Maria Hauke, Wojciech Wesoły
Akademia Rolnicza im. A. Cieszkowskiego w Poznaniu
Katedra Hodowli Lasu,
Mikrorozmnażanie drzew leśnych
Wstęp
Badania w kulturach in vitro roślin drzewiastych mają dwa wzajemne i uzupełniające się aspekty poznawczy oraz praktyczny. Z jednej strony prace w układzie modelowym, jakim jest kultura in vitro, dostarczają wiedzy na temat genetycznych, biochemicznych i fizjologicznych uwarunkowań procesu morfogenezy roślin, z drugiej zaś strony mają na celu opracowanie efektywnych technik regeneracji roślin, niezbędnych do masowej produkcji materiału roślinnego.
Praktyka leśna zajmuje się problemem wyhodowania upraw dobrej jakości w krótkim czasie, przy możliwie minimalnym nakładzie kosztów. Wysiłki te zmierzają generalnie w dwóch kierunkach - ochrony upraw przed zwierzyną oraz przyspieszenia ich wzrostu w pierwszych latach życia. Jeśli weźmie się pod uwagę selekcję, to rozmnażanie wegetatywne jest efektywną metodą osiągnięcia wyższych korzyści w krótkim okresie. Technologie do klonalnego rozmnażania są uważane za ważne narzędzie wzrostu możliwości hodowlanych drzew [Savill i Kanowski 1993].
Tradycyjne metody rozmnażania wegetatywnego, takie jak szczepienie i ukorzenianie pędów, są wyjątkowo trudne i wymagają dużej ilości materiału matecznego. Ponadto jest to możliwe w przypadku tylko kilku gatunków drzew leśnych, ponieważ występują problemy z ukorzenianiem, wiekiem drzew matecznych, przeżywalnością oraz wysokimi kosztami. Większość tych problemów może być przezwyciężona przy wykorzystaniu kultur in vitro. Metoda ta pozwala uzyskać, z małych fragmentów roślin, wysoki wskaźnik rozmnażania wegetatywnego. Możliwość masowego rozmnażania przez kultury in vitro jest szczególnie przydatna wtedy, gdy posiadamy niewielką ilość materiału wyjściowego. Bardzo ważne z hodowlanego punktu widzenia jest również opracowanie skutecznych metod mikrorozmnażania drzew, których nasiona są trudne do przechowywania (recalcitrant), lub nieregularnie obradzają.
Mikrorozmnażanie, zwane też rozmnażaniem klonalnym, wykorzystuje zdolność eksplantatów do masowego tworzenia pąków bocznych, przybyszowych, mikrocebulek lub zarodków somatycznych. Metoda ta pozwala w pełni wykorzystać naturalny potencjał regeneracyjny każdej rośliny, zwany totipotencją. Stosowana jest rutynowo do rozmnażania wielu roślin uprawnych, o dużym znaczeniu gospodarczym, drzewa leśne w tej klasyfikacji pozostają w tyle. Głównym celem mikrorozmnażania roślin w leśnictwie jest szybka produkcja dużej liczby identycznych pod względem genetycznym roślin, uzyskanych z cennych, wyselekcjonowanych roślin rodzicielskich. Drzewami matecznymi zazwyczaj są drzewa doborowe i elitarne, czyli osobniki danego gatunku, które są najlepsze fenotypowo lub genotypowo.
