gr.1:

• Podobieństwa i różnice między klonowaniem fragmentów DNA i organizmów.

Klonowanie organizmów oznacza procedurę otrzymywania organizmów o takiej samej

informacji genetycznej, z reguły poprzez procedurę transferu jądra z komórki somatycznej do komórki jajowej pozbawionej uprzednio jądra. W przypadku klonowania roślin stosuje się procedurę odróżnicowania komórek dawcy do komórek merystematycznych.

Jako metoda rozmnażania wegetatywnego od dawna stosowane w ogrodnictwie; w 2. poł. XX w. opracowano technikę klonowania płazów (tzw. transplantacja jąder); obecnie są opracowywane metody klonowania innych zwierząt, m.in. ssaków; opierają się gł. na rozdziale wczesnych zarodków (4-8-komórkowych) na komórki; metoda transplantacji jąder w przypadku ssaków jest stosowana od niedawna; w przypadku klonowania owcy (1996) polega na wprowadzeniu jądra pochodzącego z diploidalnej, dorosłej komórki gruczołu mlekowego owcy do oocytu pozbawionego jądra; otrzymaną „zygotę” po 6 dniach hodowli in vitro wprowadzono do macicy zastępczej matki, a po upływie okresu ciąży urodziło się jagnię (owieczka Dolly) posiadające identyczne geny jak jej naturalna matka; inną metodą k.o. jest wykorzystywanie transformowanych genetycznie fibroblastów płodowych; w ten sposób uzyskano m.in. młode makaki

Klonowanie fragmentów DNA polega na izolacji genu(ów)odpowiedzialnych za ekspresję białka lub za tworzenie się innego produktu. Genom każdego organizmu jest jednak za duży i zbyt złożony, by można było użyć zwykłych metod chemicznych i biochemicznych do izolacji wybranego fragmentu. Rozwiązaniem tego problemu jest umieszczenie stosunkowo krótkiego fragmentu genomowego DNA, który może zawierać gen lub inną interesującą nas sekwencję, w autonomicznie powielającej się cząsteczce DNA określanej jako wektor (wektory oparte na plazmidach, wirusach i całych chromosomach są stosowane do przenoszenia genów do innych organizmów prokariotycznych lub eukariotycznych). Powstaje w ten sposób rekombinowany DNA, który może ulegać replikacji niezależnie od macierzystego genomu, również w komórkach gospodarza należącego do innego gatunku. Przez powielenie się organizmu gospodarza zawierającego rekombinowany DNA tworzy grupę genetycznie identycznych organizmów, czyli klon.

PODOBIEŃSTWA:

• Otrzymanie organizmu o takiej samej informacji genetycznej.

• Ingerencja w jądro komórkowe gospodarza.

RÓŻNICE:

• Ilość złożoność materiału wykorzystanego w procesie klonowanie (k. organizmów: przeniesienie całego DNA, k. fragm. DNA: jak sama nazwa wskazuje- przenosi się tylko wybrany fragment DNA).

• Klonowanie organizmów jest stosowane głównie jako metoda rozmnażania, natomiast klonowanie fragmentów DNA ma na celu ich manipulowanie.

• Różne zastosowania obu metod:

• K. organizmów: możliwość produkcji organów do przeszczepu, zwiększenie populacji zwierząt zagrożonych wyginięciem

• K. fragm.. DNA: wytwarzanie zrekombinowanych białe, genetycznie zmodyfikowanych organizmów, „odcisk DNA” (czyli hybrydyzacji, przeniesionego metodą Southerna, genomowego DNA z sondami, które rozpoznają proste powtórzenia nukleotydów, prowadzi do otrzymania obrazu, który jest unikatowy dla danego osobnika i może być zastosowany do jego identyfikacji, jak odcisk palca), przygotowania zestawów diagnostycznych oraz do terapii genowej.

- Mechanizmy naprawy uszkodzeń DNA, zagrożenia jakie niesie wystąpienie mutacji w białku naprawczym (skutki dla DNA)

• Bezbłędne:

• Fotoreaktywacja: rozszczepienie (monomeryzacja) cyklobutanowych dimerów pirymidynowych pod wpływem fotoliaz DNA (enzymów fotoreaktywująchych) w obecności światła widzialnego. Enzymy te mają grupy prostetyczne (niebiałkowy składnik białka (np. enzymu) niezbędny dla jego aktywności), które absorbują światło niebieskie i przenoszą energię na pierścień cyklobutanowy, który następnie ulega rozszczepieniu i przywrócenie oryginalnej struktury DNA. Fotoreaktywacja jest swoista dla dimerów pirymidynowych. Stanowi przykład bezpośredniego usuwanie uszkodzeń i jest wolna od błędów.

