego RNA, zależy od dodatkowych czynników transkrypcyjnych wiążących się z sekwencją DNA w rejonie promotora i oddziałujących z białkowym kompleksem TIC. Mogą one zwiększać lub zmniejszać wydajność transkrypcji. Do takich czynników zalicza się między innymi sekwencje zwane zgodnymi, które są miejscami wiązania czynników z sekwencjami promotorowymi. Czynniki transkrypcyjne są syntetyzowane w cytoplaźmie, a miejscem ich działania jest jądro - są to więc czynniki działające trans.

Wydajność transkrypcji genu może być regulowana poprzez sekwencje wzmacniające o długości od 100 do 200 pz, które mają zdolność wiązania czynników transkrypcyjnych i stymulacji transkrypcji genu. Oddziaływania między sekwencją wzmacniającą i promotorem zachodzą poprzez wypętlenie DNA oddzielającego te rejony powodując ich wzajemne zbliżenie.

Sekwencje wyciszające zmniejszają wydajność transkrypcji poprzez ograniczenie ekspresji w określonych typach komórek.

W genomach komórek eukariotycznych znajdują się też sekwencje określane jako elementy kontrolujące locus (odległe od genu), wpływające na wydajność ekspresji całych rodzin genów.

Ogólna wydajność transkrypcji zależy od zestawu czynników transkrpcyjnych związanych w rejonie promotora. Zdolność tych białek do tworzenia dimerów (homodimery) lub wiązania się z innymi czynnikami (heterodimery) wpływa dodatkowo na regulację ekspresji genetycznej.

Do grupy związków, które mogą zmienić właściwości komórki oraz jej funkcję poprzez aktywację transkrypcji specyficznych genów należy zaliczyć hormony i cytokiny.

Hormony steroidowe wiążą się z receptorem hormonu zlokalizowanym w cytoplaźmie. Receptor jest wówczas uwolniony od białka blokującego jego aktywność. Receptor ulega dimeryzacji i jest transportowany do jądra komórkowego, gdzie aktywuje transkrypcję docelowych genów poprzez wiązanie się z sekwencjami promotorowymi.

Inaczej działają hormony białkowe i cytokiny. Wiążą się bowiem z receptorami na powierzchni błony komórkowej komórki docelowej. Aktywacja genów jest indukowana przez proces zwany transdukcją sygnału, w którym kolejne białka tworzące kaskadę ulegają aktywacji najczęściej poprzez fosforylację. Wzbudzona kaskada stymuluje transkrypcję genów docelowych przez wiązanie czynników transkrypcyjnych z sekwencjami promotorowymi genów.

W ostatnich 10 latach odkryto i częściowo poznano kolejny mechanizm regulatorowy wykorzystujący zjawisko interferencji RNA. U nicienia C. elegans występuje regulatorowy RNA - siRNA (mały interferujący RNA). Prekursorem siRNA jest dsDNA (dwuniciowy). Może on powstać min. w czasie zaburzonej transkrypcji sekwencji kodującej. Stwierdzono, że użycie dsRNA wzmacniało efekt wyciszania kilkunastokrotnie w porównaniu z wyciszaniem przez jednoniciowy RNA sensowy lub antysensowy. Obecność podobnych cząsteczek w analogicznych procesach wyciszania ekspresji genu potwierdzono u wielu innych organizmów.

Drugi rodzaj regulatorowego RNA- miRNA również opisano u C. Elegans. Występowanie miRNA wykazano również u człowieka. Mikro RNA kodowane są przez geny, których transkrypt (krótki RNA) tworzy lokalną strukturę spinki do włosów. Opisano u człowieka ponad 250miRNA.

Regulatorowe RNA uczestniczą w procesach bardzo różnorodnych: od degradacji RNA i inhibicji translacji po metylację DNA, metylację histonów i zmiany struktury chromatyny.

Informacja genetyczna mitochondrialna

W komórkach eukariotycznych oprócz informacji jądrowej, DNA znajduje się także w mitochondriach, a w komórkach roślinnych również w chloroplastach. Organelle te przypominają dawne organizmy prokariotyczne, dlatego przyjmuje się że zostały wchłonięte do prymitywnych organizmów eukariotycznych i żyją z nimi w symbiozie. Genom mitochondrialny przypomina w budowie genom bakteryjny.

DNA mitochondrialny jest cząsteczką kolistą, o wielkości 16,6 kpz (u człowieka), a u drożdży ok. 80 kpz; roślinne mają rozmiar 1M pz. Posiada on własne geny rybosomowe i przenośnikowe w ilości ok. 20. Geny zawarte w mitochondriach są dziedziczone tylko ze strony matki (dziedziczenie mateczne). Dziedziczenie cytoplazmatyczne występuje również u roślin i drożdży.

Mutacje mitochondrialnego DNA mogą leżeć u podstaw oporności na antybiotyki stwierdzone w hodowlach komórek zwierzęcych, a niektóre choroby u ludzi dziedziczone matecznie są efektem mutacji mitochondrialnego DNA tak jak na przykład w dziedziczonej atrofii wzroku Lebera. Jest ono wtórne do mutacji jednego z genów kodujących podjednostkę kompleksu I w łańcuchu oddechowym transportującym elektrony. Zespół ten charakteryzuje zanik nerwu wzrokowego, okresowe zaburzenia ruchowe i nieprawidłowości w EKG. W tym przypadku geny jądrowe oddziałują na ekspresję uszkodzonych genów mitochondrialnych. Akumulacja uszkodzeń mtDNA może odgrywać rolę w procesach starzenia się.

Tempo mutacji zwierzęcego mitochondrialnego DNA jest znacznie wyższe od tempa mutacji DNA jądrowego, ale mimo to mitochondria poszczególnych osobników nie wykazują zmienności (homoplasmia). W oocytach znajduje się niewiele mitochondrów. Matczyny sposób dziedziczenia zapewnia więc homoplasmię w tkankach somatycznych potomstwa. Natomiast tempo mutacji roślinnego mt DNA jest wolniejsze.

Zakłada się, po zbadaniu sekwencji mt DNA we współczesnej populacji ludzkiej, że rodzaj ludzki pochodzi od pojedynczej kobiety, która żyła ok. 200 tys. lat temu.

1. Podstawy biologii komórki: Wprowadzenie do biologii molekularnej. B. Alberts, Wyd. Naukowe PWN, 1999. Wyd. 1 i wyd. późniejsze.

2. Biochemia, L. Stryer, Wyd. Naukowe PWN, Warszawa 2000 i wyd. późniejsze.

3. Genetyka. Friedman J. i wsp.: Wyd. Urban Partner wyd. II Wrocław 2000 i wyd. późniejsze.

14

---