W ostatnim stuleciu powstały dwie techniki pozwalające na różne warianty mikrorozmnażania:
organogeneza; organogeneza bezpośrednia polega na umieszczeniu fragmenty rośliny na pożywce (zawierającej odpowiednie regulatory wzrostu), z którego tworzą się pędy i korzenie i organogeneza pośrednia - poprzedza powstanie kalusa, z którego różnicują się pędy i korzenie. Pąki, z których w warunkach in vivo rozwija się określona liczba pędów, w warunkach hodowli in vitro mogą wytworzyć nieograniczoną w zasadzie liczbę pędów.
embriogeneza somatyczna (SE) różnicowanie jest indukowane w komórkach somatycznych materiału roślinnego. Proces ten przypomina rozwój embrionu zygotycznego, ale występują tu drobne różnice. Poszczególne stadia w embriogenezie somatycznej i zygotycznej roślin (np. lucerny, rzepaku, świerka i dębu) zachodzą w sposób niemalże identyczny. W podobnym czasie dochodzi do powstania zarodków w stadium globularnym, sercowatym lub torpedy, które pod względem morfologicznym w niewielkim stopniu odbiegają od zarodków zygotycznych. Indukcja embriogenezy somatycznej wiąże się z przeprogramowaniem komórki i uruchomieniem programu embriogenicznego.
Pierwsza metoda wymaga manualnej izolacji eksplantatów oraz pasaży kultury, w konsekwencji ma to wpływ na wyższe koszty produkcji. Metoda druga jest procesem, który można zautomatyzować i tym samym zredukować koszty robocizny.
W przebiegu mikrorozmnażania można wyróżnić trzy etapy:
wybór eksplantatów i wyłożenie ich na odpowiednie pożywki,
masowe mnożenie, czyli pasażowanie (przenoszenie) na nowe pożywki, zawierające odpowiednie regulatory wzrostu, tworzących się pąków, pędów, mikrocebulek czy zarodków somatycznych,
adaptacja uzyskanych in vitro roślin do warunków rozwoju naturalnego. Na tym etapie następuje ukorzenianie pędów, a następnie przystosowanie otrzymanych sadzonek do warunków uprawy w szkółce przez powolne obniżanie wilgotności oraz natężenia światła i temperatury.
Materiał roślinny do kultur in vitro
O przebiegu hodowli in vitro decyduje wybór materiału roślinnego. Czynniki ułatwiające otrzymanie pozytywnych efektów to:
wiek rośliny matecznej najłatwiej regenerują rośliny młode, w początkowych fazach ich rozwoju, z wiekiem eksplantatu zmniejsza się liczba komórek wykazujących toipotencję i tym samym maleje zdolność do efektywnej ich regeneracji w kulturach tkankowych
wybór organu do pobrania eksplantatu najlepsze są młode organy roślin, zawierające różnego rodzaju tkanki merystematyczne, charakteryzujące się dużą aktywnością podziałową,
pora roku, w okresie wiosennym obserwuje się zazwyczaj najwyższą wydajność regeneracyjną,
warunki wzrostu roślin matecznych: odpowiednie oświetlenie, temperatura i nawożenie zapewniające dużą żywotność eksplantatu.
Sterylizacja materiału roślinnego do kultur in vitro
Dużym problemem w zakładaniu hodowli in vitro jest pozyskanie sterylnego materiału wyjściowego. Problem ten nabiera szczególnego znaczenia w przypadku pobierania materiału roślinnego z dorosłych osobników w trakcie sezonu wegetacyjnego, jak ma to miejsce podczas pobierania pędów z koron dojrzałych drzew. Często również do kultur „w szkle” przeznaczane są rośliny bardzo cenne lub dostępne w niewielkich ilościach, w związku z tym o otrzymaniu kultury in vitro decyduje dokładne odkażanie fragmentu rośliny.
Materiał roślinny z którego zakładamy kulturę pochodzi z warunków niesterylnych. Po przeniesieniu eksplantatów z takich warunków wprost na pożywkę, doskonałe warunki wzrostu znajdują przede wszystkim, bakterie i grzyby i bardzo szybko się w nich rozwijają. Mikroorganizmy te, dominując w kulturze, wyczerpują składniki pokarmowe, a ponadto wydzielają do pożywki metabolity, toksyczne dla tkanki roślinnej.