• Alkilotransferaza: element odpowiedzi adaptacyjnej na czynniki alkilujące występujących nawet w małych stężeniach i umożliwia zwiększoną ochronę przed późniejszymi, letalnymi i mutagennymi efektami wywoływanymi przez większe dawki. Alkilotransferaza usuwa grupy alkilowe z bezpośrednio mutagennej
  -alkiloguaniny (która może ulec parowaniu z tyminą). Grupa alkilowa jest przenoszona bezpośredni na enzym inaktywując go. Z tego wynika, że każda Alkilotransferaza może być użyta tylko raz. Ochrona przed letalnymi mutacjami wymaga indukcji glikozydazy DNA, która usuwa alkilowane zasady na drodze naprawy przez wycinanie zasad.

• Naprawa przez wycinanie (wszechobecny mechanizm działający na wiele rodzajów uszkodzeń, zasadniczo wolny od błędów):

• NER (naprawa poprzez wycięcie nukleotydu): endonukleaza rozcina nić DNA po obu stronach uszkodzenia w miejscach odległych od niego p ściśle określoną liczbę par zasad. Oligonukleotyd zawierający uszkodzenie jest usuwany, co powoduje utworzenie się luki o rozmiarach usuniętego fragm. DNA. Endonukleaza (XPG, XPF) nacina nić DNA w dwóch miejscach, kolejność 3' czy 5' jest losowa. Następnie usunięty odcinek jest zastępowany na drodze dokładnego parowania zasad, dzięki aktywności enzymu polimerazy DNA δ albo polimerazy ε, w obecności PCNA i RFC. Proces syntezy naprawczej kończy reakcja ligazy, łączącej końce wstawki z resztą nici DNA.

• BER (naprawa poprzez wycięcie zasady): zmodyfikowane zasady są rozpoznawane przez względnie specyficzną glikozydazę DNA, która przecina wiązanie N-glikozydowe między zmienioną zasadą a cukrem, pozostawiając miejsce purynowe lub pirymidynowe (AP). Miejsca AP są tworzone również na skutek spontanicznej utraty zasad. Endonukleaza AP rozpoznaje to miejsce i nacina DNA w kierunku 5' od miejsca AP tworząc wolny koniec 3'-OH. Polimeraza DNA, Pol I, wydłuża nić DNA od wolnego końca 3'-OH wykorzystując aktywność egzonukleazy do zastąpienia nukleotydu z uszkodzoną zasadą oraz kilku następnych. Następnie nowa nić jest łączona ze starą za pomocą ligazy DNA.

• Naprawa źle sparowanych zasad: Błędy replikacji, które nie zostały skorygowane przez polimerazę DNA, powodują powstanie źle sparowanych nici DNA. Hemimetylacja DNA po replikacji pozwala na rozróżnienie nici potomnej od rodzicielskiej. Źle sparowane zasady są usuwane z nici potomnej za pomocą mechanizmu naprawy przez wycinanie zasad.

• Mutacje w genach naprawczych (kodujących białka działające przez wycinanie uszkodzeń) lub uszkodzenie polimerazy DNA powodują powstanie różnych form xeroderma pigmentosum, chorobę nowotworową, będącą wynikiem wrażliwości na światło słoneczne. U osób cierpiących na XP wadliwie działa mechanizm NER, wskutek czego duże uszkodzenie DNA, w tym spowodowane działaniem światła UV, pozostają nienaprawione. XP jest powodowana uszkodzeniem przynajmniej 7 różnych genów, co wskazuje na złożoność mechanizmów naprawy przez wycinanie. Zaburzenia mechanizmów naprawy przez wycinanie występują także w przypadkach zespołu Cockayne'a. Osoby cierpiące na to schorzenie również są wrażliwe na światło słoneczne, co wynika z defektów mechanizmu naprawy przez wycinanie sprzężonego z transkrypcją, ale zaburzenia te nie SA rakotwórcze.

gr.2:

- Coś o modyfikacjach jakich może ulegać transkrypt i etapy dojrzewania mRNA

Dojrzewanie mRNA: Prokrariotyczny mRNA nie ulega właściwie żadnym procesom dojrzewania, a translacja może u prokariotów rozpocząć się jeszcze zanim zakończy się synteza mRNA. U eukariontów cząsteczki mRNA są syntezowane przez polimerazę RNA II jako dłuższe prekursory. Populację różnych pre-mRNA nazywamy heterogennym jądrowym RNA (hnRNA). Swoiste białka wiążą się do hnRNA tworząc hnRNP, a następnie małe jądrowe (snRNP) oddziałują z hnRNP w celu przeprowadzenia niektórych etapów dojrzewania RNA. Dojrzewanie eukariotycznych hnRNP obejmu7je 4 etapy:

• Kapowanie końca 5': Jest to dodanie nukleotydu 7-metyloguanozynowego
  do końca 5' transkryptu polimerazy RNA II, już wtedy, gdy transkrypt ma długość zaledwie 25 nukleotydów.
  (kap) jest dołączona w ten sposób, że tworzy z pierwszym nukleotydem transkryptu wiązanie 5'-5'. Chroni to RNA przed atakiem 5'-egznonukleaz, ale również ułatwia splicingu, transport i translację.

