Olak Ewelina

Pluta Anna

Rembowska Aleksandra

Biotechnologia, B-1

Laboratorium z biotechnologii

Ćwiczenie 2

Temat:

Biosynteza α - amylazy bakteryjnej hodowli wstrząsanej.

Data wykonania ćwiczenia: 10.03.2009 r.

1. Wstęp teoretyczny

Skrobia ma budowę łańcucha α - glikozydowego. W czasie hydrolizy rozpada się na cząsteczki glukozy, które są homopolimerami zwanymi glukozanami lub glukanami.

Dwoma głównymi składnikami skrobi są:

• amyloza

• amylopektyna

Amyloza nie ma rozgałęzień i jest zbudowana jest z reszt glukozy połączonych wiązaniami α - 1,4 - glikozydowymi.

Amylopektyna jest rozgałęzioną formą skrobi, w której na jedno wiązanie α -1,6-glikozydowe przypada około trzydzieści wiązań α-1,4-glikozydowych. Amylopektyna charakteryzuje się mniejszym stopniem rozgałęzienie niż glikogen.

Zarówno amylopektyna, jak i amyloza są szybko hydrolizowane przez α - amylazę.

Skrobia jest najważniejszym źródłem węglowodanów w pożywieniu i znajduje się kaszach, ziemniakach, roślinach strączkowych i innych warzywach.

2. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest poznanie zasad prowadzenia hodowli wstrząsanej oraz zbadanie wpływu wybranego parametru (składu pożywki) dla rozwoju drobnoustrojów.

3. Materiał i metodyka

1. Materiał biologiczny

Stosujemy szczep Bacillus licheniformis wyhodowany w Instytucie Biochemii Technicznej Politechniki Łódzkiej. Szczep, uprzednio przechowywany na skosach agarowych w temperaturze 4^oC, został uaktywniony poprzez przeniesienie na świeże skosy i inkubację w temperaturze 39^oC w ciągu 1 godziny.

Uaktywnione szczepy zostały przeniesione do kolb o różnym składzie pożywki (różne stężenie laktozy). Następnie prowadzono hodowlę wstrząsaną przy parametrach:

• obroty wstrząsarki - 240 rpm

• amplituda - 4,5 cm

• temperatura - 39^oC

• czas procesu - 40 godzin

1. Metody analityczne

1. Oznaczenie aktywności α - amylazy w cieczach po hodowli Bacillus licheniformis

1. Wykonanie

Do oznaczenia aktywności stosujemy metodę Fischera-Steina. Za jednostkę aktywności przyjmuje się taką ilość enzymu, która w ciągu 3 minut w temperaturze 25^oC hydrolizuje 1% roztwór skrobi, uwalniając taką ilość cukrów redukujących, która odpowiada 1 mg maltozy.

Z kolb po hodowli wstrząsanej o różnym stężeniu laktozy w pożywce pobieramy po 0,5 ml cieczy pohodowlanej i rozcieńczamy odpowiednio wodą destylowaną:

• 0,5% - 200-krotne rozcieńczenie

• 1% - 400-krotne rozcieńczenie

• 2% - 600-krotne rozcieńczenie

• 3% - 600-krotne rozcieńczenie

Z odpowiednio rozcieńczonych roztworów pobieramy po 0,5 ml. Przenosimy do probówek zawierających po 0,5 ml 1% roztworu skrobi. Następnie inkubujemy przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Po upływie tego czasu dodajemy po 1 ml kwasu 3,5-dinitrosalicylowego.

Równolegle wykonujemy próbę kontrolną o składzie: 0,5 ml wody destylowanej, 0,5 ml 1% roztworu skrobi, 1 ml kwasu 3,5-dinitrosalicylowego.

Następnie mieszaniny wstawiamy do wrzącej łaźni wodnej na 5 minut, po czym schładzamy.

Dodajemy po 8 ml wody destylowanej i dokonujemy pomiaru absorabancji na „SPECOL-u” przy długości fali 540 nm wobec próby kontrolnej.

1. Wyniki

Tabela 1.: Wyniki pomiarów absorbancji i aktywności

Stężenie laktozy [%]	Absorbancja	Aktywność α - amylazy [F-S/cm^3]
0,5	0,415	332
1	0,290	464
2	0,325	780
3	0,361	866

Przykładowe obliczenia:

Akt = A₅₄₀ * R * 4 (z krzywej wzorcowej)

Dla 0,5%:

Akt = 0,415 * 200 * 4 = 332

Tabela 2.: Wyniki zbiorcze

	Aktywność α - amylazy [F-S/cm^3]
Stężenie laktozy[%]	0,5	1	2	3
Grupa 1.	208	360	804	768
Grupa 2.	260	485	811	993
Grupa 3.	240	608	1080	1032
Grupa 4.	332	464	780	866
Grupa 5.	124	222	568	600
Grupa 6.	216	328	756	804
Grupa 7.	188	400	936	1032

2. Wnioski

W zakresie 0,5% - 2% laktozy rośnie aktywność α - amylazy. Powyżej 2% następuje zahamowanie wzrostu.

Największa aktywność α - amylazy wystąpiła przy 3%, co sugeruje, że optymalne stężenie laktozy znajduje się pomiędzy 2% a 3%.

1. Oznaczenie wzrostu biomasy

1. Wykonanie

Oznaczenie wykonujemy metodą pośrednią poprzez pomiar zmętnienia w zawiesinie pohodowlanej, po 20-krotnym rozcieńczeniu wodą destylowaną.

Pomiar wykonujemy na „SPECOL - u” przy długości fali 535 nm, stosując jako próbę kontrolną wodę.

2. Wyniki

Tabela 3.: Wyniki pomiarów stężenia biomasy

Stężenie laktozy [%]	Stężenie biomasy
0,5	0,09
1	0,125
2	0,400
3	0,370

Tabela 4.: Wyniki zbiorcze pomiaru stężenia biomasy

	Stężenie biomasy
Stężenie laktozy [%]	0,5	1	2	3
1.	0,31	0,47	0,86	0,80
2.	0,35	0,48	0,83	0,75
3.	0,3	0,37	0,820	0,80
4.	0,09	0,125	0,400	0,370
5.	0,257	0,331	0,79	0,7
6.	0,23	0,31	0,85	0,72
7.	0,28	0,51	0,88	0,83

3. Wnioski

W zakresie od 0,5% do 2% nastąpił gwałtowny wzrost stężenia biomasy wraz ze wzrostem stężenia laktozy. Powyżej 2% obserwujemy spadek stężenia biomasy.

3

---