W zależności od materiału do hodowli in vitro wybierane są różne warianty sterylizacji, na podstawie ustalonego schematu.
etap wstępny
przepłukiwanie materiału roślinnego bieżącą wodą,
moczenie w wodzie destylowanej z dodatkiem detergentu np. Tween 20 (1 kropla/100 ml) przez godzinę,
jednokrotne płukanie wodą destylowaną,
sterylizacja właściwa
płukanie 70-procentowym alkoholem etylowym przez 30-60 sekund,
jednokrotne płukanie wodą destylowaną,
sterylizacja, np. w 0,2-0,3-procentowym HgCl2 (AgNO3) przez 2-7 minut, a następnie
trzykrotne płukanie sterylną wodą destylowaną.
Do właściwego procesu odkażania używa się najczęściej roztworów chlorku rtęci (HgCl2), azotanu srebra (AgNO3), podchlorynu sodu, potasu lub wapnia (np. 20% ACE, Clorox, Domestos). Stężenie sterylizanta (najczęściej od promila do kilkudziesięciu procent) i czas traktowania (od kilkunastu sekund do kilku minut) zależą od zdrowotności materiału przeznaczonego do hodowli w kulturze in vitro.
Dla każdego rodzaju eksplantatu należy w sposób eksperymentalny dobrać optymalne warunki sterylizacji (rodzaj, stężenie i czas działania sterylizanta), które są kompromisem między maksymalną sterylnością a uszkodzeniem eksplantatów. Zwykle w celu zwiększenia skuteczności zabiegu przedłuża się czas sterylizacji właściwej, a nie podwyższa się stężenia sterylizanta.
W różnych laboratoriach ten sam rodzaj materiału może być sterylizowany w odmienny sposób, np. osie zarodkowe dębu Chmielarz [1996] odkażał w 0,1-procentowym chlorku rtęci przez 2,5 minuty, natomiast Tóth i inni [1994] 3,5procentowym podchlorynem sodu przez 24 minuty. Meier-Dinkel i inni [1993] na początku sterylizowali żołędzie 3,5-procentowym podchlorynem sodu przez 5 minut, później pokrywy były zdejmowane przez nich i całe zarodki ponownie odkażane w podchlorynie sodu, ale o mniejszym stężeniu - 0,5% przez 5 minut.
Niekiedy mikroorganizmy występujące na roślinach matecznych ogranicza się przez oprysk fungicydem na 5-10 dni przed pobraniem materiału [Favre i Juncker 1987, Hernandez i in. 2003]. Stosunkowo łatwe do sterylizacji są nasiona drzew iglastych. Pozytywne rezultaty uzyskuje się np. przy dezynfekcji niedojrzałych i dojrzałych nasion gatunków z rodzaju: Pinus, Picea, Abies, Larix, Pseudotsuga oraz nasion i fragmentów pędów drzew liściastych takich, jak: Quercus i Populus, stosując Ca(OCl)2, NaOCl lub, najczęściej, HgCl2.
Pożywki
Pożywki używane jako podłoże w kulturach in vitro dostarczają wyłożonemu na nią fragmentowi rośliny niezbędnych składników oraz tworzą warunki fizyczne umożliwiające dalszy rozwój. Oznaczone są symbolami literowymi, najczęściej pochodzącymi od nazwisk autorów. W kulturach roślinnych istnieje bardzo wiele rodzajów pożywek, jednak można wyodrębnić kilka uniwersalnych, używanych w składzie oryginalnym lub modyfikowanych.
W hodowlach in vitro drzew najczęściej stosuje się następujące pożywki:
B5 [Gamborg i in. 1968],
GD [Gresshoff i Doy, 1974],
MS [Murashige i Skoog, 1962],
NN [Nitsch i Nitsch, 1969],
WPM (Woody Plant Medium - Lloyd, McCown, [1981)]
Skład pożywek przedstawiono w tabeli 1.
Tabela 1.