• Rozcięcie i poliadenylacja końca 3': Prawie wszystkie eukariotyczne pre-mRNA są rozcinane w pobliżu tzw. miejsca poliadenylacji i polimeraza poli (A) (PAP) dodaje do transkryptu ogon poli(A) o długości około 250 nukleotydów, tworząc dojrzały koniec 3' mRNA.

• Splicing: W trakcie dojrzewania eukariotycznego pre-mRNA introny (zwane również sekwencjami interweniującymi) są usuwane, a dwa eksony oskrzydlające intron zostają ze sobą połączone. Reakcja splicingu zachodzi w jądrze komórkowym i wymaga od intronu sekwencji 5'-GU, AG-3', oraz charakterystycznej sekwencji w tzw. miejscu rozgałęzienia. W dwuetapowej reakcji intron zostaje usunięty w postaci cząsteczki przypominającej lasso, a następnie ulega degradacji. Splicing rozpoczyna się od związania cząstek snRNP z konserwatywnymi sekwencjami pre-mRNA; snRNP tworzą spliceosom, w którym przebiegają reakcje cięcia i ligacji.

• Metylacja pre-mRNA: Niewielki procent reszt A w pre-mRNA, te które występują w sekwencji 5'-RRACX-3' (gdzie R= puryna), zostaje zmetylowany w pozycji N6.

- Etapy klonowania i co to jest klonowanie

Klonowanie ułatwia izolację fragmentów genomu organizmów i manipulację tymi fragmentami dzięki niezależnemu namnażaniu ich jako części autonomicznych wektorów.

Etapy klonowania:

• Izolacja plazmidowego DNA zawierającego interesujący nas fragment DNA

• Trawienie plazmidu na oddzielne fragmenty za pomocą nukleaz restrykcyjnych

• Rozdzielanie fragmentów za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym

• Oczyszczenie pożądanego docelowego fragmentu

• Ligacja fragmentu z nowym wektorem plazmidowym w celu stworzenia nowej zrekombinowanej cząsteczki

• Przeniesienie plazmidu zawierającego docelowy fragment do szczepu E. coli (transformacja)

• Selekcja transformowanych bakterii

• Analiza zrekombinowanych plazmidów

gr.3:

- Do czego służą biblioteki genowe, podaj etapy ich tworzenia

Biblioteka genowa : to zbiór różnych sekwencji DNA danego organizmu, które zostały sklonowane w wektorze w celu ich łatwiejszego oczyszczania, przechowywania i analizy. Biblioteki DNA to zestawy klonów DNA (genetycznie odrębny osobnik lub grupa organizmów identycznych genetycznie). Każdy z klonów powstał poprzez włączenie do wektora innego fragmentu DNA, który następnie został namnożony w komórkach gospodarza. Do skonstruowania biblioteki genowej wykorzystuje się komórki bakteryjne.

Rodzaje bibliotek genowych:

• Genomowe- to kolekcja klonów (zazwyczaj bakterii), która jako całość zawiera co najmniej jedną kopię każdej sekwencji DNA obecnej w genomie organizmu, którego bibliotekę genomową utworzono. Jeśli dobrze przygotujemy taką bibliotekę mamy bardzo duże szanse na znalezienie interesującego nas genu. Często zdarza się tak , że na żadnym z klonów nie znajdziemy całości genu. Dzieje się tak ponieważ jest duża szansa na to , że enzym użyty do konstrukcji banku może mieć miejsce cięcia w obrębie interesującej nas sekwencji. Szansa ta rośnie wprost proporcjonalnie do jej długości. Aby obejść ten problem można tak dobrać warunki trawienia by enzym nie trawił we wszystkich możliwych miejscach co zwiększa szansę na znalezienie całości genu. W przypadku gdy szukanym przez nas odcinkiem DNA jest nie gen ale np. promotor , enhancer czy inna sekwencja regulacyjna biblioteka genomowa jest niezastąpiona.

• cDNA- z komórek izoluje się mRNA a następnie przy użyciu odwrotnej transkryptazy przepisuje się mRNA na DNA tworząc cDNA (complementary DNA - komplementarny do mRNA). Wady : należy pamiętać , że w ten sposób uzyskujemy bibliotekę tylko tych genów , które są w danym momencie i w danej tkance aktywne transkrypcyjnie , dlatego należy dobrze przemyśleć wybór tkanki i czas izolacji. Takiego problemu nie ma gdy poszukiwany gen jest genem podstawowym i we wszystkich tkankach ulega ekspresji. Inną wadą jest reprezentacja w różnych ilościach kopii różnych odcinków cDNA ponieważ nie we wszystkich komórkach transkrypty danego genu będą występowały tak samo licznie.
  Zaletą takiego banku jest pewność , że każda cząsteczka cDNA zawiera informację genetyczną odpowiadającą dokładnie jednemu genowi czyli każdy klon to jeden cały gen. Inną korzyścią jest fakt braku intronów co można wykorzystać kiedy chcemy produkować dane białko w komórkach bakterii , która normalnie nie przeprowadza splicingu.

Etapy tworzeni bibliotek genomowych:

1. Oczyszczenie genomowego DNA

2. Rozcięcie genomowego DNA losowo na fragmenty o wielkości odpowiedniej do klonowania w wybranym wektorze (na drodze mechanicznego rozrywania lub trawienia enzymami restrykcyjnymi)

3. Fragmenty o właściwych rozmiarach są nadepnie oczyszczane metodą elektroforezy w żelach agarozowych lub wirowania w gradiencie sacharozy

4. DNA wektora λ musi być trawiony enzymami restrykcyjnymi w celu przygotowania dwóch końcowych fragmentów λ, czyli ramion faga λ, między które zostaje wbudowany fragment genomowego DNA

5. Ramiona odcięte z oryginalnych wektorów w wyniku trawienia restryktazą oczyszcza się od centralnego (zbędnego) fragmentu na drodze wirowania w gradientach

6. Po przygotowaniu ramion, wcześniej przygotowany genomowy DNA, jest z nimi łączony za pomocą T4DNA ligazy

7. Zrekombinowane cząsteczki są gotowe do pakowania, namnożenia i utworzenia biblioteki.

Etapy tworzenia bibliotek cDNA:

1. Izolacja mRNA z komórek eukariotycznych poddanych lizie, stosując małe kuleczki magnetyczne, okryte kowalencyjnie związanym oligo(dT)

2. mRNA wiąże się z oligo(dT) po przez swój „ogon” poli(A) i dzięki temu może być wyizolowany z roztworu

3. Integralność mRNA można badać stosując elektroforezę żelową, która pozwala frakcjonować pulę mRNA wg wielkości cząsteczek

4. Po elektroforezie można odzyskać RNA z odpowiedniego rejonu żelu

5. Synteza cDNA: W celu uzyskania kopii mRNA w postaci cDNA, do syntezy pierwszej nici DNA stosuje się odwrotną transkryptazy, która wydłuża starter, zwykle oligo(dT), przez dodawanie doeksyrybonukleotydów do jego końca 3'. Proces syntezy można wykryć przez częściowe znakowanie nici DNA. Wydłużanie końca 3' pierwszej nici cDNA za pomocą terminalnej transferazy ułatwia syntezę drugiej nici o pełnej długości. Homopolimerowy koniec 3' może stanowić miejsce wiązania startera, wydłużanego następnie przez odwrotną transkryptazy lub enzym Klenowa przy syntezie drugiej nici cDNA.

6. Obróbka końców cDNA: W celu uniknięcia w cDNA tępych końców, które utrudniałyby jego ligację z wektorem, zwykle do cDNA dołącza się sekwencje łącznikowe, tzw. Linkery. Przedtem jednak koniec cDNA reperuje się za pomocą nukleazy specyficznej wobec jednoniciowych fragmentów a następnie enzymu Klenowa. Jeśli wskazane jest, by dodane linkery nie były rozszczepiane przez enzymy restrykcyjne, cDNA można także metylować. Alternatywnie zamiast linkerów można stosować cząsteczki adaptorowe.

7. Ligacja z wektorem: W celu ułatwienia tworzenia się cząsteczek zrekombinowanych i przeciwdziałania łączeniu się cząsteczek wektora, wektor jest zwykle defosorylownay za pomocą alkalicznej fosfatazy. Do przygotowania bibliotek cDNA mogą być stosowane wektory plazmidowe lub fagowe, ale do konstrukcji biblioteki ekspresyjnej preferowany jest wektor fagowy λgt11.

- Jakie są powiązania białko-DNA i do czego służą, kilka przykładów

1. Chromatyna- kompleks białko-DNA, który tworzy chromosomy eukariotyczne; struktura chromatyny służy upakowaniu i organizacji chromosomowego DNA i jest zdolna do zmiany poziomów skondensowania w zależności od etapów cyklu komórkowego; w skład białek związanych z DNA wchodzą histony, które upakowują DNA w powtarzający się układ cząstek złożonych z DNA i białka, nazywanych nukleosomami. Za pomocą histonu H1 nukleosomy zostają upakowane we włókno o średnicy 30 nm- może ono być następnie zwijane lub fałdowane, tworząc bardziej zwarte struktury chromatyny. Niektóre chromosomy są tak zwarte, że zwarte w nich genu nie mogą ulec ekspresji.

2. Biała wiążące DNA- utrzymują wypętlone domeny DNA chromosomu, najczęstszymi z nich są białka HU i H-NS:

• Białko HU- małe, zasadowe, występuje w postaci dimeru, który niespecyficznie wiąże DNA poprzez owinięcie go wokół własnej cząsteczki.