Skład wybranych pożywek stosowanych w kulturach in vitro roślin drzewiastych
składnik |
MS |
B5 |
NN |
GD |
WPM |
|
makroelementy [mg ∙ l ‾¹] |
||||||
CaCl2 |
- |
- |
166 |
- |
72,5 |
|
CaCl2 2H2O |
440 |
150 |
- |
- |
- |
|
Ca(NO3)2 ∙ 4H2O |
- |
- |
- |
347 |
556 |
|
KCl |
- |
- |
- |
65 |
- |
|
KH2PO4 |
170 |
- |
68 |
300 |
170 |
|
KNO3 |
1900 |
2500 |
950 |
1000 |
- |
|
K2SO4 |
- |
- |
- |
- |
990 |
|
MgSO4 ∙ 7H20 |
370 |
250 |
185 |
17,1 |
180 |
|
NaH2PO4 ∙ H2O |
- |
150 |
- |
- |
- |
|
NH4NO3 |
1650 |
- |
720 |
1000 |
400 |
|
(NH4)2SO4 |
- |
134 |
- |
- |
- |
|
mikroelementy [mg ∙ l ‾¹] |
||||||
CoCl2 ∙ 6H2O |
0,025 |
0,025 |
- |
0,025 |
- |
|
CuSO4 ∙ 5H2O |
0,025 |
0,025 |
0,025 |
0,025 |
0,25 |
|
FeNaEDTA |
- |
- |
- |
- |
- |
|
FeSO4 ∙ 7H2O |
27,8 |
- |
27,8 |
- |
- |
|
H3BO3 |
6,2 |
3 |
10 |
0,3 |
6,2 |
|
KI |
0,83 |
0,75 |
- |
0,8 |
- |
|
MnSO4 ∙ 4H2O |
22,3 |
- |
25 |
- |
- |
|
MnSO4 ∙ H2O |
- |
10 |
- |
1 |
22,3 |
|
Na2EDTA ∙ 2H2O |
37,3 |
- |
37,3 |
- |
- |
|
Na2MoO4 ∙ 2H2O |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,025 |
0,25 |
|
ZnSO4 ∙ 7H2O |
8,6 |
2 |
10 |
0,3 |
8,6 |
|
związki organiczne [mg ∙ l ‾¹] |
||||||
Biotyna |
- |
- |
0,05 |
- |
- |
|
Glicyna |
2 |
- |
2 |
4 |
2 |
|
Kwas foliowy |
- |
- |
0,5 |
- |
- |
|
Kwas nikotynowy |
0,5 |
1 |
5 |
1 |
0,5 |
|
Myo-inozytol |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
|
Pirydoksyna HCl |
0,5 |
1 |
0,5 |
1 |
0,5 |
|
Tiamina HCl |
0,1 |
10 |
0,5 |
10 |
1 |
|
Składniki pożywek można podzielić ogólnie na substancje mineralne i organiczne. Do pierwszej grupy zalicza się makro- i mikroelementy, natomiast do drugiej głównie cukry, witaminy, aminokwasy oraz regulatory wzrostu i rozwoju. W zależności od ilości makroelementów i mikroelementów pożywki dzieli się na:
bogate - pełen zestaw makroelementów,
średnio-bogate - zawierają ok. ½ ilości makroelementów pożywki bogatej,
ubogie - przeważnie ok. ¼ stężenia makroelementów pożywki bogatej.
Po rozpuszczeniu wszystkich składników pożywki mierzy się pH i ustala na określonym poziomie, zwykle w granicach 5,2-5,8. Wartość pH wpływa na dostępność i pobieranie związków odżywczych i substancji regulujących, strukturę białek i enzymów. Ustalenie odczynu pożywki zależy od gatunku oraz rodzaju pożywki.
Kolejnym etapem jest sterylizacja pożywek. Przeprowadza się ją w autoklawie w temperaturze 121°C pod ciśnieniem 0,1MPa, przez 20 do 30 min. Wydłużanie czasu sterylizacji jest niewskazane, ponieważ wówczas następuje częściowy rozkład niektórych substancji organicznych zawartych w pożywce, głównie witamin, cukrów oraz regulatorów wzrostu. Z tego powodu związki termolabilne (wrażliwe na wysoką temperaturę) sterylizuje się przez filtry mikrobiologiczne, o średnicy porów 0,22 μm i dodaje do wysterylizowanej pożywki, gdy jej temperatura osiągnie 45-50°C.
Składniki pożywki z czasem są zużywane przez kultury, dlatego istnieje konieczność pasażowania, czyli przenoszenia eksplantatów na świeżą pożywkę zwykle co 2-6 tygodni.
Regulatory wzrostu
Efekty mikrorozmnażania roślin zależą od użycia odpowiednich hormonów (regulatorów) wzrostu i rozwoju. Każdy regulator ma szeroki zakres działania, zależny od stężenia oraz współdziałania z innymi substancjami endo- i egzogennymi. Znane jest pięć grup hormonów roślinnych: auksyny, cytokininy, gibereliny, kwas abscysynowy oraz etylen (tab. 2). W kulturach in vitro największą rolę odgrywają auksyny i cytokininy.
Auksyny stymulują wzrost wydłużeniowy komórek, tworzenie korzeni, pobudzają regenerację organów, hamują rozwój pąków bocznych. Jednakże najczęściej są wykorzystywane do indukcji embriogenezy somatycznej (2,4D oraz NAA) oraz do ukorzeniania pędów powstałych w wyniku organogenezy (IAA i NAA). Efekty stosowania auksyny zależą głównie od jej rodzaju oraz stężenia. Podczas prowadzenia hodowli tkankowych należy pamiętać, że stężenie auksyn w pożywce obniża się w wyniku autoklawowania oraz działania światła.
Cytokininy działają antagonistyczne do auksyn. W hodowlach „w szkle” wykorzystywane są do indukcji podziałów komórkowych, hamowania tworzenia korzeni i znoszenia dominacji wierzchołkowej, co umożliwia wyrastanie pąków bocznych. Znajomość wzajemnych relacji stężenia auksyn i cytokinin pozwala na precyzyjne sterowanie procesami rozwoju i wzrostu eksplantatów. Dla roślin drzewiastych najlepsze efekty rozkrzewiania uzyskuje się przy zastosowaniu BA. Zaobserwowano, że wraz ze zwiększeniem koncentracji cytokinin zwiększa się liczba nowych pędów produkowanych z pąków. Wysokie stężenie cytokinin (2-5 mg ∙ l ‾¹) powoduje witryfikację (komórki są nadmiernie uwodnione oraz zawierają zmniejszenie ilości chlorofilu) u dębów [Tóth i in. 1994]. Z tego powodu do pożywki, poza cytokininą, dodaje się małe ilości auksyn (0,01-0,05 mg ∙ l ‾¹ IBA lub NAA).
Poza auksynami i cytokininami, które odgrywają ważną rolę w organogenezie, w hodowlach „w szkle” do regulacji przebiegu embriogenezy somatycznej stosuje się kwas abscysynowy (ABA). ABA indukuje spoczynek pąków, nasion i hamuje wzrost. Podczas dojrzewania zarodki somatyczne poddawane są działaniu ABA, co sprzyja gromadzeniu przez nie substancji zapasowych, zapobiega powstawaniu zarodków zdeformowanych i przedwcześnie kiełkujących. Jego optymalna zawartość w pożywce zależy od linii komórkowej oraz genotypu. Dla świerka pospolitego wynosi 7-60 μM, ale dla każdego genotypu należy ją wyznaczać empirycznie [Latkowska 2002].
Tabela 2.