• Białko H-NS- monomer o obojętnym ładunku wypadkowym wiąże DNA niespecyficznie pod względem sekwencji, wykazuje preferencje w stosunku do regionów tworzących zagięcia helisy DNA.

• Białka wymienione powyżej są czasem określane jako białka podobne do histonów

gr.4:

- Czym się różni mutacja od uszkodzenia DNA, przykłady, czynniki powodujące

Mutacje są to stałem dziedziczne zmiany w sekwencji zasad DNA. Powstają ona albo na skutek spontanicznych błędów w replikacji DNA lub rekombinacji mejotycznej, albo jako konsekwencja szkodliwego działania na DNA czynników fizycznych i chemicznych.

Rodzaje mutacji:

• Genomowe- punktowe (delecje, insercje, substytucje)

Efekty: neutralne, zmiana sensu, utrata sensu, np.: przedwczesna germinacja w wyniku zmiany ramki odczytu

Choroby: anemia sierpowata, fenyloketonuria, hemofilia, albinizm

• Chromosomowe: delecje, insercje, inwersje, amplifikacje

Efekty: utrata lub powielenie kopii genu, białka fuzyjne

Choroby: zespół Downa, zespół Edwardsa

Mutageny:

• Fizyczne:

• Promieniowanie jonizujące i niejonizujące

• Chemiczne:

• Kwas azotanowy

• Czynniki alkilujące i arylujące

Uszkodzenie DNA jest to zmiana jego prawidłowej budowy chemicznej lub struktury fizycznej.

Rodzaje uszkodzeń:

• Uszkodzenia oksydacyjne: reaktywne formy tlenu powodują szereg uszkodzeń, wśród nich uwolnienie się 8-oksyguaniny i 5-hydroksymetauracyu pojawiają się spontanicznie a ich częstość wzrasta pod wpływem pewnych zewnętrznych czynników egzogennych, np. promieni γ.

• Alkilacja: elektrofilowe czynnik alkilujące mogą modyfikować nukleotydy w różnych pozycjach. Większość z nich nie jest bezpośrednio mutagenna.

• Duże czynniki addycyjne: duże uszkodzenia, takie jak dimery pirymidynowe i addukty arylowe, zniekształcają dwuniciową helisę DNA i powodują miejscową denaturację. Zaburza to prawidłowe funkcjonowanie DNA.

• Wstawienie niekomplementarnej zasady

• Hydroliza zasad

Czynniki uszkadzające:

• Fizyczne: promieniowanie jonizujące i UV

• Chemiczne: czynniki alkilujące, reaktywne formy tlenu, policykliczne węglowodory aromatyczne.

- Na czym polega i do czego służy biblioteka genomowa

Patrz pkt. 3

gr.5:

- Wyjaśnić jak działają systemy naprawy DNA oraz określić skutki uszkodzenia systemu napraw w: komórce, organizmie, gatunku.

Fotoreaktywacja, alkolotransferaza, NER, BER, MMR(koryguje błędy zaistniałe przy replikacji i rekombinacji genów, powodujące powstawanie niesparowanych zasad.)

http://pl.wikipedia.org/wiki/Naprawa_DNA

- Na czym polega hybrydyzacja oraz gdzie się ją stosuje.

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych to zjawisko spontanicznego łączenia się komplementarnych nici kwasów nukleinowych. Komplementarne nici kwasów nukleinowych ulegają rozdzieleniu (tzw. denaturacji) pod wpływem wysokiej temperatury lub substancji chemicznych, takich jak formamid lub mocznik. Po usunięciu wpływu czynnika denaturującego, nici łączą się ponownie, czyli ulegają renaturacji. Jeśli do takiej mieszaniny wprowadzi się obce nici kwasu nukleinowego, oprócz wyjściowych cząsteczek powstaną cząsteczki hybrydowe, stąd nazwa hybrydyzacja. Szybkość hybrydyzacji zależy między innymi od długości fragmentów kwasów nukleinowych, podobieństwa i różnorodności sekwencji w próbce poddanej hybrydyzacji.

Zjawisko hybrydyzacji znalazło szereg użytecznych zastosowań w technikach biologii molekularnej. W szczególności, hybrydyzacji z użyciem znakowanego izotopowo lub chemicznie fragmentu kwasu nukleinowego (tzw. sondy molekularnej) używa się do detekcji homologicznych fragmentów podczas:

• poszukiwania nowych genów poprzez proces (klonowania genów), w przeszukiwaniu bibliotek genowych lub klonowaniu pozycyjnym.

• do oszacowania poziomu ekspresji genów poprzez specyficzną detekcję cząsteczek mRNA w technice northern.

• do globalnej analizy różnic w ekspresji genów pomiędzy dwiema próbkami z wykorzystaniem macierzy genowych.

• do wizualizacji regionów ekspresji genu w organizmie w technice hybrydyzacji in situ.