Regulatory wzrostu dodawane do pożywek in vitro
AUKSYNY |
Naturalne |
IAA - kwas indolilo-3-octowy IBA - kwas indolilo-3-masłowy |
|
Syntetyczne |
NAA - kwas naftylo-1-octowy -2,4D - kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy Dicamba Picloram |
CYTOKININY |
Naturalne |
Zeatyna* 2iP |
|
Syntetyczne |
BA - benzyloaminopuryna K - kinetyna TDZ - tidiazuron |
GIBERELINY |
GA3 kwas giberelinowy* |
|
INHIBITORY WZROSTU |
ABA kwas abscysynowy |
|
* termolabilne
Ukorzenianie i adaptacja do warunków in vivo
Adaptacja roślin rozmnażanych w warunkach in vitro do warunków szkółki jest najtrudniejszym etapem. Ukorzenianie mikrosadzonek uzyskanych podczas hodowli in vitro można prowadzić w warunkach sterylnych lub w podłożu niesterylnym w szklarni.
Ukorzenianie w warunkach sterylnych można prowadzić na tych samych pożywkach, na których prowadzi się mikrorozmnażanie, lecz zazwyczaj stosuje się połowę zawartości makroelementów. Ponadto pożywki uzupełnia się węglem aktywowanym, który korzystnie wpływa na proces ukorzeniania [Olszewska, 2000].
Po wysadzeniu roślin do podłoża ich procesy życiowe odbywają się głównie kosztem nagromadzonej skrobi. Roślina wytwarzając korzenie, zużywa zapasy skrobi, a jej przeżycie zależy od rozwoju liści, które zdolne będą do prowadzenia procesu fotosyntezy. Rozwój liści jest jednak hamowany przez auksyny nagromadzone w tkankach sadzonek. Wtedy właśnie z powodu wyczerpania się zapasów skrobi i niedoboru składników mineralnych ginie najwięcej ukorzenionych sadzonek [Regulatory wzrostu..., 1997]. Innym powodem obumierania roślin są zbyt małe wilgotność i temperatura. W tym celu zakłada się na rośliny foliowe osłonki ograniczające parowanie wody i naświetlenie. Osłonki te stopniowo się uchyla, aby po kilku lub kilkunastu dniach je usunąć. Problem ten bardzo ważny w przypadku mikroroślin powstałych przez organogenezę. Rośliny powstałe w wyniku embriogenezy somatycznej są bardzo silne. Większość z nich po etapie ukorzeniania ma zdrewniałą strzałkę, co ma wpływ na ograniczenie transpiracji, a zarazem wysoką udatność adaptacji [Hauke 2003]. Początkowo umieszcza się kasety z wysadzonymi sadzonkami w szklarni, zapewniając im wysoką wilgotność powietrza i odpowiednią temperaturę, a po pewnym czasie wystawia się do szkółki.
Możliwości zastosowania mikrorozmnażania
Korzyści z mikrorozmnażania roślin podkreśla się w licznych pracach poświęconych optymalizacji warunków regeneracji wielu gatunków roślin drzewiastych. Jedną z podstawowych zalet tej metody jest uzyskiwanie tysięcy roślin o niezmienionym genotypie. Wprowadzenie kultur in vitro do hodowli drzew daje możliwość uzyskania nieograniczonej liczby roślin, stanowiących klony pojedynczego wyselekcjonowanego osobnika, w znacznie krótszym czasie w stosunku do powszechnie stosowanych metod namnażania wegetatywnego. Ponadto istnieje możliwość mnożenia, wtedy gdy posiadamy niewielką ilość materiału matecznego. Z hodowlanego punktu widzenia istotne jest opracowanie skutecznych metod mikrorozmnażania drzew, których nasiona trudno się przechowują, np. dębu, lub które nieregularnie owocują np. buk zwyczajny [Rakowski i Szczygieł, 1999].
Kolejną zaletą rozmnażania drzew leśnych metodą kultur tkankowych jest możliwość krioprezerwacji w ciekłym azocie. W przypadku standartowych programów hodowlanych czas potrzebny do identyfikacji genotypu w próbach polowych jest długi, a drzewa stają się zbyt stare by rozmnażać je wegetatywnie. W konsekwencji elitarne genotypy są tracone, a mogą być wykorzystane jako drzewa rodzicielskie dopiero w kolejnej generacji. Jednakże, istnieje możliwość krioprezerwacji kultury embriogennej (embriogeneza somatyczna) z każdego dostępnego genotypu, a następnie, dla potrzeb programów genetycznych lub zalesień, elitarne genotypy mogą być rozmrażane i masowo namnażane. Tkanka embriogenna poddana krioprezerwacji nie zmienia swego genetycznego charakteru oraz nie traci juwenalności [Park i in. 1998], a dzięki temu można ją zastosować do ochrony roślinnych zasobów genowych. Kultury in vitro są rutynowo stosowane do zachowania genetycznej bioróżnorodności świata roślinnego. Przewiduje się ich znaczącą rolę w zachowaniu puli genowej roślin drzewiastych [Blakesley 1996].
Niewątpliwą zaletą embriogenezy somatycznej jako metody rozmnażania jest także możliwość produkcji sztucznych nasion (somatyczne zarodki otoczone sztuczną kapsułką zawierającą materiały odżywcze oraz regulatory wzrostu). Umożliwia to hodowlę roślin z unikalną kombinacją genów, która nie może być uzyskana na drodze embriogenezy zygotycznej z powodu genetycznej rekombinacji w każdym pokoleniu nasion. Tworzenie sztucznych nasion łączy korzyści, jakie daje rozmnażanie in vitro klonów ze stosunkowo niskimi kosztami oraz wysoką jakością produkowanych nasion, o dużej żywotności oraz znanym genotypie i fenotypie [Redenbaugh i in. 1986].
W procesie transformacji genomów roślinnych szczególnie pożądane są metody pozwalające na efektywną i szybką regenerację zmodyfikowanych roślin. Systemy regeneracji roślin oparte na metodzie embriogenezy somatycznej były podstawą wyprowadzenia roślin transgenicznych u Picea sitchensis [Sarma i in.1995], Pinus strobus L. [Levee i in. 1999], Picea glauca, P. mariana oraz P. abies [Klimaszewska i in. 2001].
Szczególnie ważnym zagadnieniem w wielu ośrodkach badawczych jest opracowanie warunków efektywnej indukcji struktur embriogenicznych na eksplantatach pochodzących z dojrzałych drzew, o pożądanych cechach fenotypowych. Prowadzone są intensywne badania nad zwiększeniem efektywności dojrzewania i kiełkowania roślin drzewiastych. Mikrorozmnażanie nie jest tylko przedmiotem badań naukowych, ale znajduje także zastosowanie w masowej reprodukcji roślin dla potrzeb leśnictwa, przemysłu drzewnego i papierniczego [Cyr i Klimaszewska 2002, Latkowska 2002].
„Nowe” drzewa wprowadzą leśnictwo w erę wysokiej produktywności i jakości.
Proszę dołączyć zdjęcia z pliku fotografie. Fotografie przedstawiają rośliny uzyskane przez mikrorożmnażanie, dlatego mogą być umieszczone w dowolnym miejscu w tekście (tak jak będzie pasowało przy przygotowaniu tekstu do druku).
Literatura
Blakesley D., Pask N., Henshaw G.G., Fay M.F. 1996. Biotechnology and cryopreservation of forest genetic resources: in vitro strategies and cryopreservation. Plant Growth Regul., 20,11-16.
Chmielarz P. 1996. Kriogeniczne przechowywanie zasobów genowych dębu szypułkowego (Quercus robur L.), sosny zwyczajnej (Pinus sylvestris L.) i świerka pospolitego (Picea abies (L.) Karst.). Praca doktorska wykonana w Zakładzie Biologii Nasion Instytutu Dendrologii PAN w Kórniku (maszynopis).
Cyr D.R., Klimaszewska K. 2002. Conifer somatic embryogenesis: II. Applications. Dendrobiology 48,41-49.