• do detekcji specyficznych fragmentów DNA w technice Southerna, np. w celu ustalenia ilości kopii danego genu w genomie, ustalenia wzoru polimorfizmu miejsc restrykcyjnych (RFLP). Techniki RFLP używa się m. in. celu ustalenia ojcostwa.

gr.6:

• Na czym polega i do czego stosowana jest metoda mikromacierzowa, przykłady

Podstawą działania mikromacierzy jest tak, jak w tradycyjnej hybrydyzacji Southerna, komplementarność kwasów nukleinowych. Mikromacierz zawiera sekwencje komplementarne do badanych sekwencji. Próbkę kwasu nukleinowego wyznakowuje się (jednym lub dwoma znacznikami fluorescencyjnymi) i hybrydyzuje z mikromacierzą. Cząsteczki wyznakowanego kwasu nukleinowego wiążą się do komplementarnych sekwencji. Obraz sczytuje się ilościowo (za pomocą lasera lub mikroskopu). Intensywność sygnału dla poszczególnych sond mikromacierzy jest proporcjonalna do ilości kwasu nukleinowego o danej sekwencji w próbce.

• Przykłady zastosowań

• Znajdowanie genów reagujących zmianą ekspresji na zmiany:

• w środowisku (np. podanie leku)

• w genotypie (np. obecność transgenu)

• Znajdowanie genów, których ekspresja różni się

• między tkankami

• podczas rozwoju

• w tkance chorej i zdrowej

• między gatunkami.

- Rola histonów

Histony - zasadowe białka wchodzące w skład chromatyny, neutralizujące jej kwasowy charakter, o niewielkiej masie cząsteczkowej (poniżej 23 kDa). Charakteryzują się dużą zawartością aminokwasów zasadowych, zwłaszcza lizyny i argininy, co nadaje im właściwości polikationów. Wiążą się z helisą DNA, która jest polianionem, tworząc nukleoproteiny, które są obojętne elektrycznie. Wyróżnia się pięć typów histonów:

• szczególnie bogatą w lizynę:

H1 - najbardziej zasadowy, największy z histonów (zwany czasem histonem łącznikowym)

H2A

H2B

szczególnie bogate w argininę:

H3 , H4

Histony H3 i H4 są najbardziej konserwatywne ewolucyjnie natomiast histon H1 jest najbardziej zmienny.

gr.7:

- Do czego służą startery w PCR, opisać, podać etapy.

Startery PCR: Para oligonukleotydów o długości 18-30 nukleotydów i podobnej zawartości G+C będzie spełniać rolę staterów PCR tak długo, jak długo kierują one syntezą w kierunku jeden do drugiego. Jeśli sekwencja docelowego DNA jest całkowicie nieznana, można stosować startery w pewnym stopniu zdegenerowane.

PCR: Łańcuchowa reakcja polimeryzacji jest używana do amplifikacji sekwencji DNA z użyciem pary oligonukleotydowych starterów, z których każdy jest komplementarny do jednego końca docelowej sekwencji DNA. Startery te są wydłużane w kierunku do siebie, za pomocą termo stabilnej polimerazy DNA, w cyklu reakcji obejmującym trzy etapy: denaturację, przyłączenie startera i polimeryzację.a

Cykle PCR: Cykle reakcji obejmuje etap denaturacji dwuniciowego DNA w 95°C, etap przyłączenia startera w temp. około 55°C i etap polimeryzacji w 72°C. Oprócz matrycy, starterów, buforów i enzymu, wymagane są
i DTP.

- Uszkodzenia i mutacje DNA - definicja, przykłady i co mogą spowodować Patrz gr. 4

gr.8:

-Opis i rola histonów, jak i rola obróbki potranslacyjnej Histony -> patrz gr.6

-Metody detekcji białek z opisem ?

gr.9:

- Oddziaływanie białka-DNA, Patrz gr. 3

• Opisać PCR rzeczywisty w czasie (QPCR), kiedy go stosujemy i czym się różni od klasycznego PCR. ?

Real time PCR - do środowiska reakcji wprowadzane są znakowane (np. barwnikami fluorescencyjnymi) nukleotydy bądź sondy łączące się z DNA, które pozwalają na podstawie odczytów w kolejnych cyklach określić ilość matrycy użytej do reakcji, jak również śledzić ilość powstającego produktu.

Zastosowania:

• szybkie wykrywanie kwasow nukleinowych ktore moga nam mowic o infekcjach, raku, anomaliach genowych

gr.10:

• Rola i znaczenie modyfikacji białkowych ?

1. Obróbka proteolityczna odbywa się przy pomocy enzymów zwanych peptydazami, które są odpowiedzialne za cięcie łańcuchów polipeptydowych na końcu łańcucha (egzopeptydazy) lub w jego środku (endopeptydazy). Większość tych enzymów jest bardzo specyficzna - rozpoznają one miejsce cięcia na podstawie sekwencji aminokwasowej. Dobrym przykładem może posłużyć proinsulina, której pierwotny łańcuch polipeptydowy jest przecinany w określonych miejscach, następnie dwa produkty są łączone za pomocą "mostków" dwusiarczkowych.