Favre J.M., Juncker B. 1987. In vitro growth of buds taken from seedlings and adult plant material in Quercus robur L. Plant Cell, Tiss. Org. Cult., 8,49-60.
Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. 1968. Nutrient Requirement of suspensions cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res., 50,151-158.
Gresshoff P.M., Doy C.H. 1974. Derivation of a haploid cell line from Vitis vinifera and the importance of the stage of meiotic development of anthers for haploid culture of this and other genera. Z. Pflanzenphysiol., 73,132-141.
Hauke M. 2003. Embriogeneza somatyczna wybranych gatunków drzew liściastych. Praca doktorska wykonana w Katedrze Hodowli Lasu Akademii Rolniczej w Poznaniu (maszynopis).
Hernandez I., Celestino C., Toribio M. 2003. Vegetative propagation of Quercus suber L. by somatic embryogenesis. I. Factors affecting the induction in leaves from mature cork oak trees. Plant Cell Rep., 21,759-764.
Klimaszewska K., Lachance D., Pelletier G., Lelu M.A., Seguin A. 2001. Regeneration of transgenic Picea glauca, P. mariana, and P. abies after cocultivation of embryogenic tissue with Agrobacterium tumefaciens. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant 37(6),748-755.
Latkowska M.J. 2002. Somatyczna embriogeneza roślin iglastych na przykładzie świerka pospolitego (Picea abies [L.] Karst.). Biotechnolgia, 4,
Levee V., Garin E., Klimaszewska K., Seguin A. 1999. Stable genetic transformation of white pine (Pinus strobus L.) after cocultivation of embryogenic tissues with Agrobacterium tumefaciens. Molecular Breed., 5(5),429-440.
Lloyd G., McCown B. 1981. Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture. Proc. Int. Plant Prop. Soc., 30,421-427.
Meier-Dinkel A., Becker B., Duckstein D. 1993. Micropropagation and „ex vitro” rooting of several clones of late-flushing Quercus robur L. Ann. Sci. For., 50(Sup.1),319-322.
Murashige T., Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tabacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15,473-497.
Nitsch J.P., Nitsch C. 1969. Haploid plants from pollen grains. Science 169: 85
Olszewska A. 2000. Mikrorozmnażanie i embriogeneza somatyczna dębu - Quercus sp. Praca doktorska wykonana w Katedrze Hodowli Lasu Akademii Rolniczej w Poznaniu (maszynopis).
Park Y.S., Barrett J.D., Bonga J.M. 1998. Application of somatic embryogenesis in high-value clonal forestry: deployment, genetic control, and stability of cryopreserved clones. In Vitro Cell. Dev. Biol. - Plant, 34(3),231-239.
Rakowski K., Szczygieł K. 1999. Potrzeby badawcze z zakresu fizjologii drzew leśnych. [W:] Materiały I Konferencji Leśnej. Stan i perspektywy badań z zakresu hodowli lasu. IBL, Sękocin Las, 18-19.05.1999. Warszawa, 186-193.
Redenbaugh K., Paasch B., Nichol J., Kossler M., Viss P., Walker K. 1986. Somatic seeds: Encapsulation of asexual embryos. Biotechnology, 4,797-801.
Regulatory wzrostu i rozwoju roślin 1997. Red. Jankiewicz L. PWN. Warszawa
Sarma K.S., Evans N.E., Selby C. 1995. Effect of carbenicillin and cefotaxime on somatic embryogenesis of Sitka spruce (Picea sitchensis (Bong.) Carr.). J. Exp. Bot., 46(292),1779-1781
Savill P.S., Kanowski P.J. 1993. Tree improvement programs for European oaks: goals and strategies. Ann. Sci. For., 50,368-383.
Tóth K., Haapala T., Hohtola A. 1994. Alleviation of browning in oak explants by chemical pretreatments. Biologia Plant., 36(4),511-51
1
10