Istnieje kilka innych przykładów obróbek proteolitycznych:

• - aktywacja białka, poprzez wycięcie niepotrzebnego fragmentu łańcucha polipeptydowego

• - usunięcie sekwencji liderowych (fragmentów łańcucha, które kierują białko do odpowiedniego przedziału komórkowego)

• - w przypadku poliprotein płaszcza niektórych wirusów - pocięcie na fragmenty, aktywuje każdy z otrzymanych fragmentów

• - rzadko występujący splicing polipeptydowy (podobnie jak obróbka preRNA) - wycinanie fragmentów ze środka łańcucha polipeptydowego

• - usuwanie pierwszego podstawnika (metioniny lub formylometioniny) występujące u prawie 50% wszystkich białek

9. Modyfikacja potranslacyjna białek obejmuje także procesy dołączania reszt lipidowych (lipoproteiny), a także jonów metali (w przypadku białek złożonych), które za pomocą wiązań jonowych łączą się z odpowiednimi grupami funkcyjnymi aminokwasów i stanowią centra aktywne dla wielu enzymów (np.: hemoglobina - Fe).

• Heterogenność składu aminokwasowego, tworzonych struktur, rodzajów modyfikacji, a także połączeń z innymi niebiałkowymi substancjami implikuję ogromną różnorodność funkcji, które białka pełnią w organizmie, a także ich właściwości fizyko-chemicznych.

- Sposoby zapisu sekwencji nukleotydowych ?

gr.11:

- Biblioteki genomowe, co dają, po co się je robi itd. itp. Patrz pkt. 3

- Porównanie mutacji i uszkodzeń w DNA. Praktycznie wszystko co sie o tym wie Patrz gr. 4

gr.12:

• Rodzaje chromatografii i do czego służą ?

Chromatografia to technika analityczna lub preparatywna służąca do rozdzielania lub badania składu mieszanin związków chemicznych.

W zależności od rodzaju eluentu czyli substancji w której rozpuszcza się badaną mieszaninę rozróżnia się następujące techniki chromatograficzne:

* chromatografia cieczowa - w której eluentem jest ciekły rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników

* chromatografia gazowa - w której eluentem jest gaz (zwykle hel, argon lub wodór, czasem azot).

* chromatografia nadkrytyczna - w której eluentem jest gaz w stanie nadkrytycznym.

W zależności od rodzaju i sposobu przygotowania fazy rozdzielczej:

* TLC - thin layer chromatography, chromatografia cienkowarstwowa - w której fazę rozdzielczą stanowi cienka warstwa fazy stałej naniesiona na sztywną płytkę. Na tak spreparowaną płytkę nanosi się próbkę roztworu, po czym na skutek działania sił kapilarnych, grawitacji lub pola elektrycznego następuje przepływ i rozdział mieszaniny;

* chromatografia bibułowa - w której fazę rozdzielczą stanowi pasek lub arkusz bibuły filtracyjnej lub specjalnego typu bibuły chromatograficznej;

* chromatografia kolumnowa - w której faza rozdzielcza jest umieszczona w specjalnej kolumnie, przez którą przepuszcza się następnie roztwór badanej mieszaniny. Przepływ roztworu przez kolumnę można wymuszać grawitacyjnie lub stosując różnicę ciśnień na wlocie i wylocie kolumny;

* chromatografia powinowactwa - w której odpowiednio spreparowana faza rozdzielcza jest zdolna do oddziaływań chemicznych o zmiennym powinowactwie wobec rozdzielanych substancji;

* chromatografia jonowymienna - w której substancje oddziałują ze złożem za pomocą oddziaływań jonowych.

W zależności od parametrów procesu:

* HPLC - high performance/pressure liquid chromatography, wysokosprawna/ciśnieniowa chromatografia cieczowa - odmiana cieczowej chromatografii kolumnowej z użyciem eluentu pod wysokim ciśnieniem;

* FPLC - fast protein/performance liquid chromatography - szybka, białkowa/szybkosprawna chromatografia cieczowa - odmiana HPLC działająca na niższych ciśnieniach, stosująca prócz złóż sorpcyjnych, także zwykłe złoża typu sit molekularnych, służąca głównie do rozdziału białek i polipeptydów. Opatentowana i wyłączna nazwa dla firmy Pharmacia;

* UPLC - ultra performance liquid chromatography, ultrasprawna chromatografia cieczowa - odmiana cieczowej chromatografii kolumnowej. Działa na wyższych ciśnieniach i mniejszych przepływach, a kolumny mają mniejsze ziarno (1,7 - 1,8 μm). Pozwala uzyskiwać krótsze czasy retencji i wyższe rozdzielczości. Opatentowana i wyłączna nazwa dla firmy Waters.

* GPC - Gel Permeation Chromatography - chromatografia żelowa - odmiana kolumnowej chromatografii cieczowej. Polega na rozdziale składników mieszaniny na sitach molekularnych ze względu na ich wielkość (masę). Stosowana m.in. do określania średnich mas cząsteczkowych polimerów

gr.13:

- Mechanizm transkrypcji genów u eukariontów (co, jak, dlaczego, regulacja) ?

http://pl.wikipedia.org/wiki/Transkrypcja_(genetyka)

• Sekwencjonowanie DNA, metoda dideoksy

http://pl.wikipedia.org/wiki/Metoda_Sangera

- procesy toksyczne i genotoksyczne - co,jak i dlaczego, jak się organizm broni. ?

gr 14:

- Systemy dwuhybrydowe drożdżowe - co to i do czego służą

http://zguw.ibb.waw.pl/resources/System%20dwuybrydowy%20w%20dro%C5%BCd%C5%BCach.pdf

- Opisać etapy regulacji odczytu i ekspresji informacji genetycznej w organizmach eukariotycznych.

•  co nazwałbyś programem genetycznym 

Teraz wiem ze jest to regulacja informacji genetycznej przy pomocy RNA, czyli cały proces który zachodzi w komórce: transkrypcja, translacja i obróbka posttranskrypcyjna. A to już kazdy wie co i jak ;)

• w DNA powtarzają się jakieś sekwencje, co to są za sekwencje, podaj definicje i dlaczego się powtarzają.

Są to sekwencje nukleotydowe, centromerowe i telomerowe.

'' Inną przyczyną wielkości niektórych genomów eukariotycznych jest występowanie rodzin sekwencji, które powtarzają się wielokrotnie, ale o ich znaczeniu ciągle niewiele wiemy. Klonowanie molekularne i sekwencjonowanie potwierdziło istnienie takich licznie występujących sekwencji DNA, odkrytych wcześniej dzięki klasycznym technikom biochemicznym. Rodziny powtarzających się sekwencji mogą zawierać setki tysięcy, a nawet miliony powtórzeń, i zwykle stanowią 10%, a często nawet niemal 50% genomu. Długość powtórzonej jednostki wynosi od dwóch do wielu tysięcy par zasad. Podobnie jak powtórzone geny, powtarzające się sekwencje albo występują bezpośrednio po sobie (na przykład: 5'-AGGAGGAGGAGG-... i tak dalej), albo są rozrzucone po różnych miejscach chromosomu.        Techniki analizy molekularnej umożliwiły stwierdzenie, że pewne rodzaje sekwencji DNA występują w okolicy charakterystycznych struktur chromosomów, takich jak centromery, telomery czy organizatory jąderka. Na przykład region chromosomu nazywany organizatorem jąderka zawiera ciąg powtórzeń genów dla rRNA. Centromery i telomery większości chromosomów eukariotycznych również zawierają ciągi powtórzeń sekwencji nukleotydowych. Znaczenie powtórzeń centromerowych nie jest dobrze poznane. Powtarzające się sekwencje w centromerach są różne u każdego badanego gatunku. W rzeczywistości wcale nie muszą być konieczne dla właściwego działania centromeru - w przynajmniej jednym organizmie, drożdżach, centromery działają dobrze bez nich. Sekwencje DNA funkcjonalnych centromerów drożdży sklonowano. Długość ich wynosi zaledwie kilkaset par zasad i nie zawierają one powtórzeń.        Telomery znajdują się na końcach długich liniowych dwuniciowych cząsteczek chromosomalnego DNA. U wszystkich eukariontów sekwencje telomerowe są bardzo podobne. Zawierają różną liczbę krótkich, następujących po sobie powtórzeń, takich jak:

5'-CCCTAACCCTAACCCTAA...
3'-GGGATTGGGATTGGGATT... itp.

u ludzi lub:

5'-CCCCAACCCCAACCCCAA...
3'-GGGGTTGGGGTTGGGGTT... itp.

u kilku pierwotniaków. Telomerowe powtórzenia są dodawane na końcach nowo powstałego DNA dzięki specjalnemu enzymowi. Te szczególne sekwencje terminalne pozwalają komórce odróżnić prawdziwe telomery od pękniętych chromosomów. Pęknięte chromosomy są często łączone w przypadkowy sposób, telomerowe zakończenia stanowią jednak pewne zabezpieczenie przed takimi niepożądanymi zdarzeniami.

Metody elektroforetyczne http://www.biofizyka.p.lodz.pl/elektroforeza.pdf str. 13

Sekwencjonowanie DNA http://pl.wikipedia.org/wiki/Sekwencjonowanie_DNA

Translacja http://pl.wikipedia.org/wiki/Translacja_(genetyka)

Telomer http://pl.wikipedia.org/wiki/Telomer_(genetyka)

Histony http://pl.wikipedia.org/wiki/Histony

---